Name: En direct limagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct du cerveau de Danio rerio par microscopie confocale à résolution cellulaire. Cette méthode permet d'étudier la morphogenèse cérébrale vertébrée avec une précision inégalée.

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Un grand merci à la Dre Jennifer Gutzman qui a le premier développé cette technique dans le laboratoire Sive. Merci aussi à JB vert au Boston Dana-Farber Cancer Institute, MA qui a aimablement fourni le plasmide codant pour la GFP CAAX-ARNm. L&#39;imagerie confocale a été réalisée à l&#39;installation de WM Keck Foundation Imaging biologique au Whitehead. SH est soutenue par NIHMH70926. EG est soutenu par une provision de pré-doctorat.

1. Préparation de l'ARNm pour injection <ol><li> L'ARNm utilisés dans cette procédure est transcrit à partir d'un plasmide codant pour CAAX-EGFP (memGFP) ARNm. D'abord linéariser le plasmide selon Gutzman et al, 2008. </li><li> Puis de transcrire l'ARNm memGFP utilisant le kit mMessage mMachine. </li><li> Diluer l'ARNm résultant d'1μg/μl, aliquote, et conserver à -80 ° C. </li><li> Préparer un moule d'injection de 1% d'agarose avec des voies de la largeur d'embryons au stade une cellule. </li><li> Le jour avant l'injection, mis en place des cages d'accouplement qui sépare le mâle de la femelle. </li><li> Le jour de l'injection, tirez aiguilles capillaires aide d'un extracteur micropipette pour se préparer à l'injection. </li></ol> 2. L'injection de l'ARNm <ol><li> Le jour de l'injection, le dégel d'une partie aliquote de l'ARNm memGFP 1μg/μl sur la glace. </li><li> Diluer l'ARNm 01h05 dans l'eau à une concentration finale de 200ng/μl, et de garder sur la glace. </li><li> Chargez l'aiguille capillaire avec 1 microlitre de l'ARNm memGFP préparé à 200ng/μl. </li><li> Placez chargés aiguille dans un micromanipulateur attaché à un microinjecteur alimentés au gaz. </li><li> Réglez le volume d'injection pour 1NL. </li><li> Tirez les diviseurs sur les poissons de type sauvage mis en place dans des cages d'accouplement de la journée précédente. </li><li> Recueillir les embryons dès qu'ils sont pondus. Orientez-les dans le moule d'injection d'agarose couverts par moyen d'embryons (Westerfield, 1995) avec la cellule unique sur le côté éloigné de la micromanipulateur. </li><li> Injecter dans le chorion et le jaune de telle sorte que l'ARNm est déposé directement dans la cellule unique. Injecter environ 50 embryons par expérience. Ne pas injecter si la cellule a divisé. </li><li> Embryons Incuber à 28 ° C pendant la nuit dans le milieu de l'embryon </li></ol> 3. Montage et embryons d'imagerie <ol><li> Pour monter l'image et les embryons, supprimer le chorion avec une pince à partir des embryons sous un stéréomicroscope, une heure avant le point de temps d'intérêt. </li><li> Préparer une diapositive pour le montage jusqu'à 4 embryons. <ul><li> Utilisez de la graisse à vide de silicone pour sceller une lamelle sur la partie inférieure d'une lame en plastique 2mm d'épaisseur spécialement conçu avec un trou d'environ 1cm de diamètre. </li><li> Remplissez le trou dans la diapositive avec 0,7% d'agarose, et laisser reposer environ 20 minutes ou jusqu'à durcis </li><li> Une fois que l'agarose solidifié, enlever un petit bouchon en utilisant 200 pl embouts de pipette pour former des trous cylindriques dans lesquels de monter chaque embryon. </li></ul></li><li> Placer les embryons sur la lame d'agarose-remplie sous un microscope à dissection. Ajouter 50 pl de tricaïne (Westerfield, 1995) pour anesthésier les embryons. </li><li> Utilisez une pince pour la position de l'embryon dans les trous cylindriques dans l'agarose avec le cerveau ou la région d'intérêt contre la lamelle sous-jacent. </li><li> Couvrir les embryons dans l'agarose avec une autre lamelle sécurisé avec de la graisse à vide de silicone. </li><li> Image de l'embryon en utilisant une inversion, fluorescent, balayage laser ou la filature de microscope confocal à disque. Image à 63x ou plus pour recueillir des images haute résolution des cellules individuelles au sein du neuroépithélium. </li><li> Les images sont exportées sous forme de fichiers TIFF à partir du logiciel LSM et analysées à l'aide de Photoshop. </li></ol> 4. Résultats Représentant / résultat Montre la figure 1 est une image représentative confocale d'un neuroépithélium 24 zebrafish HPF entre le mésencéphale et rhombencéphale ventricules. Chaque cellule est étiqueté avec membranaires GFP. <img src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" alt="" width="450" height="449"> Figure 1. En direct d'imagerie confocale d'un memGFP-injecté 24 embryons de poissons zèbres HPF. (A) d'un embryon neuroépithélium 24 HPF, chaque cellule étant définies par la GFP. Région imagé sépare le mésencéphale et rhombencéphale ventricules (M, H, respectivement), formant la limite du mésencéphale-rhombencéphale.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour l&#39;injection d&#39;ARNm dans les embryons de poissons zèbres seule cellule. Ici, nous utilisons ARNm codant pour la GFP membrane cible d&#39;étiqueter chaque cellule. Nous avons ensuite montrer comment monter et l&#39;image du cerveau en développement à la résolution seule cellule. Cette technique nous a permis d&#39;étudier un nouveau type de cellules changent de forme, la constriction basale, nécessaire à la formation de la frontière du mésencéphale-rhombencéphale ...

<table><tbody><tr><td>Agarose SeaKem GTG</td><td> Réactif</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>Éthyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tubes capillaires</td><td>Outil</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mmOD x 0,5 mm ID/fibre 100 mm</td></tr><tr><td>Graisse à vide en silicone</td><td>Réactif</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>Pincettes</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont n°5 Bio Inox</td></tr><tr><td>Pointes de pipette 1-200 &amp;mu;l</td><td>Outil</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>Ce sont les dimensions appropriées pour les embryons à 24 hpf.</td></tr><tr><td>Kit de transcription mMessage mMachine</td><td>Réactif</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Polymérase ARN SP6</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage Zeiss LSM 510</td><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Outil</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur</td><td>Outil</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Tireuse de micropipettes</td><td>Outil</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

en direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Dans cette vidéo, nous démontrons la méthode de notre laboratoire a développé pour analyser les changements de forme des cellules et des réarrangements nécessaire pour courber et plier le cerveau de poisson zèbre en développement (Gutzman et al, 2008). Une telle analyse permet une nouvelle compréhension de la biologie cellulaire sous-jacentes nécessaires au développement de la structure 3D du cerveau des vertébrés, et augmente considérablement notre capacité d&#39;étudier la morphogenèse du tube neural. Le cerveau de poisson zèbre embryonnaire est façonné à partir de 18 heures après fécondation (HPF) et les ventricules dans le neuroépithélium gonfler. Par 24 HPF, les étapes initiales de la morphogenèse du tube neural sont complets. En utilisant la méthode décrite ici, des embryons au stade une cellule sont injectés avec l&#39;ARNm codant la membrane-cible la protéine fluorescente verte (memGFP). Après l&#39;injection et l&#39;incubation, l&#39;embryon, maintenant entre 18 et 24 HPF, est monté sur le dos dans l&#39;agarose et imagée par microscopie confocale. Notamment, l&#39;embryon de poisson zèbre est transparent ce qui en fait un système idéal pour l&#39;imagerie de fluorescence. Bien que nos analyses ont porté sur la frontière du mésencéphale-rhombencéphale et le rhombencéphale, cette méthode pourrait être étendue à l&#39;analyse de toutes les régions du poisson-zèbre à une profondeur de 80-100 um.

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d&#39;analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l&#39;embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l&#39;image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Dans cette vidéo, nous présentons la méthode développée par notre laboratoire pour analyser les changements de forme et les réarrangements cellulaires nécessaires à la flexion et au repliement du...

Cette procédure commence par l'injection d'un embryon de poisson zèbre unicellulaire positionné dans un moule d'injection de manière à ce que la cellule soit orientée face opposée à l'appareil d'injection. Les embryons sont ensuite injectés avec de l'ARNm à l'aide d'une aiguille qui traverse le vitellus et pénètre dans la cellule. Le lendemain.Une lame de montage en plastique est remplie d'aros. Un embryon anesthésié est ensuite placé à l'envers dans un trou dans l'aros et observé par microscopie confocale. Bonjour, je suis Grabham du laboratoire de la Dre Hazel Sieve à l'Institut Whitehead pour la recherche biomédicale et du département de biologie du MIT.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'injection d'embryons de poisson zèbre au stade unicellulaire, suivie d'un examen en direct du cerveau par microscopie confocale. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette procédure pour étudier la morphogenèse du cerveau des vertébrés à la résolution unicellulaire. Commençons donc.L'ARNm utilisé dans cette procédure est transcrit à partir d'un plasmide codant pour la GFP membranaire C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A. Linéarisez d'abord le plasmide par digestion avec NotI, puis transc

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Biologie

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Imagerie du développement vasculaire cérébral chez le poisson zèbre larvaire est décrite. Techniques pour faciliter l'imagerie 3D et modifier le développement vasculaire cérébral en utilisant des traitements chimiques sont également fournis.

Imagerie et de reconstruction 3D de structures vasculaires cérébraux embryonnaires poisson zèbre

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

Ici, nous présentons une méthode de montage polyvalente qui permet l’imagerie à long terme en accéléré du développement postérieur du corps d’embryons de poisson-zèbre vivants sans perturber le développement normal.

Une méthode de montage polyvalent pour l&#39;imagerie à long terme du développement Zebrafish

L’imagerie in vivo est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents au développement du système nerveux. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow en temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement.

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Un protocole d’imagerie in vivo du cerveau entier de larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie à fluorescence tridimensionnelle est présenté ici. La procédure expérimentale comprend la préparation des échantillons, l’acquisition d’images et la visualisation.

In vivo Imagerie du cerveau entier de larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie à fluorescence tridimensionnelle

Nous faisons la démonstration d’une méthode qui tire parti de la microscopie confocale à balayage rapide pour effectuer une imagerie en direct des cellules microgliales dans le tectum optique du poisson-zèbre en développement, permettant ainsi l’analyse de la dynamique de ces cellules in vivo.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

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In vivo Imagerie confocale par fluorescence de l’activité neuronale induite par la stimulation sensorielle chez des larves de poisson-zèbre partiellement restreintes

Découvrez l'imagerie en direct du cerveau de Danio rerio par microscopie confocale à résolution cellulaire. Cette méthode permet d'étudier la morphogenèse cérébrale vertébrée avec une précision inégalée.

En direct l'imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

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