Injection Zebrafish ventricule cérébral

Cette procédure commence par le stade des embryons de poisson zèbre. Lorsque les embryons ont atteint le stade d'intérêt, retirez-les de la chorion. Ensuite, des trous sont créés dans une boîte revêtue d'aros à l'aide d'une pointe de pipette afin de fixer les embryons, puis les embryons sont placés délicatement dans les trous, la queue vers le bas.

Après le montage des embryons, un colorant fluorescent est soigneusement injecté dans l'espace ventriculaire de l'embryon à travers le cerveau postérieur. Après l'injection ventriculaire, les embryons sont observés au microscope et les données sont traitées à l'aide de Photoshop. Bonjour, je suis Jennifer Gutman du laboratoire du Dr Hazel Sieve à l'Institut Whitehead pour la recherche biomédicale au MIT à Cambridge, dans le Massachusetts.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'injection dans les ventricules cérébraux de poisson-zèbre. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la formation des ventricules cérébraux et la morphogenèse de l'épithélium neural chez le poisson-zèbre vivant. En raison de la nature transparente des embryons de poisson-zèbre, la caractérisation de la forme des ventricules cérébraux peut s'avérer difficile.

Cette technique constitue un moyen utile et simple de distinguer l'espace rempli de liquide des tissus environnants et de caractériser les embryons mutants qui pourraient présenter des anomalies dans la formation des ventricules cérébraux. Commençons donc. Pour préparer l'injection dans le ventricule cérébral du poisson zèbre, nous commençons par fabriquer les aiguilles d'injection.

Une aiguille polaire de l'instrument Sutter est utilisée pour tirer les aiguilles capillaires. L'aiguille capillaire est ensuite remplie d'un colorant fluorescent, comme le dextran rouge Texas. Ensuite, l'aiguille remplie est fixée sur un micromanipulateur intégré à un appareil de microinjection.

Coupez l'aiguille à la taille appropriée selon un angle. Pour créer une pointe biseautée, mesurez le volume des gouttes de l'aiguille et vérifiez qu'il se situe entre un et deux nanolitres par injection dans l'huile. Pour commencer cette étape de la procédure, les embryons doivent, selon Kimmel, être injectés 30 minutes avant le stade d'intérêt.

Par exemple, pour étudier les ventricules 24 heures après la féconditation, injecter les embryons 23 heures et demie après la féconditation. Placer l'embryon au stade d'intérêt sous le microscope stéréo, puis retirer soigneusement le chorion de l'embryon à l'aide de pinces. Ensuite, préparer un plat d'aros pour les embryons en utilisant un plat en plastique recouvert d'aros à 1 % ; percer des trous dans l'aros à l'aide d'une pipette plastique de 1 à 200 microlitres.

Retirez soigneusement les bouchons d'aros des trous à l'aide de pinces. Transférez l'embryon et le milieu embryonnaire dans la boîte de culture aros munie de trous. Ajoutez de la trica au milieu pour anesthésier l'embryon et en empêcher les mouvements.

Pendant l'expérience, placez délicatement l'embryon la queue vers le bas dans le trou et orientez-le de manière à ce que l'appareil d'injection se trouve du côté postérieur de l'embryon. Maintenant que l'embryon est placé et correctement orienté dans la boîte de Pétri, nous sommes prêts pour l'injection dans le ventricule cérébral. Commencez par régler le dispositif de micromanipulation afin que la pointe de l'aiguille se trouve dans le même champ de vision que l'embryon, en fort grossissement.

Insérez soigneusement l'aiguille à travers la fine plaque du toit du cerveau postérieur, juste en arrière du point d'articulation R zéro R un, sans toucher le tissu cérébral situé en dessous, puis injectez une quantité de colorant suffisante pour remplir complètement les ventricules. Plusieurs injections peuvent être nécessaires pour remplir entièrement les cavités ventriculaires, selon le stade de l'embryon. Une fois l'embryon injecté et prêt pour l'imagerie, on prépare une nouvelle boîte aros pour l'embryon.

À l'aide d'une boîte de culture neuve revêtue d'agarose à 1 %, percer des trous dans la boîte et retirer les bouchons. Transférer l'embryon dans la boîte et ajouter du trica pour anesthésier l'embryon et en empêcher les mouvements. Placer la queue de l'embryon injecté dans le ventricule dans le trou, en position pour une image dorsale.

L'embryon est désormais prêt à être observé. Prenez une image en utilisant la lumière transmise. Il est très important de ne pas déplacer l'embryon ni le microscope.

Ensuite, modifiez les paramètres du microscope et prenez une image avec la lumière fluorescente. Repositionnez l'embryon pour acquérir des images latérales en lumière transmise et en lumière fluorescente. Enregistrez toutes les images dans des fichiers pour le traitement d'images dans Photoshop.

Pour traiter les images dans Photoshop, ouvrez les images en lumière transmise et en lumière fluorescente du même embryon prises dans la même position. Assurez-vous que tous les paramètres sont identiques. Pour chaque image, glissez votre image fluorescente sur l’image en lumière transmise et alignez-les parfaitement en ayant sélectionné l’image fluorescente. Sélectionnez les réglages d’image, puis remplacez la couleur et changez l’arrière-plan noir en blanc.

Dans la fenêtre de remplacement de couleur, réglez le facteur de flou vers la droite jusqu'à ce que l'image fluorescente présente une couleur uniforme. Dans la fenêtre des calques, sélectionnez « Multiplier ». Pour visualiser les images superposées, l'image de votre espace ventriculaire doit correspondre exactement à l'image en lumière transmise.

Enregistrez ce fichier et répétez l'opération pour toute autre image. Si l'injection dans le ventricule est effectuée correctement, les images doivent présenter des bords nets sans diffusion du colorant, comme illustré ici sur ces images à 25 heures après la fécondation. Les embryons de type sauvage : le panneau A montre l'image en champ clair, le panneau B l'image en fluorescence et le panneau C l'image de superposition.

Une vue latérale de l’image superposée est présentée dans le panneau D. En revanche, si lors de l’injection dans le ventricule l’aiguille est insérée trop profondément, elle pénètre le tissu cérébral situé sous l’espace ventriculaire et provoque une injection incorrecte. Cela entraîne une coloration visible en dehors de l’espace ventriculaire et dans le vitellus, comme illustré ici. Le panneau E montre l’image en champ clair.

Le panneau F montre l'image fluorescente et le panneau G montre l'image superposée. Une vue latérale de l'image superposée est présentée dans le panneau H. Les flèches indiquent les régions où le colorant a dépassé l'espace des ventricules cérébraux. Dans cette vidéo, nous avons démontré comment injecter un colorant fluorescent dans les ventricules cérébraux de zebrafish en développement.

Cette méthode permet de visualiser l'espace des ventricules cérébraux par rapport à l'épithélium neuroépithélial environnant, et s'avère extrêmement utile pour déterminer la forme de l'espace ventriculaire ainsi que celle du tissu cérébral avoisinant. Cette technique nous permet de mieux comprendre le processus de formation des ventricules cérébraux et la morphogenèse cérébrale au fil du temps chez l'embryon vivant. Elle constitue un excellent outil pour l'étude des anomalies de formation des ventricules cérébraux, ainsi que pour la caractérisation initiale des mutants affectant la morphogenèse cérébrale.

Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.