Injection Zebrafish ventricule cérébral

Cette procédure commence par la mise en scène des embryons de poisson-zèbre. Lorsque les embryons ont atteint le stade d’intérêt, retirez-les du corion. Ensuite, des trous sont créés dans un plat recouvert d’aros avec une pointe de pipette pour monter les embryons et les embryons sont placés doucement dans les trous avec la queue vers le bas.

Une fois les embryons montés, une matrice fluorescente est soigneusement injectée dans l’espace ventricule de l’embryon à travers le cerveau postérieur. Après l’injection ventricale, les embryons sont imagés et les données sont traitées à l’aide de Photoshop. Bonjour, je suis Jennifer Gutman du laboratoire du Dr Hazel Sieve au Whitehead Institute for Biomedical Research du MIT à Cambridge, Massachusetts.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’injection du ventricule cérébral du poisson-zèbre. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la formation des ventricules cérébraux et la morphogenèse neuro-épithéliale chez les poissons-zèbres vivants. En raison de la nature des embryons de poisson-zèbre transparents, il peut être difficile de caractériser la forme du ventricule cérébral.

Cette technique est un moyen simple et utile de différencier l’espace rempli de liquide des tissus environnants et de caractériser les embryons mutants qui peuvent présenter des défauts de formation des ventricules cérébraux. Alors commençons. Pour se préparer à l’injection du ventricule cérébral du poisson-zèbre, nous commençons par fabriquer les aiguilles d’injection.

L’aiguille polaire d’un instrument Sutter est utilisée pour tirer les aiguilles capillaires. L’aiguille capillaire est ensuite remplie d’un colorant fluorescent, tel que la dextrine rouge du Texas. Ensuite, l’aiguille remplie est montée dans un micromanipulateur dans un appareil de micro-injection.

Coupez l’aiguille à la taille appropriée en biais. Pour créer une pointe biseautée, mesurez la taille de la goutte de l’aiguille et vérifiez qu’elle est comprise entre un et deux nanolitres par injection dans l’huile. Pour commencer cette étape de procédure, les embryons, selon Kimmel, doivent être injectés 30 minutes plus tôt que le stade d’intérêt.

Par exemple, pour étudier les ventricules 24 heures après la fécondation, injectez les embryons 23 heures et demie après la fécondation. L’embryon au stade d’intérêt est placé sous le stéréomicroscope et le corion est soigneusement retiré de l’embryon à l’aide de pinces. Ensuite, une boîte en plastique pour les embryons est fabriquée à l’aide d’une boîte en plastique recouverte de 1 % d’aros percer des trous dans l’aros avec une pointe de pipette en plastique de 200 microlitres.

Retirez délicatement les chevilles des trous à l’aide d’une pince. Transférez l’embryon et le milieu embryonnaire dans la boîte aros à trous. Ajoutez du trica au milieu pour anesthésier l’embryon et empêcher le mouvement.

Pendant l’expérience, placez doucement la queue de l’embryon dans le trou et orientez-la de manière à ce que l’appareil d’injection se trouve sur la face postérieure de l’embryon. Maintenant que l’embryon est placé et orienté correctement dans la boîte avenue, nous sommes prêts pour l’injection du ventricule cérébral. Tout d’abord, organisez la configuration de micro-manipulation de manière à ce que la pointe de l’aiguille soit dans le même champ de vision que l’embryon à haute puissance.

Placez soigneusement l’aiguille à travers la mince plaque de toit du cerveau postérieur juste en arrière du point charnière R zéro R un sans heurter le tissu cérébral en dessous, injectez juste assez de colorant pour remplir complètement les ventricules. Il peut falloir plusieurs injections pour remplir l’espace ventricule en fonction du stade de l’embryon. Lorsque l’embryon a été injecté et qu’il est prêt pour l’imagerie, une nouvelle boîte de conserve pour l’embryon est préparée.

À l’aide d’un plat propre enduit de 1 %aros, percez des trous dans le plat et retirez les bouchons. Transférez l’embryon dans la boîte et ajoutez des trica pour anesthésier l’embryon et empêcher le mouvement. Placez la queue de l’embryon injecté dans le trou en position pour une image dorsale.

L’embryon est maintenant prêt pour l’imagerie. Prenez une image en utilisant la lumière transmise. Il est très important de ne pas déplacer l’embryon ou le microscope.

Ensuite, modifiez les paramètres du microscope et prenez une image avec une lumière fluorescente. Repositionnez l’embryon pour prendre des images latérales à la fois en lumière transmise et en lumière fluorescente. Enregistrez toutes les images sous forme de fichiers pour le traitement d’images de Photoshop.

Pour traiter les images dans Photoshop, ouvrez les images en lumière transmise et en lumière fluorescente du même embryon pris dans la même position. Assurez-vous que tous les paramètres sont les mêmes Pour chaque image, faites glisser votre image fluorescente sur l’image en lumière transmise et alignez-les exactement avec l’image fluorescente sélectionnée. Sélectionnez les ajustements d’image, puis remplacez la couleur et remplacez l’arrière-plan noir par du blanc.

Dans la fenêtre de remplacement de couleur, ajustez le facteur de flou vers la droite jusqu’à ce que l’image fluorescente soit de couleur uniforme. Dans la fenêtre des couches, sélectionnez multiplier. Pour afficher les images de superposition, l’image de l’espace ventricule doit correspondre à l’image de la lumière transmise. Exactement.

Enregistrez ce fichier et répétez l’opération pour toutes les autres images. Si l’injection ventrale est effectuée correctement, les images doivent avoir des bords tranchants dans un colorant non diffus, comme le montrent ces images de 25 heures. Après la fécondation, le panneau A montre l’image en fond clair, le panneau B montre l’image fluorescente et le panneau C montre l’image de superposition.

Une vue latérale de l’image de superposition est présentée dans le panneau D.D’autre part, si lors de l’injection ventriculeuse, l’aiguille est insérée trop loin, elle pénètre dans le tissu cérébral sous l’espace ventricule et conduit à une injection incorrecte. Il en résulte un colorant visible à l’extérieur de l’espace ventricule et dans le vitellus, comme illustré ici. Le panneau E montre l’image en fond clair.

Le panneau F montre l’image fluorescente et le panneau G montre l’image superposée. Une vue latérale de l’image superposée est présentée dans le panneau H.Les flèches indiquent les régions où le colorant est allé au-delà de l’espace du ventricule cérébral. Dans cette vidéo, nous avons montré comment injecter un colorant fluorescent dans les ventricules cérébraux du poisson-zèbre en développement.

Cette méthode est utilisée pour visualiser l’espace du ventricule cérébral par rapport à l’épithélium neurologique environnant, et est extrêmement utile pour déterminer la forme de l’espace ventricule ainsi que la forme du tissu cérébral environnant. Cette technique nous permet de mieux comprendre le processus de formation des ventricules cérébraux et de morphogenèse cérébrale au fil du temps dans l’embryon vivant. C’est un excellent outil pour étudier les défauts de formation des ventricules cérébraux et pour la caractérisation initiale des mutants de la morphogenèse cérébrale.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.