Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Cette procédure commence par la culture de la souche d’appât dans un milieu contenant des acides aminés normaux dans la souche témoin SLAC et de la lysine et de l’arginine isotopiques lourdes. Des quantités égales des deux souches sont mélangées et lysées par broyage et des lysats bruts d’azote liquide, d’abord granulés par centrifugation, puis éliminés par liaison à des billes de sphéros. Le lysat cellulaire est ensuite lié aux billes d’IgG.

Les protéines liées aux billes d’IgG sont désignées par la protéase, le clivage et la précipitation. L’échantillon est maintenant prêt pour l’analyse par spectrométrie de masse. Bonjour, je m’appelle Jesse Chao et je travaille au Lone Lab du Département de biologie cellulaire environnementale de l’Institut des sciences de la vie de l’Université de la Colombie-Britannique.

Aujourd’hui, nous vous présentons une procédure d’analyse protéomique quantitative appelée silak. Combiné à la purification par affinité. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les complexes protéiques.

Alors commençons : dans cette procédure, la souche d’appât contient des acides aminés normaux tandis que la souche de contrôle SLAC contient un isotope lourd, de la lysine et de l’arginine. Pour commencer, cultivez d’abord un litre, chacune des souches d’appât et de contrôle séparément jusqu’à la valeur affichée sur votre écran. Ensuite, versez la culture dans des tubes à centrifuger Nalgene de 500 millilitres.

Équilibrer la charge dans les cellules à granulés à 2 580 RCF décanter le média et remettre le granulé en suspension. Avec 50 millilitres de D H2O froid tout en transférant les cellules à 50 millilitres, les tubes à centrifuger, centrifugent les tubes pour granuler les cellules à 3000 RCF. À ce stade, vous pouvez congeler la pastille à moins 80 degrés Celsius.

Il est important de ne pas oublier d’associer la culture de la souche témoin à la culture de la souche d’appât en une à une en fonction du poids des granulés secs. Remettre en suspension chaque pastille cellulaire dans 10 millilitres de tampon NP 40 avec un cocktail d’inhibiteur de protéase de un à 2000. Mélangez les deux cultures cellulaires en transvasant directement un tube dans l’autre.

Pour commencer à broyer les cellules, versez de l’azote liquide dans le mortier pré-refroidi et laissez-le s’évaporer complètement. Ensuite, ajoutez deux millilitres de cellules au mortier. Versez un peu d’azote liquide pour congeler les cellules.

Broyez les cellules jusqu’à ce qu’elles deviennent fines. Poudre. Répétez le processus jusqu’à ce que toutes les cellules soient broyées. Assurez-vous de ne pas laisser les cellules dégeler.

Ajouter de l’azote liquide si nécessaire. Ensuite, transférez la poudre dans un bécher glacé et décongelez à température ambiante. Lorsque les bords commencent à dégeler, ajoutez 20 millilitres de tampon NP 40 avec un à 200 PIC après décongélation.

Transférez le lysat brut dans des tubes Nalgene de 40 millilitres et faites-le tourner à 16 000 tr/min dans un rotor Sovos SA 600 pendant 30 minutes. Pendant ce temps, prenez 300 microlitres des deux billes B du SRO et lavez les billes dans 300 microlitres de tampon NP 40 trois fois. Ensuite, mettez les billes en suspension dans des tampons de 300 microlitres afin qu’elles soient dans une boue individuelle.

L’étape suivante consiste à pré-éliminer le lysat cellulaire. Pour ce faire, transférez d’abord le super natin dans un nouveau tube et ajoutez les deux perles B du Spheros. Incuber sur une plate-forme tournante dans une chambre froide pendant 30 minutes.

Pendant l’incubation, prélevez 300 microlitres de six billes d’IgG SRO et lavez les billes dans 300 microlitres de tampon NP 40 trois fois. Ensuite, mettez les billes en suspension dans des tampons de 300 microlitres afin qu’elles soient dans une boue individuelle. Après l’incubation, granulez les SRO.

Deux être des perles. Transférez le surnageant dans un nouveau tube. N’oubliez pas de conserver une aliquote du lysat cellulaire pour le western blot plus tard.

Ajoutez ensuite les billes IgG. Séparez le contenu en deux tubes pour une liaison plus efficace, incubez sur une plate-forme tournante dans une chambre froide pendant deux heures. Après l’incubation, recueillir les billes dans une colonne de chromatographie à quatre degrés Celsius.

Assurez-vous de conserver une aliquote de la faction non liée. Lavez les perles avec 10 millilitres. Tampon NP 40.

Ensuite, lavez les perles avec trois millilitres. Tampon TEVC. Encore une fois, n’oubliez pas de conserver une aliquote des perles.

Cela reflétera l’efficacité de la liaison pour éluer les billes. Tout d’abord, ajoutez cinq microlitres d’A-C-T-E-V à un millilitre de tampon TEVC. Ajoutez du tampon TEVC aux billes et mélangez.

Transférez le contenu dans deux tubes EINOR de 1,5 millilitre à partir d’un mélange plus efficace et incubez sur une plate-forme rotative dans une chambre froide pendant la nuit. Ensuite, faites tourner les billes et transférez l’éluat dans un tube frais de 1,5 millilitre. Lavez les billes avec 0,5 millilitre supplémentaire de tampon TEVC après le lavage.

Combinez les huit dans un tube. Vous devriez avoir 1,5 millilitre d’ELU huit au total. Conservez une aliquote du huit de TEV Elu pour précipiter.

Ajustez les aliquotes à 25 % TCA avec un TCA à cent pour cent. Pour ce faire, séparez le LU huit de 1,5 millilitre en deux tubes de 750 microlitres chacun. Ajoutez 250 microlitres de 100 % TCA dans le tube.

Votre solution devrait devenir laiteuse. Ensuite, placez-le sur de la glace pendant 30 minutes. Tourbillonner périodiquement le mélange après l’incubation.

Faites tourner à vitesse maximale dans la centrifugeuse de table dans une chambre froide pendant 30 minutes. Laver une fois avec 500 microlitres d’acétone glacée contenant 0,05 d’acide chlorhydrique normal. Ensuite, tournez pendant cinq minutes à vitesse maximale à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez une fois avec 500 microlitres de glacé, d’acétone et essorez pendant cinq minutes à une vitesse maximale de quatre degrés Celsius. Après l’essorage, retirez soigneusement l’acétone et la pastille sèche pour la coloration à l’argent. Remettez le granulé en suspension dans 50 microlitres d’une fois le tampon d’échantillon SDS.

Si vous envisagez d’utiliser la protéine précipitée pour une analyse basée sur la spectrométrie de masse, il est recommandé de précipiter à l’aide d’éthanol. Pour ce faire, ajoutez d’abord 20 microgrammes de glycogène, puis diluez cinq fois les échantillons avec de l’éthanol à cent pour cent et ajustez à 50 millimolaires de bicarbonate de sodium avec un stock de 2,5 molaires à pH 5,0. Mélangez la solution en inversant le tube.

Laissez reposer deux heures à température ambiante. Enfin, divisez le contenu en deux tubes einor. Granulez la protéine précipitée par centrifugation pendant 10 minutes à 12 000 GS à température ambiante.

L’aliquote conservée pendant la procédure de purification doit inclure le lysat cellulaire pré-éliminé, la fraction liée, la fraction non liée et la fraction éludée. Nous recommandons d’analyser la teneur en protéines des aliquotes ci-dessus par Western blot à l’aide de l’anticorps Antit TAP ou de la coloration à l’argent pour refléter l’efficacité de liaison et d’élution de l’expérience. Dans ce gel de coloration à l’argent purifié SCS deux tapotements à son interaction, les partenaires ont été visualisés et comparés à un témoin non étiqueté dans ce transfert Western.

Diverses factions prises lors de la purification de SCS two tap ont été analysées par Western blot à l’aide de l’anticorps Antit tap. Notez que SCS deux tap a migré à un poids moléculaire plus faible après le clivage de la protéase elucian par TEV, et qu’il n’y avait plus de S SCS two tap sur les billes IgG après l’élution. Cela a confirmé que la purification était très efficace.

Nous venons de vous montrer comment purifier des complexes protéiques par purification par affinité avec des billes d’IgG. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer de faire correspondre la souche de base et la souche témoin en poids de pelle sec avant de commencer la procédure de purification. Étant donné que LAC nous fournit des mesures impartiales et qualitatives des partenaires de liaison aux protéines, nous n’effectuons que la première étape de la purification du robinet pour minimiser la perte d’échantillons.

Si vous rencontrez des quantités importantes de liaisons non spécifiques, vous voudrez peut-être appliquer l’intégralité du protocole, qui se trouve dans le manuel du port de ressorts froids. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

Hé, allez, Mark. Ah, allez-y.