Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Cette procédure commence par la culture de la souche appât dans un milieu contenant des acides aminés normaux pour la souche témoin SLAC, ainsi que de la lysine et de l'arginine marquées par des isotopes lourds. Des quantités égales des deux souches sont mélangées puis lysées par broyage en présence d'azote liquide. Les lysats bruts sont d'abord pelletés par centrifugation, puis clarifiés par liaison à des billes sphéros. Le lysat cellulaire est ensuite lié à des billes IgG.

Les protéines liées aux billes IgG sont élutées par protéase, clivées et précipitées. L'échantillon est désormais prêt à être analysé par spectrométrie de masse. Bonjour, je suis Jesse Chao du laboratoire Lone du Département de biologie cellulaire et environnementale à l'Institut des sciences de la vie de l'Université de la Colombie-Britannique.

Aujourd'hui, nous vous présentons une procédure d'analyse protéomique quantitative appelée SILAC, combinée à la purification par affinité. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les complexes protéiques.

Commençons. Dans cette procédure, la souche appât contient des acides aminés normaux, tandis que la souche témoin SLAC contient des isotopes lourds de lysine et d'arginine. Pour commencer, faites d'abord croître séparément un litre de la souche appât et un litre de la souche témoin jusqu'à la valeur indiquée sur votre écran. Ensuite, versez la culture dans des tubes à centrifuger Nalgene de 500 millilitres.

Équilibrez la charge dans les cellules en pellet à 2 580 ×g, décantez le milieu et resuspendez le culot. Avec 50 millilitres d’eau distillée froide, tout en transférant les cellules vers des tubes de centrifugation de 50 millilitres, centrifugez les tubes pour former un culot cellulaire à 3 000 ×g. À ce stade, vous pouvez congeler le culot à −80 °C.

Il est important de penser à appairer la culture de la souche témoin à la culture de la souche appât selon un rapport un pour un en fonction du poids du culot sec. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 10 millilitres de tampon NP-40 contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases à une dilution de un sur 2000. Mélanger les deux cultures cellulaires en versant directement le contenu d'un tube dans l'autre.

Pour commencer le broyage des cellules, versez de l'azote liquide dans le mortier prérefroidi et laissez-le s'évaporer complètement. Ensuite, ajoutez deux millilitres de cellules dans le mortier. Versez de l'azote liquide pour congeler les cellules.

Broyez les cellules jusqu'à ce qu'elles deviennent une poudre fine. Répétez le processus jusqu'à ce que toutes les cellules soient broyées. Veillez à ne pas laisser les cellules dégeler.

Ajouter de l'azote liquide si nécessaire. Ensuite, transférer la poudre dans un bécher glacé et laisser décongeler à température ambiante. Lorsque les bords commencent à décongeler, ajouter 20 millilitres de tampon NP-40 contenant un inhibiteur de protéase PIC à une dilution de 1/200 après décongélation.

Transférez le lysat brut dans des tubes Nalgene de 40 millilitres et centrifugez à 16 000 tr/min dans un rotor Sovos SA 600 pendant 30 minutes. Pendant ce temps, prélevez 300 microlitres des billes SROs two B et lavez les billes trois fois avec 300 microlitres de tampon NP-40. Ensuite, resuspendez les billes dans 300 microlitres de tampon afin d'obtenir une suspension à ratio un pour un.

L'étape suivante consiste à pré-éliminer les impuretés du lysat cellulaire. Pour ce faire, transférez d'abord le surnageant dans un nouveau tube et ajoutez les billes Spheros two B. Incubez sur une plateforme rotative dans une chambre froide pendant 30 minutes.

Pendant l'incubation, prélevez 300 microlitres de SRO IgG six billes et lavez les billes trois fois dans 300 microlitres de tampon NP-40. Ensuite, resuspendez les billes dans 300 microlitres de tampon afin d'obtenir une suspension à un pour un. Après l'incubation, centrifugez les SRO pour former un culot.

Deux billes doivent être présentes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube. N'oubliez pas de conserver un aliquot du lysat cellulaire pour une analyse par immunotransfert ultérieurement.

Ensuite, ajoutez les billes IgG. Répartissez le contenu dans deux tubes pour une liaison plus efficace, puis incubez pendant deux heures sur une plateforme rotative dans une chambre froide. Après l'incubation, récupérez les billes dans une colonne de chromatographie à quatre degrés Celsius.

Veillez à conserver un aliquot de la fraction non liée. Lavez les billes avec 10 millilitres de tampon NP-40.

Ensuite, lavez les billes avec trois millilitres de tampon TEVC. Là encore, pensez à conserver un aliquot des billes.

Cela reflétera l'efficacité de la liaison permettant d'éluer les billes. Ajoutez d'abord cinq microlitres d'A-C-T-E-V à un millilitre de tampon TEVC. Ajoutez le tampon TEVC aux billes et mélangez.

Transférez le contenu dans deux tubes EINOR de 1,5 millilitre pour un mélange plus efficace et incubez toute la nuit sur une plateforme rotative dans une chambre froide. Ensuite, centrifugez pour faire tomber les billes et transférez l’éluat dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Lavez les billes avec 0,5 millilitre supplémentaire de tampon TEVC après le lavage.

Combinez les huit dans un seul tube. Vous devriez obtenir au total 1,5 millilitre d'ELU huit. Conservez un aliquot d'ELU TEV huit pour précipitation.

Ajuster les aliquotes à 25 % d'acide trichloroacétique (TCA) à l'aide d'un TCA à 100 %. Pour ce faire, séparer les 1,5 millilitre de LU huit en deux tubes de 750 microlitres chacun. Ajouter 250 microlitres de TCA à 100 % dans le tube.

Votre solution devrait devenir trouble. Ensuite, placez-la sur de la glace pendant 30 minutes. Vortexez périodiquement le mélange après l'incubation.

Faire centrifuger à vitesse maximale dans une centrifugeuse de table en chambre froide pendant 30 minutes. Laver une fois avec 500 microlitres d'acétone glacée contenant de l'acide chlorhydrique 0,05 N. Puis centrifuger pendant cinq minutes à vitesse maximale à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez une fois avec 500 microlitres d'acétone glacée et centrifugez pendant cinq minutes à vitesse maximale à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez soigneusement l'acétone et séchez le culot pour la coloration argent. Resuspendez le culot dans 50 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS à une concentration fois un.

Si vous prévoyez d'utiliser la protéine précipitée pour une analyse basée sur la spectrométrie de masse, il est recommandé de procéder à la précipitation à l'éthanol. Pour ce faire, ajoutez d'abord 20 microgrammes de glycogène, puis diluez les échantillons cinq fois avec de l'éthanol à cent pour cent et ajustez à 50 millimolaire de bicarbonate de sodium à l'aide d'une solution mère de 2,5 molaire à pH 5,0. Mélangez la solution en retournant le tube.

Laisser reposer deux heures à température ambiante. Enfin, répartir le contenu dans deux tubes Eppendorf. Récupérer la protéine précipitée en culot par centrifugation pendant 10 minutes à 12 000 ×g à température ambiante.

L'échantillon préservé pendant la procédure de purification doit inclure le lysat cellulaire pré-clarifié, la fraction liée, la fraction non liée et la fraction élutée. Nous recommandons d'analyser la teneur en protéines de ces échantillons par immunobuvardage à l'aide d'un anticorps anti-TAP ou par coloration argent afin d'évaluer l'efficacité du lien et de l'élution de l'expérience. Sur ce gel coloré par l'argent, deux protéines SCS-TAP purifiées ont été visualisées avec leurs partenaires d'interaction, puis comparées à un témoin non marqué dans cet immunobuvardage.

Diverses fractions prélevées lors de la purification de SCS two tap ont été analysées par immunotransfert en utilisant un anticorps anti-Tap. Remarquez que SCS two tap migre à un poids moléculaire inférieur après élution par clivage avec la protéase TEV, et qu'aucun SCS two tap n'est resté sur les billes IgG après élution. Ceci confirme que la purification était hautement efficace.

Nous venons de vous montrer comment purifier des complexes protéiques par purification d'affinité à l'aide de billes IgG. Lors de cette procédure, il est important de s'assurer de comparer la souche de base et la souche témoin selon le poids du culot sec avant de commencer la purification. Étant donné que LAC nous fournit des mesures non biaisées et appariées des partenaires de liaison protéique, nous réalisons uniquement la première étape de la purification TAP afin de minimiser la perte d'échantillon.

Si vous observez des quantités importantes de liaison non spécifique, vous pouvez souhaiter réaliser l'intégralité du protocole, disponible dans le manuel de Cold Spring Harbor. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

Hé, allez, Mark. Ah, vas-y.