Name: Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique haute résolution dans le muscle lisse d'organes isolés. Cette méthode permet d'étudier les effets des neurotransmetteurs sur la contraction musculaire en utilisant la microscopie confocale.

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Le Wellcome Trust a fourni un soutien financier (Prix VIP pour JSY et 074 128 bourses de recherche au KLB). Conseil de recherches médicales bourse d&#39;études au RJA Leica_SP2_Stacker, un algorithme utilisé pour importer TIFF pour «reconstruction» dans une série, est basé sur Leica_tiff_sequence, un plugin pour lire Leica TIFF SP2 dans ImageJ, développé par Tony Collins et utilisé avec sa permission. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg et TurboReg, les algorithmes utilisés pour corriger les mouvements des tissus, sont basées sur Th venaz et ses collègues (1998) 9. Excel_writer.jar a été écrit par Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, l&#39;algorithme de détection des particules, est basé sur un algorithme écrit par Brain KL et détaillés précédemment 5.

Partie 1: Préparation de l&#39;indicateur de Ca 2 + (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) <ol><li> Oregon Green 488 BAPTA-1 est livré dans les AM 500 flacons ul comme une petite quantité (50 g) de poudre. Ajouter 40 ul Pluronic F-127 solution à la poudre, en agitant doucement pendant 30 s, puis ajouter 460 ul PSS, et agiter doucement pendant 30 s. La solution finale, 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-une heures, fournit 4 x 125 aliquotes. Eviter l&#39;exposition à la lumière et conserver à -20 ° C. </li></ol> Partie 2: Ca 2 + de chargement <ol><li> Retirer l&#39;indicateur de Ca 2 + (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) du congélateur (-20 ° C) et laisser décongeler à température ambiante. </li><li> Prélever 1 ml de PSS dans une éprouvette et placer dans un bain-marie. Bubble avec 95% 2 / 5% CO 2 à un taux d&#39;environ 1 bulle apparaissant par seconde O. Le bulleur doit être garanti dans le tube à essai, par exemple avec un bouchon ou avec du parafilm. </li><li> Disséquer les tissus de l&#39;animal et, dans un plat Sylgard bordées de Petri, retirez soigneusement le tissu conjonctif. Indépendamment du type de muscle lisse d&#39;orgue, PSS doit être remplacée toutes les 10 minutes et les tissus doivent être bien lavés (par exemple en remplaçant les trois PSS fois) la dissection suivante. Pour le canal déférent: envisager de couper l&#39;organe longueur des façons de produire une feuille de tissu. Pour la vessie: ouvert longitudinalement du col de la vessie (postérieure) au sommet de la coupole (antérieure). Préparez quatre bandes, 6 - 8 mm de long et 1 - 2 mm de large, le long de la surface dorsale du détrusor, la coupe dans le sens des faisceaux musculaires dominante. </li><li> Placer le tissu disséqué dans le «pré-chauffée et buller&quot; PSS. </li><li> Ajouter 125 ul de 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 h à l&#39;éprouvette et de donner une petite secousse, à la main, à se mélanger. </li><li> Reprendre bouillonnant et des congés, recouverts d&#39;une feuille. Le temps est nécessaire pour un tissu suffisante pour relever le Ca 2 + indicateur varie avec la taille du tissu et de l&#39;épaisseur de la couche musculaire lisse. Par exemple: 70 minutes (souris détrusor, anococcygeus rat) à 120 minutes (détrusor chez le rat, la souris vas déférent). </li></ol> Partie 3: Préparation du &quot;Ca 2 + chargés &#39;de tissus pour la microscopie Attention épinglant des tissus est nécessaire afin de minimiser le mouvement spontané des tissus (une propriété de l&#39;imagerie des cellules musculaires lisses du tissu relativement intacte) et de faciliter la localisation d&#39;un site approprié pour l&#39;imagerie (comme un morceau plat de tissu peut être interrogés en deux dimensions, plutôt que trois). <ol><li> Rincez le tissu dans PSS buller pendant au moins 5 minutes. </li><li> Mont préparation dans un plat Sylgard-alignés, étirement des tissus (un peu) pour former une feuille plate. Évitez d&#39;utiliser des longues &quot;broches&quot; qui peuvent rayer l&#39;objectif, utiliser des longueurs courtes au lieu de 25-50 um de diamètre du fil d&#39;argent comme «broches» et d&#39;insérer à un angle. </li><li> Placez le plat de préparation sur la platine du microscope, en prenant soin de s&#39;assurer que le PSS ne s&#39;échappe pas de la zone de Sylgard-alignés de l&#39;antenne (comme cela peut conduire à une grande surface étant couverte de PSS, lorsque la surfusion commence). </li><li> Mettez la pompe en vue de la préparation avec superfuse PSS. Un taux de 100 ml par heure est souvent employé. </li><li> Allumez l&#39;unité de chauffage. </li><li> Placer les tubes entrées et de sorties et de la sonde de température sur le plat de préparation (apposition chacun à la bande de métal par l&#39;aimant sur sa base). La hauteur de la pointe du tube d&#39;écoulement va déterminer la profondeur de la PSS. Soyez attentif à ce que la sortie est en fait enlever PSS (comme il le fait parfois pas initialement). </li><li> Réglez la température sur l&#39;unité de chauffage pour atteindre la température désirée, par exemple de 33 à 35 C. </li><li> Autoriser le tissu à s&#39;équilibrer pendant au moins 10 minutes. </li></ol> Partie 4: Choix du site à l&#39;image L&#39;exposition à l&#39;éclairage d&#39;excitation sera photobleach l&#39;indicateur, afin d&#39;éviter en utilisant plus de quelques secondes à la fois. <ol><li> Avec un objectif de faible puissance (10x ou 20x) utilisent épifluorescence, excitant avec une lumière bleue, pour voir les muscles lisses et d&#39;identifier une région appropriée pour surveiller. Essayez de choisir un site basé sur: le mouvement (qui devrait être minime) et le nombre de cellules musculaires lisses dans le domaine. «Structures» lumineux peuvent provoquer un nombre élevé de «faux positifs» dans l&#39;algorithme de détection d&#39;images, afin d&#39;éviter les sites avec un grand nombre de (ex) entrecoupées cellules épithéliales ou des fibroblastes. </li><li> Basculer vers un objectif de puissance plus élevée (40x). </li><li> Tourner la scène ou de l&#39;axe optique afin de la cellule musculaire lisse (s) se trouve horizontale (c&#39;est à dire parallèle à l&#39;axe de balayage rapide). </li></ol> Partie 5: La microscopie confocale Les détails de la façon dont le microscope confocal est &quot;mis en place» sont spécifiques à chaque type de microscope, maisles principales considérations sont les suivantes: vitesse (minimum de 5 Hz est requis pour la plupart de Ca 2 + transitoires), la résolution et la taille du terrain (qui sont tous deux négociés-off avec la vitesse). Certains le protocole suivant est spécifique à un Leica SP2 microscope confocal debout. Un protocole typique est le suivant: série 100 châssis, acquise à 5 Hz (256 x 256 pixels; environ 100 x 100 um.) Ou 13,5 Hz (256 x 64 pixels; environ 100 x 25 um.). La tête de balayage mis à déplacer bi-directionnelle (pour maximiser la vitesse d&#39;acquisition) et d&#39;acquérir à 1000 Hz par ligne. <ol><li> Fermer le sténopé à un «disque d&#39;Airy. </li><li> Réglez le laser (488 nm) de puissance entre 25 et 35% sur la AOTF; cette valeur est un compromis entre luminosité et photoblanchiment. (Ce dernier étant un problème particulier lors de longs enregistrements.) </li><li> L&#39;acquisition de six séries par site, et de quatre à six sites par «traitement». Il est commun de viser à surveiller les six mêmes sites pré-drogue («contrôle» par exemple) et post-drogue, bien photoblanchiment importantes peut causer l&#39;expérimentateur de s&#39;écarter de cette. </li><li> Il est essentiel de Ca 2 + imagerie que «les contrôles de temps&quot; sont effectuées. </li></ol> Partie 6: Préparation pour l&#39;analyse <ol><li> Téléchargez et installez Image J à partir de: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Télécharger la version spécifique à la plateforme, puis mise à jour de la dernière version en téléchargeant le dernier fichier à partir imageJ.jar http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, remplacer l&#39;ancien fichier. Utilisateurs d&#39;Apple Mac: si elle tourne lentement, assurez-vous d&#39;utiliser la dernière version de la machine virtuelle Java (JVM) disponibles auprès d&#39;Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Télécharger Excel_writer.jar à partir de: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html et installer dans les plugins [répertoire] répertoire jar&gt;. </li><li> Copiez les fichiers suivants dans le répertoire plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installez chacun de ces scripts en utilisant les plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Installer ... en fonction de ImageJ. </li><li> Nous utilisons un Leica SP2 microscope confocal, le logiciel (Leica LCS) pour ce qui génère chaque série comme un seul visible «film» dans le logiciel, mais enregistre en tant que cadres individuels. Pour reconstituer les cadres en série: (i) Assurez-vous que tous les «cadres» pour être reconstruits sont dans un seul dossier (par exemple «DataFolder&gt; Tiffs &#39;). (Ii) Sélectionnez Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Leica_SP2_Stacker. Sélectionnez le répertoire racine (par exemple «DataFolder &#39;). Sélectionnez le dossier désiré dans la liste déroulante (&#39;Tiffs /&#39; par exemple). Sélectionnez un répertoire de sortie ou de générer un nouveau («DataFolder&gt; Stacks», par exemple). Le script va ensuite reconstruire la série d&#39;images individuelles. </li></ol> Partie 7: Correction pour le mouvement Bien que le mouvement du site imagées peuvent être minimisés par une bonne épinglage et tissus uniformément tendu, certains organes des muscles lisses présentent des contractions spontanées qui ne peuvent être abolis par une surveillance attentive épinglant seul. Nous décrivons ici l&#39;utilisation d&#39;un algorithme librement disponible qui aligne les cadres ou des allumettes dans une série. <ol><li> Télécharger &#39;StackReg »(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) et« TurboReg »(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Installez chaque dans le répertoire plugins en utilisant les plugins&gt; Macros&gt; Installer ... </li><li> Chargez une pile à traiter (Fichier&gt; Ouvrir ...) et ensuite passer à un cadre qui montre clairement le champ d&#39;intérêt. Les autres images seront alignées à ce cadre de référence. </li><li> Plugins&gt; Piles&gt; StackReg. Essayez chacune des différentes «transformations» (Traduction c&#39;est-à-corps rigide, Rotation Scaled, Affine) afin de déterminer quelle est la plus efficace. (Plus de détails: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Partie 8: algorithme de détection de particules Pour chaque «site» imagées, les facteurs qui affectent varier la détection de Ca 2 + transitoires. En mesurant certaines propriétés de chaque site («paramètres des particules - détaillées ci-dessous), le processus de détection est facilitée. Ainsi, pour chaque site, on calcule «seuil pour soustraire», «le seuil pour le ratio&quot; et &quot;seuil de bord de cellule». <ol><li> Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Installer ... et sélectionner &#39;JNCT0.08Release.ijm ». </li><li> Plugins [Menu]&gt; Macros pile de charge&gt; (raccourci: l). Sélectionnez une série de paramètres et de calculer des particules: <ol style="list-style:none;"><li> a. Seuil pour soustraire (fond =) </li></ol></li><li> Sélectionner un ROI rectangulaire sur ce que vous croyez être «de fond». </li><li> Mesure (raccourci: M). Notez MOYENNE. <ol style="list-style:none;"><li> b. Calcul du seuil pour le ratio </li></ol></li><li> Sélectionnez une forme rectangulaireROI autour d&#39;une zone optiquement plane de la cellule (s). </li><li> Mesure (raccourci: M). Remarque ÉCART bas moyenne et standard. </li><li> Répéter encore deux fois ou vous pouvez dessiner trois boîtes à la fois en appuyant sur &#39;shift&#39;. </li><li> Calculez et notez le seuil pour le ratio = (1 + SD / moyenne) x 32, avec une moyenne des valeurs de la trois répétitions / sites. <ol style="list-style:none"><li> C. Seuil de bord cellulaire </li></ol></li><li> Image&gt; Stacks&gt; Z projet ... Choisissez le type de projection: «intensité moyenne&quot; </li><li> Image&gt; Réglages&gt; Seuil. </li><li> Sélectionnez noir et blanc. </li><li> Définir &#39;sous&#39; (curseur supérieur) limiter et noter la valeur correspondante (à droite du curseur). Seuls les événements survenant dans les régions noires seront comptés. </li><li> Cliquez sur &#39;reset&#39;. </li><li> Analyser les piles (raccourci: 2) </li><li> Sélectionnez simplement une série à ce stade, à savoir le «premier fichier» et «le dernier fichier&quot; devrait être le même. </li><li> Entrez les valeurs de «seuil de soustraire», «le seuil pour le ratio&quot; et &quot;seuil de bord de cellule». Laissez les autres paramètres à leurs valeurs par défaut. </li><li> L&#39;algorithme va produire une fenêtre à double volet, dans lequel la série traitée est indiqué sur la gauche et l&#39;original sur la droite. Soigneusement passer par ce afin d&#39;évaluer le nombre de faux positifs et les occasions où les événements, visibles à l&#39;œil, n&#39;ont pas été détectés. Pour obtenir une détection plus précise de Ca 2 + transitoires, il peut être nécessaire d&#39;ajuster légèrement certains des &#39;paramètres des particules ». Bien que le processus peut sembler un peu «à l&#39;aveuglette» sur la première tentative, on obtient rapidement une sensation de ce que les paramètres sont essentiels. </li><li> Pour chaque série, l&#39;algorithme génère un fichier Excel que les caractéristiques des détails sur l&#39;événement détecté (comme l&#39;amplitude, la superficie et position). «Faux positifs» - identifié en examinant les fichiers image que les sorties algorithme (par exemple 8,17 étape) - peuvent être retirés, à la main, à partir de ce fichier Excel. </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

Des efforts ont été faits pour minimiser le nombre d&#39;animaux utilisés et de leurs souffrances, toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les animaux au Royaume-Uni (Scientific Procedures) Act 1986 et la directive du Conseil des Communautés européennes 86/09/EEC.

Choix de fluorescence de Ca 2 + indicateur de Oregon Green 488 BAPTA-1 AM a été choisi comme le Ca 2 + indicateur parce qu&#39;il (i) est lumineux par rapport à d&#39;autres indicateurs (par exemple, Fluo-4 et Green calcium) 1, (ii) est sensible à des changements physiologiques dans concentration de Ca2 + avec un Kd d&#39;une ampleur similaire à l&#39;une intracellulaire de Ca 2 + concentration [Ca 2 +] i (par exemple des canaux déférents 2), (iii) les charges de nombreuses cellules musculaires lisses, cellules musculaires lisses permettant couplage à être surveillés. Toutefois, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM est un non-ratioable Ca 2 + indicateur, et en tant que tels ne peuvent pas facilement être utilisés pour déterminer l&#39;absolu [Ca 2 +] i. Par ailleurs, il peut également tampon de Ca 2 + s&#39;ils sont présents à des concentrations élevées et devient saturé avec des changements de grande amplitude dans [Ca 2 +] i. L&#39;inhibition de la contractilité spontanée La contractilité spontanée des organes musculaires lisses peut être réduite pharmacologiquement, par exemple en bloquant le déplacement de Ca 2 + par le biais de type L canaux Ca 2 + (par exemple: la nifédipine 3; diltiazem 4). Notez que ces médicaments permettra de réduire considérablement l&#39;amplitude de la cellule entière de Ca 2 + flashs / transitoires. La contraction du canal déférent résulte d&#39;une combinaison de la neurotransmission surtout purinergiques et noradrénergiques. Focale de Ca 2 + transitoires dans ce tissu sont, cependant, insensible aux blocage des récepteurs noradrénergiques (par exemple α 1 adrénergiques, par la prazosine 5) afin circulation peut être réduit sans affecter focale Ca 2 + transitoires. Alternativement, la contraction peut être empêché «en aval» par l&#39;inhibition de la lumière par exemple la chaîne de myosine kinase par wortmannine 6. Conclusions Surveillance de Ca 2 + de fluorescence à résolution submicronique est une technique puissante pour étudier les effets de post-jonctionnelle libération des neurotransmetteurs 5,7 et la libération de Ca 2 + dans les magasins internes (par exemple «étincelles» 8). L&#39;analyse de Ca 2 + transitoires en utilisant la méthodologie décrite ici est rentable par rapport aux paquets disponibles dans le commerce d&#39;analyse d&#39;image et permet l&#39;analyse sur-mesure grâce à des plugins Java personnalisé écrit pour ImageJ.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>solution de Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>solution à 20 % dans le DMSO</td></tr><tr><td>Microscope confocal droit Leica SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table anti-vibrations (&amp;#8216;poste de travail isolé des vibrations&amp;rsquo;)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>élastomère Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ca focale 2 + détection de transitoires dans le muscle lisse

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca 2 + imagerie des cellules musculaires lisses permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires qui peuvent ne pas entraîner des modifications du potentiel de membrane, comme la libération de Ca 2 + dans les magasins internes, et permet de multiples cellules d&#39;être surveillés simultanément afin d&#39;évaluer, par exemple, de couplage en tissus syncytial. Subcellulaire Ca 2 + transitoires sont fréquentes dans le muscle lisse, mais sont difficiles à mesurer avec précision en raison des problèmes causés par leur occurrence stochastiques, sur un champ souvent de vue large, dans un organe qui le prédispose à se contracter. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une série de protocoles d&#39;imagerie et des routines d&#39;analyse d&#39;acquérir, puis d&#39;analyser, de façon automatisée, la fréquence, la localisation et l&#39;amplitude de ces événements. Bien que cette approche peut être appliquée dans d&#39;autres contextes, notre propre travail implique la détection des locaux purinergiques Ca 2 + transitoires pour localiser la libération du transmetteur avec une résolution inférieure au micron. ATP est libéré comme un cotransmitter de nerfs autonomes, où il se lie à des récepteurs P2X1 sur le muscle lisse du détrusor et le canal déférent. Ca 2 + entre dans le muscle lisse, résultant en purinergiques neuroeffecteurs Ca 2 + transitoires (NSTI). La focale de Ca 2 + transitoires permettent le suivi optique de la libération du neurotransmetteur d&#39;une manière qui a de nombreux avantages sur l&#39;électrophysiologie. En dehors de la résolution spatiale améliorée grandement, enregistrement optique a l&#39;avantage supplémentaire de permettre l&#39;enregistrement de la libération du transmetteur de nombreux sites distincts simultanément. Par ailleurs, le plan optique de focalisation est plus facile de maintenir ou de corriger lors de la série enregistrement long que ce qui est le repositionnement d&#39;une microélectrode intracellulaire forte. En résumé, une méthode pour l&#39;imagerie de Ca 2 + fluorescence est décrite qui détaille la préparation des tissus, et l&#39;acquisition et l&#39;analyse des données. Nous décrivons l&#39;utilisation de plusieurs scripts pour l&#39;analyse de ces Ca 2 + transitoires.

Détails des méthodes à haute résolution Ca<sup&gt; 2 +</supImagerie&gt; des muscles lisses au sein des organes isolés, notamment: la préparation des tissus, d&#39;acquisition d&#39;images et l&#39;analyse des données.

Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

L'imagerie du Ca2+ dans le muscle lisse permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires qui peuvent ne pas entraîner de modifications du potentiel de membrane, tels que la libération de Ca2+...

Tout d'abord, une solution de chargement au calcium est préparée, réchauffée et saturée en gaz. La vessie urinaire est disséquée, ouverte, épinglée à plat, puis un fragment de détrusor est prélevé. Le fragment de détrusor est ajouté à la solution de chargement, incubé puis rincé, avant d'être épinglé à plat.Le plancher de calcium quatre dans le tissu est excité par une lumière laser et la lumière émise est capturée en conséquence. Des films composés d'images individuelles sont analysés en comparant des images successives. Le fond est soustrait.Le seuil de bordure cellulaire détermine où les événements peuvent être détectés, et un rapport entre cerveaux successifs est calculé. Si les événements restants correspondent à des critères prédéfinis, ils sont mis en évidence et étiquetés. Bonjour, je m'appelle John Young des laboratoires de Keith Brain et Tom Kinane au Département de pharmacologie, université d'Oxford.Je suis Rob Amos, également des laboratoires Brain et Canne, et je suis Keith Brain. Aujourd'hui, John et Rob vont vous montrer une technique d'imagerie calcique dans le muscle lisse. Nous utilisons cette méthode dans notre laboratoire pour étudier la libération de neurotransmetteurs par les nerfs autonomes et son effet sur le muscle lisse.Commençons. L'indicateur calcique organ green, 4 88 BAFTA 1:00 AM, est fourni en flacons de 500 microlitres contenant 50 microgrammes de poudre. Pour préparer l'indicateur calcique, ajoutez 40 microlitres de solution Onic F1 27 à la poudre et agitez doucement pendant 30 secondes, puis ajoutez 460 microlitres de solution saline physiologique (PSS) et agitez à nouveau doucement pendant 30 secondes.La solution finale, 10 micromolaires d'organ green. 4 88 BAFTA 1:00 AM fournit quatre aliquotes de 125 microlitres chacune. Évitez l'exposition à la lumière et conservez la solution à moins 20 degrés Celsius avant de disséquer le tissu d'intérêt.Retirer l'indicateur de calcium du congélateur et le faire décongeler à température ambiante pendant que l'indicateur de calcium est fin. Placer un millilitre de PSS dans un tube à essai et dans un bain-marie à 33 degrés Celsius. Fixer un diffuseur dans le tube à essai à l'aide d'un bouchon, ou vous pouvez également utiliser du perfil, puis faire barboter avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone à un débit d'environ une bulle apparaissant par seconde.Dissez l'organe musculaire lisse de l'animal. Dans ce cas, il s'agit de la vessie urinaire d'une souris. Placez l'organe dans environ 50 millimètres de PSS pour le laver ; après avoir soigneusement lavé le tissu, retirez le tissu adipeux cieros et le tissu conjonctif.Disséquer selon le type lissulaire urétéral pour la vessie urinaire. Ouvrir longitudinalement depuis le col de la vessie, de l'extrémité caudale jusqu'au sommet du dôme. À l'extrémité crânienne, préparer quatre bandes de six à huit millimètres de longueur et d'un à deux millimètres de largeur, le long de la surface dorsale du resser, en coupant dans le sens des faisceaux musculaires dominants.Placer le tissu disséqué ainsi que le PSS préchauffé et saturé en gaz pour charger l'indicateur calcique avec 125 microlitres d'organ green à 10 micromolaire, 4 88 B à 1:00 du matin dans le tissu contenu dans le tube à essai, puis secouer légèrement à la main pour bien mélanger. Replacer le tube dans le bain-marie. Reprendre la saturation en gaz et couvrir le bain-marie avec une feuille de papier d'aluminium.Le temps nécessaire à une prise en charge suffisante du marqueur calcique par le tissu varie en fonction de la taille du tissu et de l'épaisseur de la couche musculaire lisse. Par exemple, pour le détrusor de souris et les oxs de rat, cela prend 70 minutes. En revanche, pour le détrusor de rat et les VAs deens de souris, nous incubons pendant 120 minutes.Une fois que le tissu a été chargé avec l'indicateur calcique, il peut être préparé pour la microscopie. Rincez d'abord le tissu dans du PSS saturé pendant 10 minutes. Ensuite, montez le tissu dans une cuve de préparation doublée de S guard.L'étirer légèrement pour former une feuille plate. Piquer le tissu à l'aide de morceaux courts, par exemple deux millimètres de fil d'argent de 25 à 50 micromètres de diamètre, et insérer les épingles en biais.Évitez d'utiliser des épingles dont la longueur dépasse quelques millimètres, car elles pourraient rayer l'objectif. Un piquage soigneux du tissu est essentiel pour minimiser les mouvements spontanés du tissu et faciliter la localisation d'un site approprié pour l'imagerie. Une fois le tissu épinglé, placez le plat de préparation sur la platine du microscope.Veillez à ce que le PSS ne s'échappe pas de la zone du plat bordée par la sil. En effet, cela pourrait entraîner une large surface recouverte de PSS. Lorsque la superfusion commencera à des fins de démonstration, les étapes suivantes seront effectuées à la lumière.Veuillez noter que ces expériences sont généralement réalisées dans l'obscurité. Mettez en marche la pompe afin de super-fuser le prélèvement. Avec du PSS, un débit de 100 millilitres par heure est souvent utilisé.Activez l'unité de chauffage, placez les tubes d'entrée et de sortie ainsi que la sonde de température sur la cuve de préparation en les fixant à la bande métallique à l'aide de l'aimant situé à leur base. La hauteur de l'extrémité du tube de sortie déterminera la profondeur de la PSS. Veillez attentivement à ce que le tube de sortie évacue effectivement la PSS, car cela ne se produit parfois pas.Régler initialement la température du bloc chauffant pour atteindre la température souhaitée comprise entre 33 et 35 degrés Celsius. Laisser le tissu s'équilibrer pendant au moins 10 minutes avec un objectif de faible puissance. 10 ou 20 fois.Utilisez la fluorescence en épifluorescence ou excitez avec une lumière bleue pour visualiser le muscle lisse et identifier une région appropriée à surveiller. L'exposition à l'illumination d'excitation entraîne le photoblanchiment de l'indicateur. Évitez de l'utiliser pendant plus de quelques secondes à la fois.Évitez les zones présentant des structures brillantes, car elles peuvent provoquer un grand nombre de faux positifs dans l'algorithme de détection d'image. Essayez de choisir un site avec un mouvement minimal et un grand nombre de cellules musculaires lisses dans le champ. Une fois que vous avez sélectionné le site à imager, passez à un objectif de plus fort grossissement, comme 40 x.Faites pivoter la platine ou l'axe optique de manière à ce que la cellule ou les cellules musculaires lisses soient orientées horizontalement, c'est-à-dire parallèlement à l'axe de balayage rapide. Les cellules musculaires lisses sont désormais prêtes à être observées par microscopie confocale.Dans ce protocole, nous utilisons un microscope confocal droit Leica SP deux. Fermez le diaphragme à un disque d'Airy. Réglez la puissance du laser entre 25 et 35 % sur le filtre optique réglable custo.Cette valeur représente un compromis entre luminosité et photodégradation. Pour préparer l'analyse des données, téléchargez et installez ImageJ. Téléchargez la version adaptée à votre plateforme, puis mettez à jour vers la dernière version en téléchargeant le dernier fichier jar d'ImageJ pour remplacer l'ancien fichier. Ensuite, téléchargez le fichier jar Excel Writer et installez-le dans le répertoire des greffons jar.Copiez ces fichiers dans le répertoire des greffons. Installez chacun de ces scripts à l’aide des macros de greffons. Installez la fonction d’Image J. Le logiciel pour le microscope confocal Leica SP deux que nous utilisons s’appelle Leica.LCS enregistre les images individuelles de chaque série sous forme de fichiers séparés. Pour reconstruire la série, assurez-vous que toutes les images à reconstruire se trouvent dans un seul dossier.Par exemple, le dossier de données tiffs. Ensuite, sélectionnez la macro Leica SP two stacker dans le menu plugins macros. Sélectionnez le répertoire racine, dans ce cas le dossier de données.Sélectionnez le dossier souhaité dans la liste déroulante. Dans ce cas, tiffs sélectionnez un répertoire de sortie ou créez-en un nouveau. Par exemple, le dossier de données stacks.Le script reconstruira ensuite les séries à partir des images individuelles afin de corriger les mouvements. Nous utilisons un algorithme librement disponible qui aligne ou apparie les images au sein d'une pile de téléchargements, rig et turbo reg. Copiez les fichiers correspondants dans le dossier stacks.Chargez une pile à traiter, puis passez à une image qui montre clairement le champ d'intérêt. Les autres images seront alignées sur cette image de référence. Ensuite, accédez aux greffons piles.Superposez les rég. Essayez chacune des différentes transformations pour déterminer celle qui est la plus efficace pour chaque site. Les facteurs d'imagerie affectant la détection des transitoires calciques varieront selon certaines propriétés mesurées, ainsi que selon les paramètres particulaires de chaque site.La sensibilité et la spécificité de la détection sont augmentées. Ainsi, pour chaque site, nous allons calculer le seuil soustrait au seuil du rapport et le seuil du bord cellulaire. Pour commencer, allez dans plugins, macros, installez et sélectionnez jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Ensuite, allez dans plugins macros charger la pile.Sélectionnez une série et calculez les paramètres de particule suivants. Pour calculer le seuil de soustraction, sélectionnez une région rectangulaire d'intérêt sur ce que vous considérez comme la mesure du fond. Notez la moyenne. Pour calculer le seuil de rapport, sélectionnez une région rectangulaire d'intérêt autour d'une zone optiquement plane de la cellule ou des cellules musculaires lisses.Relevez la moyenne et l'écart type. Répétez le processus deux fois supplémentaires, ou vous pouvez dessiner trois zones simultanément en appuyant sur Maj. Calculez et notez le seuil pour le rapport.Calculer en divisant l'écart type par la moyenne, ajouter un, puis multiplier le résultat par 32. En faisant la moyenne des valeurs provenant des trois réplicats, le facteur 32 est nécessaire pour tenir compte de l'algorithme de rapport, où aucune variation par rapport à l'image précédente est associée à une valeur entière de 32. Cela confère une bonne plage dynamique pour détecter les augmentations et les diminutions du rapport.Pour une image sur huit bits, sélectionnez l'option de seuil dans le menu ajuster l'image. Choisissez noir et blanc. Définissez la limite supérieure à l’aide du curseur et notez la valeur correspondante.Ceci se trouve à droite du curseur. Seuls les événements survenant dans les zones noires seront comptabilisés. Cliquez sur réinitialiser.Maintenant que le seuil de soustraction du seuil de rapport et le seuil de bord de cellule ont été calculés, nous pouvons analyser les séries d'images. Déterminez l'emplacement des séries à analyser. Sélectionnez une seule série à ce stade.C'est le premier fichier, et le dernier fichier doit être identique. Ensuite, sélectionnez un emplacement pour la sortie des fichiers de données et des piles. Par exemple, le dossier de sortie des données.Saisissez les valeurs du seuil pour soustraire le seuil du rapport et du seuil de contour des cellules. Conservez les autres paramètres à leurs valeurs par défaut. L'algorithme produira une fenêtre à deux volets dans laquelle la série traitée est affichée à gauche et l'originale à droite.Ouvrez ce fichier à partir du dossier de sortie et examinez-le attentivement pour évaluer le nombre de faux positifs ainsi que les cas où des événements visibles à l'œil nu n'ont pas été détectés. Pour chaque série, l'algorithme produit un fichier Excel qui détaille les caractéristiques des événements détectés, tels que l'amplitude, la surface et la position. Les faux positifs identifiés lors de l'examen des fichiers image générés par l'algorithme peuvent être supprimés manuellement de ce fichier Excel, bien que vous deviez appliquer des critères stricts pour le faire.Ceci est un film de la transitoire calcique dans le muscle lisse. Dans cet exemple, le film est composé de 100 images individuelles acquises à cinq hertz. Nous acquérons de nombreux de ces films par expérience lors de l'étude, par exemple, de l'effet d'un médicament particulier sur la fréquence du transitoire calcique.Ici, nous observons de nombreux transitoires spontanés de calcium dans les cellules musculaires lisses. Le résultat de l'algorithme de détection des particules est montré ici. Pour chaque série, l'algorithme produit un fichier Excel qui détaille les caractéristiques de l'événement détecté, telles que l'amplitude, la surface et la position.Nous avons donc démontré une méthode d'imagerie des transitoires calciques dans les organes musculaires lisses tels que la vessie urinaire, ainsi qu'une méthode d'analyse de ces transitoires calciques à l'aide d'un algorithme que nous avons mis au point en laboratoire. Les points importants à retenir sont de préparer soigneusement le tissu pour l'imagerie calcique. Dans le cas du tissu que nous avons présenté aujourd'hui, cela consiste à éliminer le tissu conjonctif et toute graisse susceptible d'obstruer le champ d'observation.Il est également important d'épingler le tissu en une feuille plate. Eh bien, bonne chance avec vos expériences et merci d'avoir regardé.

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