Ca focale ^{2 +} Détection de transitoires dans le muscle lisse

Tout d'abord, une solution de chargement au calcium est préparée, réchauffée et saturée en gaz. La vessie urinaire est disséquée, ouverte, épinglée à plat, puis un fragment de détrusor est prélevé. Le fragment de détrusor est ajouté à la solution de chargement, incubé puis rincé, avant d'être épinglé à plat.

Le plancher de calcium quatre dans le tissu est excité par une lumière laser et la lumière émise est capturée en conséquence. Des films composés d'images individuelles sont analysés en comparant des images successives. Le fond est soustrait.

Le seuil de bordure cellulaire détermine où les événements peuvent être détectés, et un rapport entre cerveaux successifs est calculé. Si les événements restants correspondent à des critères prédéfinis, ils sont mis en évidence et étiquetés. Bonjour, je m'appelle John Young des laboratoires de Keith Brain et Tom Kinane au Département de pharmacologie, université d'Oxford.

Je suis Rob Amos, également des laboratoires Brain et Canne, et je suis Keith Brain. Aujourd'hui, John et Rob vont vous montrer une technique d'imagerie calcique dans le muscle lisse. Nous utilisons cette méthode dans notre laboratoire pour étudier la libération de neurotransmetteurs par les nerfs autonomes et son effet sur le muscle lisse.

Commençons. L'indicateur calcique organ green, 4 88 BAFTA 1:00 AM, est fourni en flacons de 500 microlitres contenant 50 microgrammes de poudre. Pour préparer l'indicateur calcique, ajoutez 40 microlitres de solution Onic F1 27 à la poudre et agitez doucement pendant 30 secondes, puis ajoutez 460 microlitres de solution saline physiologique (PSS) et agitez à nouveau doucement pendant 30 secondes.

La solution finale, 10 micromolaires d'organ green. 4 88 BAFTA 1:00 AM fournit quatre aliquotes de 125 microlitres chacune. Évitez l'exposition à la lumière et conservez la solution à moins 20 degrés Celsius avant de disséquer le tissu d'intérêt.

Retirer l'indicateur de calcium du congélateur et le faire décongeler à température ambiante pendant que l'indicateur de calcium est fin. Placer un millilitre de PSS dans un tube à essai et dans un bain-marie à 33 degrés Celsius. Fixer un diffuseur dans le tube à essai à l'aide d'un bouchon, ou vous pouvez également utiliser du perfil, puis faire barboter avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone à un débit d'environ une bulle apparaissant par seconde.

Dissez l'organe musculaire lisse de l'animal. Dans ce cas, il s'agit de la vessie urinaire d'une souris. Placez l'organe dans environ 50 millimètres de PSS pour le laver ; après avoir soigneusement lavé le tissu, retirez le tissu adipeux cieros et le tissu conjonctif.

Disséquer selon le type lissulaire urétéral pour la vessie urinaire. Ouvrir longitudinalement depuis le col de la vessie, de l'extrémité caudale jusqu'au sommet du dôme. À l'extrémité crânienne, préparer quatre bandes de six à huit millimètres de longueur et d'un à deux millimètres de largeur, le long de la surface dorsale du resser, en coupant dans le sens des faisceaux musculaires dominants.

Placer le tissu disséqué ainsi que le PSS préchauffé et saturé en gaz pour charger l'indicateur calcique avec 125 microlitres d'organ green à 10 micromolaire, 4 88 B à 1:00 du matin dans le tissu contenu dans le tube à essai, puis secouer légèrement à la main pour bien mélanger. Replacer le tube dans le bain-marie. Reprendre la saturation en gaz et couvrir le bain-marie avec une feuille de papier d'aluminium.

Le temps nécessaire à une prise en charge suffisante du marqueur calcique par le tissu varie en fonction de la taille du tissu et de l'épaisseur de la couche musculaire lisse. Par exemple, pour le détrusor de souris et les oxs de rat, cela prend 70 minutes. En revanche, pour le détrusor de rat et les VAs deens de souris, nous incubons pendant 120 minutes.

Une fois que le tissu a été chargé avec l'indicateur calcique, il peut être préparé pour la microscopie. Rincez d'abord le tissu dans du PSS saturé pendant 10 minutes. Ensuite, montez le tissu dans une cuve de préparation doublée de S guard.

L'étirer légèrement pour former une feuille plate. Piquer le tissu à l'aide de morceaux courts, par exemple deux millimètres de fil d'argent de 25 à 50 micromètres de diamètre, et insérer les épingles en biais.

Évitez d'utiliser des épingles dont la longueur dépasse quelques millimètres, car elles pourraient rayer l'objectif. Un piquage soigneux du tissu est essentiel pour minimiser les mouvements spontanés du tissu et faciliter la localisation d'un site approprié pour l'imagerie. Une fois le tissu épinglé, placez le plat de préparation sur la platine du microscope.

Veillez à ce que le PSS ne s'échappe pas de la zone du plat bordée par la sil. En effet, cela pourrait entraîner une large surface recouverte de PSS. Lorsque la superfusion commencera à des fins de démonstration, les étapes suivantes seront effectuées à la lumière.

Veuillez noter que ces expériences sont généralement réalisées dans l'obscurité. Mettez en marche la pompe afin de super-fuser le prélèvement. Avec du PSS, un débit de 100 millilitres par heure est souvent utilisé.

Activez l'unité de chauffage, placez les tubes d'entrée et de sortie ainsi que la sonde de température sur la cuve de préparation en les fixant à la bande métallique à l'aide de l'aimant situé à leur base. La hauteur de l'extrémité du tube de sortie déterminera la profondeur de la PSS. Veillez attentivement à ce que le tube de sortie évacue effectivement la PSS, car cela ne se produit parfois pas.

Régler initialement la température du bloc chauffant pour atteindre la température souhaitée comprise entre 33 et 35 degrés Celsius. Laisser le tissu s'équilibrer pendant au moins 10 minutes avec un objectif de faible puissance. 10 ou 20 fois.

Utilisez la fluorescence en épifluorescence ou excitez avec une lumière bleue pour visualiser le muscle lisse et identifier une région appropriée à surveiller. L'exposition à l'illumination d'excitation entraîne le photoblanchiment de l'indicateur. Évitez de l'utiliser pendant plus de quelques secondes à la fois.

Évitez les zones présentant des structures brillantes, car elles peuvent provoquer un grand nombre de faux positifs dans l'algorithme de détection d'image. Essayez de choisir un site avec un mouvement minimal et un grand nombre de cellules musculaires lisses dans le champ. Une fois que vous avez sélectionné le site à imager, passez à un objectif de plus fort grossissement, comme 40 x.

Faites pivoter la platine ou l'axe optique de manière à ce que la cellule ou les cellules musculaires lisses soient orientées horizontalement, c'est-à-dire parallèlement à l'axe de balayage rapide. Les cellules musculaires lisses sont désormais prêtes à être observées par microscopie confocale.

Dans ce protocole, nous utilisons un microscope confocal droit Leica SP deux. Fermez le diaphragme à un disque d'Airy. Réglez la puissance du laser entre 25 et 35 % sur le filtre optique réglable custo.

Cette valeur représente un compromis entre luminosité et photodégradation. Pour préparer l'analyse des données, téléchargez et installez ImageJ. Téléchargez la version adaptée à votre plateforme, puis mettez à jour vers la dernière version en téléchargeant le dernier fichier jar d'ImageJ pour remplacer l'ancien fichier. Ensuite, téléchargez le fichier jar Excel Writer et installez-le dans le répertoire des greffons jar.

Copiez ces fichiers dans le répertoire des greffons. Installez chacun de ces scripts à l’aide des macros de greffons. Installez la fonction d’Image J. Le logiciel pour le microscope confocal Leica SP deux que nous utilisons s’appelle Leica.

LCS enregistre les images individuelles de chaque série sous forme de fichiers séparés. Pour reconstruire la série, assurez-vous que toutes les images à reconstruire se trouvent dans un seul dossier.

Par exemple, le dossier de données tiffs. Ensuite, sélectionnez la macro Leica SP two stacker dans le menu plugins macros. Sélectionnez le répertoire racine, dans ce cas le dossier de données.

Sélectionnez le dossier souhaité dans la liste déroulante. Dans ce cas, tiffs sélectionnez un répertoire de sortie ou créez-en un nouveau. Par exemple, le dossier de données stacks.

Le script reconstruira ensuite les séries à partir des images individuelles afin de corriger les mouvements. Nous utilisons un algorithme librement disponible qui aligne ou apparie les images au sein d'une pile de téléchargements, rig et turbo reg. Copiez les fichiers correspondants dans le dossier stacks.

Chargez une pile à traiter, puis passez à une image qui montre clairement le champ d'intérêt. Les autres images seront alignées sur cette image de référence. Ensuite, accédez aux greffons piles.

Superposez les rég. Essayez chacune des différentes transformations pour déterminer celle qui est la plus efficace pour chaque site. Les facteurs d'imagerie affectant la détection des transitoires calciques varieront selon certaines propriétés mesurées, ainsi que selon les paramètres particulaires de chaque site.

La sensibilité et la spécificité de la détection sont augmentées. Ainsi, pour chaque site, nous allons calculer le seuil soustrait au seuil du rapport et le seuil du bord cellulaire. Pour commencer, allez dans plugins, macros, installez et sélectionnez jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Ensuite, allez dans plugins macros charger la pile.

Sélectionnez une série et calculez les paramètres de particule suivants. Pour calculer le seuil de soustraction, sélectionnez une région rectangulaire d'intérêt sur ce que vous considérez comme la mesure du fond. Notez la moyenne. Pour calculer le seuil de rapport, sélectionnez une région rectangulaire d'intérêt autour d'une zone optiquement plane de la cellule ou des cellules musculaires lisses.

Relevez la moyenne et l'écart type. Répétez le processus deux fois supplémentaires, ou vous pouvez dessiner trois zones simultanément en appuyant sur Maj. Calculez et notez le seuil pour le rapport.

Calculer en divisant l'écart type par la moyenne, ajouter un, puis multiplier le résultat par 32. En faisant la moyenne des valeurs provenant des trois réplicats, le facteur 32 est nécessaire pour tenir compte de l'algorithme de rapport, où aucune variation par rapport à l'image précédente est associée à une valeur entière de 32. Cela confère une bonne plage dynamique pour détecter les augmentations et les diminutions du rapport.

Pour une image sur huit bits, sélectionnez l'option de seuil dans le menu ajuster l'image. Choisissez noir et blanc. Définissez la limite supérieure à l’aide du curseur et notez la valeur correspondante.

Ceci se trouve à droite du curseur. Seuls les événements survenant dans les zones noires seront comptabilisés. Cliquez sur réinitialiser.

Maintenant que le seuil de soustraction du seuil de rapport et le seuil de bord de cellule ont été calculés, nous pouvons analyser les séries d'images. Déterminez l'emplacement des séries à analyser. Sélectionnez une seule série à ce stade.

C'est le premier fichier, et le dernier fichier doit être identique. Ensuite, sélectionnez un emplacement pour la sortie des fichiers de données et des piles. Par exemple, le dossier de sortie des données.

Saisissez les valeurs du seuil pour soustraire le seuil du rapport et du seuil de contour des cellules. Conservez les autres paramètres à leurs valeurs par défaut. L'algorithme produira une fenêtre à deux volets dans laquelle la série traitée est affichée à gauche et l'originale à droite.

Ouvrez ce fichier à partir du dossier de sortie et examinez-le attentivement pour évaluer le nombre de faux positifs ainsi que les cas où des événements visibles à l'œil nu n'ont pas été détectés. Pour chaque série, l'algorithme produit un fichier Excel qui détaille les caractéristiques des événements détectés, tels que l'amplitude, la surface et la position. Les faux positifs identifiés lors de l'examen des fichiers image générés par l'algorithme peuvent être supprimés manuellement de ce fichier Excel, bien que vous deviez appliquer des critères stricts pour le faire.

Ceci est un film de la transitoire calcique dans le muscle lisse. Dans cet exemple, le film est composé de 100 images individuelles acquises à cinq hertz. Nous acquérons de nombreux de ces films par expérience lors de l'étude, par exemple, de l'effet d'un médicament particulier sur la fréquence du transitoire calcique.

Ici, nous observons de nombreux transitoires spontanés de calcium dans les cellules musculaires lisses. Le résultat de l'algorithme de détection des particules est montré ici. Pour chaque série, l'algorithme produit un fichier Excel qui détaille les caractéristiques de l'événement détecté, telles que l'amplitude, la surface et la position.

Nous avons donc démontré une méthode d'imagerie des transitoires calciques dans les organes musculaires lisses tels que la vessie urinaire, ainsi qu'une méthode d'analyse de ces transitoires calciques à l'aide d'un algorithme que nous avons mis au point en laboratoire. Les points importants à retenir sont de préparer soigneusement le tissu pour l'imagerie calcique. Dans le cas du tissu que nous avons présenté aujourd'hui, cela consiste à éliminer le tissu conjonctif et toute graisse susceptible d'obstruer le champ d'observation.

Il est également important d'épingler le tissu en une feuille plate. Eh bien, bonne chance avec vos expériences et merci d'avoir regardé.