Objectif transplantation chez le poisson zèbre et son application dans l'analyse de mutants Eye

Pour commencer la greffe de cristallin chez le poisson zèbre, des donneurs transgéniques exprimant la GFP et des hôtes récipients sauvages sont d'abord incubés pendant 30 minutes dans des boîtes de Pétri séparées contenant une solution de Ringer pour poisson zèbre sans calcium. Les larves de poisson sont ensuite incluses dans deux lignes parallèles dans de l'agarose à point de fusion basse. Une ligne A est destinée aux donneurs et l'autre B aux hôtes. L'œil entier est prélevé du donneur, tandis que seul le cristallin est retiré de l'hôte.

Les tissus entourant la lentille donneur sont retirés avant de placer la lentille dans l'œil hôte. Après la transplantation, les poissons sont stockés dans des plaques étiquetées de 24 puits. La lentille transplantée doit présenter une fluorescence GFP dans l'hôte.

Évidemment, l’œil controlatéral de l’hôte n’a pas été opéré et n’exprime pas la GFP. Bonjour, je suis Yj. Et moi, c’est Kaya McCullough, et nous travaillons dans le laboratoire du Dr Yma Maki, au Département d’ophtalmologie de la Harvard Medical School. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de transplantation de cristallin chez le poisson zèbre de type sauvage Daniel Rio.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour transplanter des lentilles d'animaux de type sauvage vers des animaux mutants et vice versa. Cela nous permet de déterminer si les gènes mutants fonctionnent de manière autonome ou non autonome dans la lentille. Commençons donc.

Les souches de poisson zèbre sont maintenues dans des conditions standard d'élevage à 28,5 degrés C, selon un cycle de 14 heures de lumière et 10 heures d'obscurité. La veille de l'expérience prévue, placer les mâles et les femelles dans un aquarium muni d'une cloison afin de les séparer les uns des autres. Le génotype de ces poissons doit produire une descendance exprimant la GFP ainsi que toute mutation d'intérêt. Parallèlement, utiliser la même procédure pour mettre en place des croisements entre des animaux sauvages non transgéniques dans l'heure qui suit.

Une fois que la lumière s'allume le matin, retirez les séparateurs pour permettre aux poissons de se reproduire. Après 15 à 30 minutes, versez l'eau de l'aquarium dans un tamis afin de récupérer les embryons, puis rincez-les à l'aide d'un jet d'eau pour œufs provenant d'une bouteille lavette dans une boîte de Pétri de 100 par 15 millimètres. Ensuite, nettoyez les œufs en pipetant et en éliminant les œufs non fécondés ainsi que tous les débris.

Remplacez l'ancienne eau d'œufs par de l'eau d'œufs fraîche. Les embryons peuvent être conservés dans un incubateur à 28,5 degrés C avant la transplantation du cristallin. Lorsque vous êtes prêt à procéder à la transplantation, préparez les embryons en retirant manuellement le chorion.

À l’aide d’une sonde métallique et d’une paire de forceps, les embryons décapés doivent maintenant être incubés dans du ZFR sans calcium contenant 0,2 % d’EDTA pendant 30 minutes. Pendant l’incubation, on peut préparer les aiguilles nécessaires à la dissection. La procédure de transplantation nécessite une aiguille effilée pour couper les tissus entourant le cristallin et les embryons Woolies à partir d’agros.

Il nécessite également une aiguille émoussée pour déplacer le cristallin donneur et l’insérer dans l’hôte, afin de réaliser soit une première incision avec l’aiguille. Commencez par trancher l’extrémité d’une pipette Pasteur à l’aide d’un couteau en diamant. Insérez ensuite une capillaire en verre dans l’embout de la pipette Pasteur de sorte qu’environ la moitié de sa longueur soit à l’intérieur. Insérez soigneusement un fin fil de tungstène dans l’extrémité ouverte de la capillaire à l’aide d’une flamme.

Faire fondre le verre sur le fil métallique en tenant fermement l'extrémité du verre avec une pince tout en tordant l'autre extrémité de l'aiguille. Le verre ramolli doit s'enrouler en spirale autour du métal, l'enserrant en place. Cela permet d'obtenir une aiguille émoussée servant à fabriquer une aiguille pointue.

Tenez le fil de tungstène au-dessus d'une flamme pendant une à 1,5 minute afin de brûler le métal, de manière à créer une pointe très fine. Vérifiez la qualité de la pointe par microscopie.

Une bonne pointe ne doit pas fléchir ni courber et doit s'affiner régulièrement jusqu'à une pointe fine, ne dépassant pas 50 micromètres de diamètre. Stérilisez les deux aiguilles à la flamme pendant quelques secondes et laissez-les refroidir avant de commencer la procédure. Dans un tube à centrifuger en plastique, préparez de l'agarose à point de fusion bas de 1,2 % et du ZFR sans calcium préchauffés à 40 degrés C dans un bain-marie, à l'étape souhaitée. Aspirez les embryons donneurs dans une pipette Pasteur et expulsez-les lentement dans le tube à centrifuger contenant l'agarose. Incubez les œufs dans l'agarose pendant environ cinq secondes.

Retirez les embryons à l’aide de la pipette et disposez-les en rangée sur une boîte de Pétri en polystyrène de cent millimètres en pipetant lentement et soigneusement ; la plupart des embryons se placeront sur le côté, l’œil tourné vers le haut. Répétez maintenant ce processus avec les œufs hôtes et disposez-les en rangée parallèlement aux œufs donneurs avant que l’agros ne durcisse. Utilisez l’aiguille émoussée pour retourner les embryons mal orientés afin que l’œil soit dirigé vers le haut une fois que l’agros a durci.

Recouvrir avec une solution d'agarose à point de fusion basse à 0,2 %. À l'aide d'une aiguille aiguisée, retirer tout l'agarose autour des yeux et découper très soigneusement l'œil donneur entier, qui flottera ensuite. Libérer ensuite le cristallin de l'œil.

Cela se fait en faisant glisser l'aiguille à travers le tissu oculaire du bas vers le haut. Pour l'hôte uniquement. Le cristallin est découpé à l'aide de petits mouvements avec une aiguille aiguisée, en coupant le plus près possible du cristallin sans le déchirer.

Évitez de retirer trop de tissu du reste de l'œil hôte. Une fois libérées, les lentilles flotteront dans le milieu. À l’aide de l’aiguille émoussée, poussez délicatement la lentille donneuse juste au-dessus l’emplacement de la lentille hôte, puis enfoncez-la en place à l’aide de l’aiguille émoussée.

La lentille hôte peut être jetée. Laisser les embryons donneurs et hôtes dans de l'Aros à 1,2 % pendant 30 à 60 minutes. Le milieu pour embryons favorisera la cicatrisation de la plaie.

Ensuite, libérez-les de l'agros à l'aide d'une aiguille métallique aiguisée. Transférez les embryons dans une plaque de 24 puits contenant du milieu pour embryons. Chaque embryon doit occuper un puits séparé.

Veillez à étiqueter correctement les puits afin qu'il soit clair quel hôte correspond à quel donneur une fois le transfert de lentille terminé. Laissez les embryons se développer à 28,5 degrés C jusqu'au moment souhaité. Pour l'observation phénotypique, nous examinons généralement la différenciation de la lentille dans un délai d'un à deux jours.

Le cristallin d'origine donneur devrait conserver l'expression de la GFP après transplantation dans l'œil hôte. Si un phénotype mutant n'est pas corrigé dans un environnement de type sauvage, cela indique que le phénotype est autonome. En revanche, s'il est corrigé, le phénotype est considéré comme non autonome.

Et cela a des implications importantes sur la fonction du gène sous-jacent. Nous venons de vous montrer comment réaliser une greffe du cristallin chez l'embryon de poisson zèbre. Lors de cette procédure, il est essentiel d'être très prudent lors de la mise en forme des aiguilles et de la dissection du cristallin lui-même.

En outre, les embryons doivent être disposés rapidement avant que le roulement de l'œuf ne se produise une fois la transplantation terminée. Pensez à ajouter l'embryon, le milieu à huit dans la guérison du bois. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.