Name: Objectif transplantation chez le poisson zèbre et son application dans lanalyse de mutants Eye (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Découvrez la transplantation de cristallin chez Danio rerio pour étudier le développement oculaire et les interactions tissulaires. Cette méthode permet de déterminer si les défauts de taille sont autonomes ou non.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cette procédure suit dans une large mesure de la technique de transplantation développés pour les poissons grotte par le laboratoire de Bill Jeffrey.

Partie 1: Préparation des embryons Dans ce protocole, nous allons utiliser le symbole JJ xy pour désigner un mutant de poisson zèbre hypothétique objectif. <ol><li> Zebrafish souches sont maintenus dans des conditions standard de facilité de poissons à 28,5 C sur un cycle de 14h light/10h sombre. </li><li> Dans la soirée, les mâles et les femelles lieu du poisson-zèbre souche JJ xy: AB / TU; tg (mGFP) dans un réservoir avec un diviseur de les séparer les uns des autres. La descendance de ce croisement exprimeront le transgène GFP dans tous les tissus, et seront utilisés comme donneurs. En parallèle, utilisez la même procédure pour mettre en place des croisements entre non transgéniques animaux de type sauvage. Selon le but de cette expérience, on peut traverser les animaux de type sauvage au locus JJ xy en tant que donneurs ou hôtes. </li><li> Dans une heure après la lumière s&#39;allume dans la matinée, retirer les séparateurs pour permettre aux poissons de se reproduire. </li><li> Après 15-30 minutes de recueillir des embryons dans 100 x 15 mm boîte de Pétri, les nettoyer et changer le milieu (eau oeuf). </li><li> Gardez les embryons dans un incubateur à 28,5 C jusqu&#39;au moment désiré. </li><li> Lorsque vous êtes prêt pour la transplantation, retirez le chorion manuellement avec deux paires de forceps pointu, et incuber les embryons dans 0,2% d&#39;EDTA en calcium sans ZFR pendant 30 minutes. </li></ol> Partie 2: Préparation des aiguilles de dissection <ol><li> La procédure de transplantation nécessite deux types d&#39;aiguilles: une aiguisée, qui est utilisé pour couper les tissus entourant la lentille, retirer le chorion, et les embryons libération de agarose et une aiguille émoussée utilisée pour déplacer la lentille donateurs et l&#39;insérer dans l&#39;hôte. Ici, nous allons vous montrer comment faire de ces aiguilles. </li><li> Tout d&#39;abord, la pointe d&#39;une pipette Pasteur doit être coupé avec un couteau de diamant. Ensuite, insérez un verre capillaire dans la pointe pipette Pasteur de sorte qu&#39;environ la moitié de sa longueur est à l&#39;intérieur. Ce sera plus facile pour immobiliser le fil de tungstène par fusion dans le verre à l&#39;étape suivante. </li><li> Ensuite, insérez un fil de tungstène minces dans l&#39;extrémité ouverte du capillaire. Faire fondre le verre sur le fil avec un bec Bunsen. En utilisant des pinces, rester stable à la fin de verre avec le fil métallique tout en tordant l&#39;autre extrémité de l&#39;aiguille à la main. Le verre ramolli devrait spirale autour du métal, il préhension en place. </li><li> Si vous effectuez une aiguille pointe arrondie, alors c&#39;est la fin de la procédure. Pour créer une aiguille aiguisée, tenir le fil de tungstène sur un bec Bunsen pendant 1-1,5 minutes, brûler le métal donc une pointe très fine est créé. Vérifier la qualité de pointe par microscropy.It est une bonne idée de stériliser les deux aiguilles dans la flamme pendant quelques secondes immédiatement avant la transplantation. </li></ol> Partie 3: Préparation des réactifs <ol><li> Sans calcium Zebrafish Ringer (ZFR) Solutions (116 mM NaCl, 2,9 mM de KCl, 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,2) </li><li> 0,2% en calcium des solutions sans Zebrafish Ringer (pH 7,2) EDTA </li><li> 1,2% (point de fusion bas) agarose en calcium sans ZFR </li><li> 0,2% (point de fusion bas) agarose en calcium sans ZFR </li><li> Embryon moyenne (pH 7,0, contenant par litre: 10 ml Hanks Solution # 1, 1 ml de solution de Hanks n ° 2, 10ml Hanks Solution n ° 4, 10ml Hanks Solution # 5, le bicarbonate de sodium 0,35 g, 300 uL d&#39;HCl 2M, la pénicilline-streptomycine 500 000 U) comme dans le livre de poisson zèbre (Université de l&#39;Oregon Press, 2000). </li><li> Fils de tungstène, plaqué or, diamètre 0.1mm, Alfa Aesar </li><li> Capillaire, diamètre 1.0mm, Instruments de précision du monde </li></ol> Partie 4: procédure de transplantation <ol><li> Dans un tube à centrifuger en plastique, préparez 1,2% d&#39;agarose bas point de fusion en calcium sans ZFR préchauffé à 40 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Au stade désiré (30 HPF, par exemple), prennent les embryons dans une pipette Pasteur, lentement les expulser dans le tube de centrifugation, et lentement les expulser dans le tube de centrifugeuse et incuber pendant environ 5 secondes. Les donateurs et les hôtes doivent être incubés séparément. </li><li> Avec une pipette, prendre jusqu&#39;à les embryons dans agarose à 1,2% du tube de centrifugeuse et les organiser en deux rangées parallèles dans une boîte de Pétri en polystyrène de 100mm, en gardant les hôtes et les donateurs séparée. En les pipetage lentement et prudemment, la plupart des embryons seront couchés sur le flanc dans l&#39;agarose. Vous aurez besoin de réorienter ceux qui ne réside pas dans cette position en utilisant l&#39;aiguille émoussée de telle sorte que l&#39;œil est orienté vers le haut avant que l&#39;agarose se solidifie. </li><li> Attendez que l&#39;agarose à 1,2% à solidifier, puis superposer avec 0,2% de point de fusion solution à faible agarose. </li><li> Utilisation de l&#39;aiguille aiguisé, enlever tout d&#39;agarose autour des yeux, et très soigneusement coupés de la lentille à partir de l&#39;hôte et les embryons donneurs à l&#39;aide de petites touches. Assurez-vous de couper juste assez proche de l&#39;objectif afin de ne pas le déchirer, mais aussi afin que vous ne retirez pas trop de tissu par rapport au reste de l&#39;œil hôte. </li><li> Une fois libre, lentilles flottent dans le milieu. Utilisation de l&#39;aiguille émoussée, poussez délicatement le donateurlentilles juste au-dessus de l&#39;emplacement de l&#39;endroit où la lentille de l&#39;hôte serait normalement, puis enfoncez-la dans les yeux avec l&#39;aiguille émoussée. La lentille de l&#39;hôte peut être écarté. </li><li> Laisser embryons donateurs et d&#39;accueil en agarose à 1,2% pour les 30-60 minutes, puis les libérer de l&#39;agarose en utilisant l&#39;aiguille forte, et les transférer dans une plaque de 24 puits avec un milieu de l&#39;embryon. Chaque embryon doit occuper un autre puits. Assurez-vous de l&#39;étiquette du puits proprement qu&#39;il est clair, qui correspond à l&#39;hôte qui donateur. </li><li> Incuber à 28,5 C. L&#39;provenant de donneurs lentille peut être distinguée de la lentille de l&#39;hôte sur le côté non opéré du même animal repose sur fluorescence de la GFP. Les articles peuvent également être faites pour mesurer la taille d&#39;objectif et de déterminer si elle différencie correctement. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Fig. 1 image à faible grossissement d&#39;une aiguille aiguisée utilisée pour objectif de transplantation. Un capillaire en verre (B) est insérée dans la pipette Pasteur (A), et un mince fil de tungstène (C) est insérée dans l&#39;extrémité ouverte du capillaire. Le verre sur le fil est adoucie par un bec Bunsen. En utilisant des pinces, rester stable à la fin de verre avec le fil métallique tout en tordant l&#39;autre extrémité de la pipette Pasteur avec votre main. Le verre ramolli devrait spirale autour du métal, le saisissant à la place. <img src="/files/ftp_upload/1258/fig2 1258.png" alt="" width="600" height="204" /> Fig. 2 Les conseils des deux types d&#39;aiguilles utilisées pour objectif de transplantation. <img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Fig. 3 embryons ont subi lentille de la transplantation au 30hpf. On voit ici un embryon donneur (A, B), un œil sur l&#39;hôte avec un objectif de transplanter (C, D), et le côté le contrôle de l&#39;embryon hôte (E, F). Chaque œil est montré à la fois dans la lumière transmise et éclairage UV tel qu&#39;indiqué. Les photographies ont été prises à 48 HPF. Le Q01 [9] transgéniques ligne a été utilisée dans cette expérience.

<ol><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289, 631-633 (2000).</li>
<li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+vision+in+the+zebrafish%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of vision in the zebrafish(Danio rerio).</a> Dev Biol. 180, 646-663 (1996).</li>
<li>Schmitt, E., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+morphogenesis+in+the+zebrafish.+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.comp.+Neuro%22%5BJournal%5D)">Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio.</a> J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).</li>
<li>Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+forward+genetics--analysis+of+neuronal+diversity+and+patterning+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina.</a> Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).</li>
<li>Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+to+the+analysis+of+eye+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish.</a> Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+study+neurogenesis+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina.</a> Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutagenesis+yields+eye+morphological+mutants+with+retinal+and+lens+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects.</a> Vision Res. 42, 535-540 (2002).</li>
<li>Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).</li>
</ol>

Plusieurs étapes nécessitent une attention particulière lors de transplantations d&#39;objectif. <ol><li> Aiguisé aiguilles: Il est préférable de préparer plusieurs aiguilles avant d&#39;effectuer la transplantation lentilles, et la pointe de l&#39;aiguille doit être aussi mince que possible. Une aiguille plus épaisse va déchirer plus de tissu en raison de son plus grand diamètre, provoquant une panne dans les yeux pour guérir. </li><li> Organiser les embryons: Juste avant la transplantation, vous devez positionner ...

<table><tbody><tr><td>Fil de tungstène de 0,1 mm de diamètre</td><td>A Johnson Matthey</td><td>45086</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (point de fusion bas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW 100-4</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Pompe pour pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Cardinal Health</td><td>D1906</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

objectif transplantation chez le poisson zèbre et son application dans l&#39;analyse de mutants eye

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

L&#39;objectif joue un rôle important dans le développement de la cupule optique [1,2]. En utilisant le poisson zèbre comme organisme modèle, les questions concernant le développement lentille peut être adressée. Le poisson zèbre est utile pour des études génétiques en raison de plusieurs caractéristiques avantageuses, y compris de petite taille, taux de fécondité élevé, cycle de vie court, et la facilité d&#39;entretien. Objectif de développement se produit rapidement chez le poisson zèbre. Par 72 HPF, la lentille de poisson zèbre est fonctionnellement matures [3]. L&#39;abondance des ressources génétiques et moléculaires sont disponibles pour soutenir la recherche dans le poisson zèbre. En outre, la similitude de l&#39;œil de poisson zèbre à ceux des autres vertébrés fournit une base pour son utilisation comme un modèle animal d&#39;excellents défauts de l&#39;homme [4-7]. Plusieurs mutants poisson zèbre présentent des anomalies lentilles, y compris des niveaux élevés de mort cellulaire, ce qui dans certains cas, conduit à une dégénérescence complète des tissus lentille [8]. Afin de déterminer si des anomalies de lentilles sont dus à des causes intrinsèques ou à défaut les interactions avec les tissus environnants, la transplantation d&#39;une lentille mutant dans un oeil de type sauvage est effectuée. L&#39;utilisation d&#39;aiguilles métalliques polies au feu, les lentilles de mutant ou de type sauvage sont soigneusement disséquées de l&#39;animal donneur, et transférés dans l&#39;hôte. Afin de distinguer les tissus de type sauvage et mutant, une lignée transgénique est utilisé comme donneur. Cette ligne exprime membranaires GFP dans tous les tissus, y compris l&#39;objectif. Cette technique de transplantation est un outil essentiel dans les études de mutants lentilles poisson zèbre.

Objectif de développement implique des interactions avec d&#39;autres tissus. Plusieurs mutants oeil de poisson zèbre sont caractérisés par une taille anormalement petite lentille. Ici nous démontrons une expérience de transplantation objectif pour déterminer si ce phénotype est dû à des causes intrinsèques ou des interactions défectueuses avec les tissus qui entourent la lentille.

Objectif transplantation chez le poisson zèbre et son application dans l&#39;analyse de mutants Eye

Le cristallin joue un rôle important dans le développement de la cupule optique[1,2]. En utilisant le poisson-zèbre comme organisme modèle, des questions concernant le développement du cristallin...

Pour commencer la greffe de cristallin chez le poisson zèbre, des donneurs transgéniques exprimant la GFP et des hôtes récipients sauvages sont d'abord incubés pendant 30 minutes dans des boîtes de Pétri séparées contenant une solution de Ringer pour poisson zèbre sans calcium. Les larves de poisson sont ensuite incluses dans deux lignes parallèles dans de l'agarose à point de fusion basse. Une ligne A est destinée aux donneurs et l'autre B aux hôtes. L'œil entier est prélevé du donneur, tandis que seul le cristallin est retiré de l'hôte.Les tissus entourant la lentille donneur sont retirés avant de placer la lentille dans l'œil hôte. Après la transplantation, les poissons sont stockés dans des plaques étiquetées de 24 puits. La lentille transplantée doit présenter une fluorescence GFP dans l'hôte.Évidemment, l’œil controlatéral de l’hôte n’a pas été opéré et n’exprime pas la GFP. Bonjour, je suis Yj. Et moi, c’est Kaya McCullough, et nous travaillons dans le laboratoire du Dr Yma Maki, au Département d’ophtalmologie de la Harvard Medical School. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de transplantation de cristallin chez le poisson zèbre de type sauvage Daniel Rio.Nou

lens-transplantation-zebrafish-its-application-analysis-eye

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous démontrons un protocole visant à générer des embryons de poissons zèbres chimérique pour l'imagerie cellulaire comportements direct durant l'embryogenèse.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cet article décrit une approche pour le poisson-zèbre microdissect rétines avec et sans l'épithélium pigmentaire rétinien attachés, de un à trois embryons jours post-fécondation.

Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

Cette vidéo décrit le protocole qui est développé pour disséquer les lentilles de poisson-zèbre adultes et larvaires afin d’analyser la morphologie du cristallin cortical et l’intégrité structurelle des sutures du cristallin.

Dissection du cristallin : une technique pour observer la morphologie du cristallin du poisson-zèbre

La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière est un excellent outil pour l’imagerie du développement embryonnaire. Il permet d’enregistrer de longs films en accéléré d’embryons vivants dans des conditions physiologiques proches. Nous démontrons son application pour l’imagerie du développement de l’œil du poisson-zèbre à de larges échelles spatio-temporelles et présentons un pipeline pour la fusion et la déconvolution d’ensembles de données multivues.

Utilisation de feuilles Lumière Fluorescence Microscopy à l&#39;image du développement Zebrafish Eye

Suivi en direct des progéniteurs rétiniens WT individuels dans des contextes génétiques distincts permet l'évaluation de la contribution de la signalisation non-autonome cellule pendant la neurogenèse. Ici, une combinaison de knock - down de gènes, la génération par la transplantation d' embryons chimères et in vivo d' imagerie confocale time-lapse a été utilisé à cette fin.

Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

Ici, nous discutons d’une méthode de protocole qui permettra une analyse simple du système vasculaire rétinienne tg(fli:EGFP) adult poisson zèbre comme une lecture rapide en paramètres de pathologies vasculaires à long terme, liées à la néoangiogenèse et changements structurels.

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Ces protocoles ont été élaborés pour analyser la morphologie des lentilles corticales, l’intégrité structurale des sutures de lentilles poisson zèbre dans les lentilles fixes et vivantes et pour mesurer la position du noyau de lentille de zébrafish le long de l’axe antérieur-postérieur.

Évaluation de la localisation des noyaux de lentilles zebrafish et de l’intégrité suturale

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Ici, un protocole est fourni pour l’imagerie time-lapse de la morphogenèse oculaire à l’aide d’un microscope à feuille de lumière disponible dans le commerce et d’un poste de travail de traitement d’images pour analyser les données résultantes. Ce protocole détaille les procédures d’anesthésie embryonnaire, l’intégration dans l’agarose à basse température de fusion, la suspension dans la chambre d’imagerie, la mise en place des paramètres d’imagerie et enfin l’analyse des données d’imagerie à...

Visualisation de la morphogenèse oculaire par microscopie Lightsheet à l’aide de rx3:GFP Transgenic Zebrafish

L’article explique comment enlever chirurgicalement les yeux des larves vivantes de poisson zèbre comme première étape vers l’étude de la façon dont l’apport rétinien influence la croissance et le développement du tectum optique. En outre, l’article fournit des informations sur l’anesthésie larvaire, la fixation et la dissection cérébrale, suivies de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale.

Enlèvement des yeux chez les larves vivantes de poisson zèbre pour examiner la croissance et le développement du système visuel dépendants de l’innervation

Nous présentons ici un protocole de transplantation de cellules à haute résolution spatiale et temporelle chez des embryons et des larves de poisson-zèbre à n’importe quel stade entre au moins 1 et 7 jours après la fécondation.

Transplantation cellulaire à haute résolution chez le poisson-zèbre embryonnaire et larvaire

Découvrez la transplantation de cristallin chez Danio rerio pour étudier le développement oculaire et les interactions tissulaires. Cette méthode permet de déterminer si les défauts de taille sont autonomes ou non.

Objectif transplantation chez le poisson zèbre et son application dans l'analyse de mutants Eye

Explorer plus de vidéos