Name: La Passerelle au cerveau: Disséquer les yeux Primat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez la dissection de la rétine de primate non humain pour la recherche en neurosciences et ophtalmologie. Cette méthode permet d'étudier l'organisation rétinienne et ses implications pour la santé humaine.

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Les auteurs tiennent à remercier pour son Ikiel Ptito support technique. Nous sommes reconnaissants à Frank Ervin, Roberta Palmour et le personnel des laboratoires de sciences du comportement de la Fondation situé à St-Kitts, dans les Antilles, pour leur soutien continu de notre travail primates.

Partie 1: Pré-traitement des tissus <ol><li> Les tissus doivent être bien perfusés avec du paraformaldéhyde, glutaraldéhyde, ou du formol. Ceci peut être réalisé grâce à la perfusion transcardial norme généralement utilisée pour la récolte d&#39;autres organes. Il est recommandé que, peu après le sacrifice des yeux être injecté avec fixateur juste sous la lentille et stockés dans un fixateur. </li><li> Dans l&#39;étude actuelle, l&#39;objet a été profondément sédatés avec le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg, im), euthanasiés avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, iv) et perfusé transcardiaque avec PBS 0,1 M jusqu&#39;à ce que complètement exsangue. Il est suivi par une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 5 min (~ 1 litre). </li></ol> Partie 2: Suppression de l&#39;œil de la cavité orbitaire <ol><li> Pour faciliter l&#39;accès à l&#39;œil, il est recommandé d&#39;enlever d&#39;abord le cerveau. Une fois que le cerveau a été enlevée de l&#39;os en orbite à paroi mince est évident. Utilisez la pince gouge os à ronger lentement la paroi de l&#39;orbite. Coupez les muscles oculaires avec un scalpel et retirez le tissu conjonctif du globe oculaire. Découpez soigneusement le nerf optique, ce qui peut être utilisée dans les études de microscopie électronique. Le globe oculaire devrait maintenant être libéré de la cavité orbitaire. </li></ol> Partie 3: Disséquer la rétine de l&#39;œilleton <ol><li> Placez l&#39;oeil dans une boîte de Pétri avec du PBS pour maintenir la rétine de sécher. Un microscope à dissection ou sur une table se loupe lumière est utile dans la dissection, mais pas une nécessité. Retirez la cornée en coupant la sclérotique près du périmètre de la cornée au niveau de l&#39;ora serrata avec une paire de ciseaux à ressort et enlever la lentille avec la pince. </li><li> Utilisez un pinceau, des pinces, des ciseaux et de printemps pour enlever la rétine de la sclère. Cela se fait en séparant la rétine de la sclère, puis couper la sclère écart avec les ciseaux. Il faut mener à bien ce processus dans de petits incréments afin de ne pas endommager ou déchirer le tissu rétinien. La sclérotique n&#39;est pas facilement séparées du reste du nerf optique si soigneusement coupé la sclère autour du nerf optique. </li><li> A ce point de la rétine a conservé sa forme incurvée et doit être aplatie pour l&#39;échantillonnage. Avant aplatissement de la rétine, l&#39;humeur vitrée, qui a la consistance de la gelée, peuvent être retirés dans un morceau. Pour aplatir la rétine sur une diapositive, faire plusieurs coupures radiales avec une lame de bistouri. L&#39;humeur vitrée résiduelle peut maintenant être enlevée avec du papier filtre ordinaire et d&#39;un pinceau. La couche de cellules ganglionnaires de la rétine est exposée à ce point il est donc impératif d&#39;être doux pour retirer le corps vitré. Si le nerf optique est encore attaché à la papille optique, retirez le nerf optique, sans déchirure de la rétine à l&#39;aide d&#39;un scalpel et d&#39;une paire de ciseaux à ressort. C&#39;est désormais une rétine support plat (figure 1) et la fovéa devrait être évident que une tache sombre dans la direction temporelle / ventrale du disque optique. </li></ol> Partie 4: Échantillonnage <ol><li> Il ya un certain nombre d&#39;options pour le prélèvement de la rétine. Ici, nous allons décrire la préparation et l&#39;échantillonnage flatmount isodentric. Pour les deux procédures flatmount la rétine avec la couche de fibres optiques loin de la glissière. Si l&#39;intention est d&#39;examiner la couche de cellules ganglionnaires de la rétine dans la préparation flatmount, il est nécessaire de supprimer ou eau de Javel l&#39;épithélium pigmenté. Pour enlever l&#39;épithélium pigmenté utiliser un pinceau légèrement pour enlever une partie de cette couche, ce qui tend à endommager la couche des photorécepteurs. Blanchiment consiste à tremper dans une solution de la rétine de permanganate de potassium (0,25%) pendant 1 heure, laver à l&#39;eau distillée, et la compensation de l&#39;acide oxalique (5%) pendant 5 minutes. 2 </li><li> Si l&#39;intention est d&#39;examiner la distribution de cellules et la morphologie de chaque couche à travers la rétine, alors nous vous suggérons d&#39;échantillonnage isométrique de la rétine. La rétine doit être flatmounted sur une lame et maintenu humide avec du PBS. Pour l&#39;échantillonnage isométrique coupé de petits morceaux de tissus à égale distance de la papille optique dans le nez, les directions temporelles, supérieure et inférieure (Figure 1). Il n&#39;est pas nécessaire de blanchir l&#39;épithélium pigmenté dans cette préparation. Ces pièces peuvent désormais être sectionnée dans le plan frontal avec un cryostat, vibratome ou ultramicrotome en fonction de la question de recherche. Pour sectionner cryostat, les pièces doivent être cryoprotégés de saccharose à 30% du jour au lendemain et congelé dans le contexte d&#39;un milieu de montage sur glace sèche. Alternativement, les échantillons peuvent être intégrés dans l&#39;agar et tranché sur une vibratome. Le cryostat et préparations vibratome de manière fiable le rendement des sections aussi fine que 4 m. Si des sections plus minces sont nécessaires (par exemple pour la préparation au microscope électronique), il est nécessaire de préparer les échantillons pour les ultramicrotome. Pour ce faire, les sections doivent être post-fixe dans le tétroxyde d&#39;osmium pendant 1 heure sous la hotte. Elle est suivie par une déshydratation dans une série d&#39;éthanol à (50, 70, 95, 95, 100, 100%) et l&#39;oxyde de propylène de 100%. Le tissuest incorporé dans l&#39;Epon (Embed-812 Kit incorporation). </li></ol> Partie 5: Résultats du représentant: Dans notre laboratoire, nous avons l&#39;habitude de réaliser immunohistochimie sur la rétine cryosectioned (figure 2). Dans ce cas, nous sommes intéressés à l&#39;isodensité des récepteurs cannabinoïdes (CB1) dans la rétine des primates. Nous examinons également les effets de l&#39;exposition prénatale éthanol sur le système visuel des primates. À cette fin, nous sommes intéressés à la densité des cellules et l&#39;épaisseur de la couche dans la fovéa et de la rétine périphérique. Pour ce faire, nous intégrons des morceaux de la rétine dans l&#39;Epon, tranche à 700nm sur un ultramicrotome, et tacher avec 1% de bleu de toluidine (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/1261/fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Retina Figure Flatmount 1. Coupes radiales sont utilisés pour aplatir la rétine. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2 Immunocoloration. Cryosection de rétine périphérique immunocolorées pour CB1 où les cellules ganglionnaires de la rétine sont fortement étiqueté avec la mention de certains dans les couches intérieure et extérieure nucléaire. L&#39;épaisseur de cette section est de 14 m et colorées sur la diapositive. RG - couche ganglionnaires de la rétine; IP - couche plexiforme interne; EN - couche intérieure nucléaire; OP - couche externe plexiforme; ON - couche externe nucléaire. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3 Fovea. Section à travers la fovéa qui a été incorporé dans l&#39;Epon et tranché sur une ultramicrotrome à 700nm. La couche des photorécepteurs (PR) a été utilisé pour aligner les sections. Notez que toute l&#39;étendue des photorécepteurs peuvent être identifiées en indiquant un angle approprié dans le plan coronal. Les mesures de densité ont été prises à 300 m, 500 m et 800 m du centre de la fosse fovéale utilisant le système d&#39;imagerie Bioquant. RG - couche ganglionnaires de la rétine; IP - couche plexiforme interne; EN - couche intérieure nucléaire; OP - couche externe plexiforme; ON - couche externe nucléaire; barre d&#39;échelle = 50 m

<ol><li>Hendrickson, A., Kupfer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histogenesis+of+the+fovea+in+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The histogenesis of the fovea in the macaque monkey.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+in+the+St.+Kitts+green+monkey+%28Cercopithecus+aethiops+sabeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus).</a> J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).</li>
<li>Stone, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStone%2C+J+%22The+Wholemount+Handbook%22">The Wholemount Handbook</a>. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+early+hemispherectomized+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys.</a> Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).</li>
<li>Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).</li>
<li>Pow, D., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+kinesis%2C+neurite+sprouting+and+abnormal+axonal+projections+of+cone+photoreceptors+in+the+aged+and+AMD-afflicted+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina.</a> Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).</li>
</ol>

La préparation de la rétine comme un wholemount permet l&#39;analyse de la topographie et la répartition spatiale soit de la couche des cellules ganglionnaires ou les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins de la rétine 3. La quantification de la densité cellulaire dans la périphérie de la rétine des primates est facilement réalisée. Cependant, dans les régions et les périfovéolaires fovéale, l&#39;empilement de couches multiples dans la couche des cellules ganglionnaires obstrue la quantification. Pour...

<table><tbody><tr><td>Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>Tous ciseaux chirurgicaux conviennent</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau en poils de chameau ou de zibeline</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la passerelle au cerveau: disséquer les yeux primat

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

Le système visuel chez l&#39;homme est considéré comme la passerelle vers le monde et joue un rôle principal dans la pléthore de sensorielle, les processus perceptifs et cognitifs. Il n&#39;est donc pas surprenant que la qualité de la vision est liée à la qualité de vie. Malgré des recherches cliniques et fondamentales généralisé entourant les causes de troubles visuels, de nombreuses formes de déficiences visuelles, telles que la rétinite pigmentaire et la dégénérescence maculaire, le manque de traitements efficaces. Les primates non humains ont le plus proche caractéristiques générales du développement de l&#39;œil à celui des humains. Non seulement ils ont une anatomie similaire vasculaire, mais parmi les autres mammifères, les primates ont la caractéristique unique d&#39;avoir une région de la rétine temporale spécialisés pour l&#39;acuité visuelle élevée, la fovéa<sup&gt; 1</sup&gt;. Nous décrivons ici une technique générale pour disséquer la rétine des primates pour fournir des tissus pour l&#39;histologie de la rétine, l&#39;immunohistochimie, microdissection laser, ainsi que la lumière et la microscopie électronique. Avec l&#39;utilisation prolongée du primate non-humain comme un modèle de translation, notre espoir est qu&#39;une meilleure compréhension de la rétine se donnent un aperçu des approches efficaces en direction d&#39;atténuer ou d&#39;inverser l&#39;impact négatif des troubles visuels sur la qualité de vie des personnes touchées.

Le primate non-humain est une espèce importante translationnelle pour notre compréhension du développement et du vieillissement. L&#39;organisation anatomique de la rétine des primates peuvent fournir des indications importantes sur les conditions normales et pathologiques chez l&#39;homme.

La Passerelle au cerveau: Disséquer les yeux Primat

Le système visuel humain est considéré comme la porte d'entrée vers le monde et joue un rôle principal dans la pléthore de processus sensoriels, perceptuels et cognitifs...

Cette procédure commence par une tête de singe bien perfusée. Après retrait du cerveau, les globes oculaires sont ensuite extraits et connectés. Une fois les tissus éliminés, la cornée, le cristallin, la sclérotique et l'humeur vitrée sont soigneusement retirés, libérant ainsi la rétine.La rétine est placée à plat sur une lame de verre, et l'humeur vitrée résiduelle est éliminée. Des échantillons d'Iso Dentrix sont ensuite prélevés et protégés par congélation. Bonjour, je suis le Dr Mark Burke du Laboratoire de neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Montréal.Bonjour, je suis le Dr Shaheen Zur, également du Laboratoire de neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Montréal. Bonjour, je suis le Dr Tito, directeur du Laboratoire de neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Montréal. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de dissection de la rétine d'un primate non humain.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier divers aspects de l'organisation rétinienne dans le développement normal ainsi que lors de perturbations développementales. Commençons donc. Commencez ce protocole avec la tête de primate que vous avez préalablement perfusée.Eh bien, à l'aide d'un fixateur tel que le paraformaldéhyde, la rétine à disséquer ici est prélevée d'un singe vervet. Pour assurer la préservation de l'œil, un fixateur tel que le paraformaldéhyde peut être injecté juste sous le cristallin. La tête doit être conservée dans du fixateur ou dans du PBS avant de passer à l'extraction des globes oculaires afin d'obtenir un accès plus facile au globe oculaire.Tout d'abord, retirez le cerveau. Pour visualiser cette procédure, consultez notre récent article JoVE sur la dissection du cerveau de primate non humain dans l'espace stéréotaxique. Une fois le cerveau retiré, l'os orbitaire à paroi mince est clairement visible.Utilisez des curettes osseuses pour éliminer lentement la paroi de l'orbite. Utilisez un scalpel pour sectionner les muscles oculaires et retirer les tissus conjonctifs du globe oculaire. Enfin, coupez délicatement le nerf optique afin de libérer le globe oculaire de la cavité orbitaire.À présent que le globe oculaire est libéré, on peut retirer la rétine. Pour retirer la rétine, commencez par placer l’œil dans une boîte de Pétri remplie de PBS afin d’éviter que la rétine ne s’assèche. Commencez par retirer la cornée. Utilisez une paire de ciseaux à ressort et coupez la sclère près du pourtour de la cornée, au niveau de l’ora serrata.À l’aide de pinces, retirez le cristallin. Enfin, pour détacher la rétine de la sclérotique, utilisez un pinceau, des pinces et des ciseaux à ressort.Séparez la rétine de la sclérotique, puis découpez la sclérotique avec les ciseaux. Ce processus doit être effectué par petites étapes afin d'éviter d'endommager ou de déchirer le tissu rétinien. La sclérotique ne se sépare pas facilement du nerf optique résiduel.Coupez soigneusement la sclérotique autour du nerf optique. La rétine conserve sa forme courbe. Retirez l'humeur vitrée de consistance gélatineuse en un seul morceau.La rétine est désormais prête à être montée et échantillonnée. Pour aplatir la rétine sur une lame, effectuez plusieurs incisions radiales à l’aide d’une lame de scalpel. Utilisez du papier filtre ordinaire et un pinceau pour éliminer l’humeur vitrée résiduelle.Il est impératif d'être délicat lors de l'exécution de cette étape, car elle expose la couche des cellules ganglionnaires de la rétine. Vérifiez si le nerf optique est encore attaché au niveau du disque optique. Utilisez une lame de scalpel et une paire de ciseaux à ressort pour retirer le nerf optique sans déchirer la rétine.Placez maintenant la rétine à plat sur une lame de microscope en verre de deux sur trois pouces, avec la couche des cellules ganglionnaires rétiniennes orientée vers l'extérieur par rapport à la lame. La fovéa apparaît désormais comme une tache sombre située en direction temporale et ventrale par rapport au disque optique. Pour examiner la couche des cellules ganglionnaires rétiniennes, il peut être nécessaire d'enlever ou de décolorer l'épithélium pigmentaire.Utilisez un pinceau pour retirer légèrement une partie de l'épithélium pigmenté. Notez que cette méthode a tendance à endommager la couche des photorécepteurs. L'examen de la distribution cellulaire et de la morphologie de chaque couche dans toute la rétine nécessite un échantillonnage isométrique de la rétine.Commencez par monter à plat la rétine sur une lame et ajoutez du PBS pour maintenir la rétine humide. Ensuite, découpez de petits morceaux de tissu situés à égale distance du disque optique dans les directions nasale, temporale, supérieure et inférieure. Ces fragments peuvent désormais être sectionnés dans le plan coronal à l’aide d’un cryostat, d’un vibratome ou d’un ultramicrotome.En fonction de la question de recherche. Pour la coupe au cryostat, les fragments doivent être cryoprotégés dans une solution de 30 % de saccharose dans un tampon phosphate pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Après l'incubation nocturne, congeler les fragments rétiniens dans un milieu d'inclusion sur de la glace sèche.Utilisez le cryostat pour obtenir des sections fines jusqu'à quatre micromètres. Dans notre laboratoire, nous réalisons couramment de l'immunohistochimie sur des coupes cryogéniques de rétine. Dans ce cas précis, nous nous intéressons à l'isodensité des récepteurs cannabinoïdes dans la rétine de primate.Nous examinons également les effets de l'exposition prénatale à l'éthanol sur le système visuel des primates. À cette fin, nous nous intéressons à la densité cellulaire et à l'épaisseur des couches dans la fovéa ainsi que dans la rétine périphérique. Pour ce faire, nous incluons des fragments de rétine dans de l'épon, que nous sectionnons à 700 nanomètres au microtome ultramicrotomie, puis nous colorons avec de la toxine bleue à 1 %.Nous venons de vous montrer comment disséquer une rétine de primate. Lors de cette procédure, il est important de ne pas endommager les ganglions rétiniens, la couche des cellules ganglionnaires ou les couches des photorécepteurs. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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