Name: Sachant ce qui compte: Stéréologie impartial dans le cerveau des primates non humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Découvrez la stéréologie impartiale pour estimer les populations neuronales dans le cerveau des primates non humains. Cette méthode précise aide les chercheurs à comprendre la structure cérébrale.

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Les auteurs tiennent à remercier pour son Ikiel Ptito appui technique continu. Subvention du CRSNG au MP.

Partie 1: Pré-traitement du tissu doit être fait en fonction de Burke et al. (2009) 5. <ol><li> En bref, le tissu doit être bien perfusés avec du paraformaldéhyde, glutaraldéhyde, ou du formol. Ceci peut être réalisé grâce à la perfusion transcardial norme généralement utilisée pour la récolte d&#39;autres organes. Dans l&#39;étude actuelle, l&#39;objet a été profondément sédatés avec le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg, im), euthanasiés avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, iv) et perfusé transcardiaque avec PBS 0,1 M jusqu&#39;à ce que complètement exsangue. Il est suivi par une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 5 min (~ 1 litre). Les tissus doivent être bien perfusés avec paraformaldeyhde, glutaraldéhyde, ou du formol. Le cerveau doit être bloquée stéréotaxique, retiré du crâne, pesé, le volume déterminé, cryoprotégés, et surgelés 5. </li></ol> Partie 2: échantillonnage systématique des tissus, selon Burke et al. (2009) 6. <ol><li> Dans cet exemple nous nous sommes concentrés sur le lobe frontal du cerveau vervet. L&#39;espace de référence a été défini pour inclure tissu cortical du sillon central jusqu&#39;au pôle frontal de l&#39;hémisphère gauche. Pour nos buts de la série ont été fixées à 1 / 10 sections dans tout le cortex, sectionné à 50 microns. Une série complète a été colorées avec du violet de crésyl (série # 1). Série 2 a été divisé de telle sorte que la moitié des sections ont été colorées avec du chlorure d&#39;or de la révélation de la myéline et l&#39;autre moitié pour teinté acétylcholine estérase (pour la délimitation de certaines régions sous-corticales). Toutes les autres séries ont été mis en banque dans la préservation d&#39;antigène dans le cadre de nos plans de recherche à long terme. </li></ol> Partie 3: Stéréologie (pour plus de détails, voir Mouton 2002) 4 <ol><li> L&#39;estimation totale du nombre de cellules (N) est calculée sur la base de l&#39;équation suivante: N = -1 x ssf asf -1 x TSF -1 x Σ Q - Où SSF est la fraction d&#39;échantillonnage article, ASF est la fraction d&#39;échantillonnage région, TSF, si la fraction d&#39;échantillonnage d&#39;épaisseur (l&#39;épaisseur mesurée du tissu est divisée par la hauteur dissecteur), et Σ Q - C&#39;est le nombre total d&#39;objets d&#39;intérêt compté dans le dissecteur. Les prochaines sections de ce protocole montrent comment déterminer la SSF, ASF, DAT et Σ Q. </li><li> Fraction d&#39;échantillonnage de section (non informatique) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> L&#39;espace de référence en entier doit être bien défini d&#39;avant en arrière et dorsale à ventrale. Dans cet exemple nous nous sommes intéressés dans le lobe frontal et l&#39;ont définie comme la région de la pointe du pôle frontal (antérieur) à l&#39;sillon central (postérieure) et le sillon latéral (ventrale) et exclus de l&#39;insula. </li><li> Pour le lobe frontal de ce sujet particulier un total de 760 sections ont été collectés systématiquement avec 76 colorées pour violet de crésyl. Depuis la cible était de 10 sections à travers l&#39;espace de référence des sections 1 / 6 violet de crésyl tachés ont été échantillonnés, conduisant à une fraction d&#39;échantillonnage section d&#39;environ 1 / 60. Nous hasard a commencé avec l&#39;un des 6 premiers crésyl violet et les coupes colorées systématiquement échantillonnés sixième par la suite. Un total de 13 sections ont été échantillonnées pour le sujet sélectionné (figure 2). </li></ol></li><li> Fraction de sondage aréolaire (sur ordinateur) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Une étude pilote indique la taille de la grille optimale, la fraction d&#39;échantillonnage de secteur, de goûter à l&#39;espace de référence avec environ 100-300 disectors. Dans le lobe frontal, une taille de grille de 2500 um 2 a donné une moyenne de 254 disectors pour ce sujet (figure 2). La taille de la disector devrait rendement entre environ 0-5 objets comptés, dans ce cas, les neurones. </li></ol></li><li> Fraction Exemple Epaisseur (sur ordinateur) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> À chaque endroit disector, la hauteur du tissu est mesurée, et une fraction de cette hauteur est échantillonné, ce qui est connu comme la fraction d&#39;échantillonnage de l&#39;épaisseur. Pour déterminer l&#39;épaisseur mesurée, se concentrer dans le plan z jusqu&#39;à ce que la première cellule vient en point, puis légèrement remonté jusqu&#39;à la partie supérieure de la section, c&#39;est à dire jusqu&#39;à ce que le dernier objet apparaît juste hors de discussion. Pour déterminer le fond du tissu, se concentrer dans le plan z jusqu&#39;à ce les cellules sont à peine sortis de discussion. </li><li> Se concentrer dans le plan z, les cellules doivent être colorés à toute profondeur, sinon, cela peut indiquer une pénétration incomplète de la déshydratation tache ou non uniforme du tissu, dans ce cas, les sections doivent être re-colorées. Cette précaution est particulièrement importante pour les tissus immunocolorés qui nécessite la pénétration des immunoprobes à travers des sections de tissu relativement épais. Pour cette raison, les tissus immunocolorés devrait être légèrement de contraste avec une tache de basophiles (par exemple, le violet de crésyl, Hemahématoxyline) afin de déterminer avec précision supérieure et inférieure de la section et de confirmer la pénétration de l&#39;anticorps. Dans cette étude, les sections ont été tranché lors d&#39;une mise en microtome de 50 microns. Après tout traitement de tissu a été complète, l&#39;épaisseur des tissus mesurée en moyenne 17.9μm (figure 2), avec un retrait moyen d&#39;environ 65%. Notez que ces résultats représentent le rétrécissement typique pour les tissus traités pour la préparation histologique de routine 7. </li><li> La hauteur disector par défaut pour l&#39;étude typique est 10 microns. La différence entre la hauteur et l&#39;épaisseur disector section mesurée est la hauteur de garde, le volume du tissu où aucune des caractéristiques biologiques sont comptés. L&#39;utilisation d&#39;une hauteur de garde d&#39;éviter des dommages aux tissus à la surface de sectionnement (par exemple, a perdu bouchons). </li></ol></li><li> Le nombre total d&#39;objets comptés, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Pour éviter les biais d&#39;erreurs de reconnaissance, il est impératif que la définition standard est suivie pour la particularité biologique d&#39;intérêt. Dans ce cas, nous étions intéressés à compter neurones. Par conséquent, un neurone a été défini comme ayant un nucléole visible situé au centre et un cytoplasme clairement définis, tandis que les cellules gliales manquaient généralement nucléoles visibles et le cytoplasme. Pour cette réserve 457 neurones ont été comptés. </li></ol></li></ol> Partie 4: Stereologer - Un système informatisé Stéréologie (Stéréologie Resource Center, Chester, MD) <ol><li> Le système Stereologer invite l&#39;utilisateur à remplir les informations nécessaires de façon étape-par-étape. Dans le champ &quot;Information sur l&#39;étude« la section des paramètres de l&#39;étude sont établies. Depuis un espace de référence doit être défini pour l&#39;étude, le paramètre de volume doit être sélectionné (pour l&#39;espace de référence de l&#39;estimateur Cavalieri doit être sélectionné). Volume de l&#39;objet peut également être sélectionné ici d&#39;estimer le nombre pondéré de volume pour la population des objets d&#39;intérêt. Pour notre exemple, seul le volume de l&#39;espace de référence a été choisie. Pour chaque objet, sélectionnez le nombre et définir la fonction de l&#39;intérêt, dans ce cas, Neurones. </li><li> Initialisation de cas: Dans cette section, l&#39;information sur l&#39;échantillonnage est établie. Entrez l&#39;intervalle d&#39;échantillonnage la dalle (si dalles séparées de tissu ont été tranché de manière exhaustive et chaque section est placée dans un ordre séquentiel puis entrez 1 ici). Entrez le nombre total de sections prises à travers l&#39;espace de référence (dans ce cas 760). Ensuite, entrez l&#39;intervalle d&#39;échantillonnage section (dans ce cas 59). Le système calcule ensuite le nombre de sections à échantillonner (dans ce cas 13). </li><li> Paramètres de la sonde: Cette section définit la grille et la taille disector. Pour le volume, utilisez un faible grossissement 2.5x-10x pour définir l&#39;espacement de grille dans le menu Édition. Grossissement des objets doit être effectué à 100x (NA 1.3 ou 1.4). Zone du cadre est la taille de l&#39;disector, dans ce cas nous avons utilisé l&#39;écran à 50%. La hauteur du cadre est l&#39;épaisseur de la disector; fixé à 10 microns ici. L&#39;écartement des couples est la taille de la grille. Dans notre étude pilote, nous avons trouvé que les rendements entre 2500μm 150-200 cadres espacés de façon systématique uniforme à travers un espace de référence relativement importante. Pour les plus petites régions, une plus petite taille de grille doit être utilisée. Une étude pilote permettra d&#39;identifier les paramètres de la sonde optique pour chaque étude particulière. </li><li> Une fois les paramètres de l&#39;étude ont été établis, l&#39;échantillonnage à travers le tissu peut se poursuivre. Le programme vous invite à déguster la première section. Étape 1: Le programme invite l&#39;utilisateur, sous un faible grossissement, pour tracer l&#39;espace de référence sur la section. Le système va alors placer une grille sur la section sur la base des paramètres de la sonde et l&#39;utilisateur va alors vérifier que les points tombent dans l&#39;espace de référence. Si un point n&#39;est pas dans l&#39;espace de référence, cliquez simplement sur ​​le point et ne seront pas calculés dans le volume. Étape 2: Le système placera une nouvelle grille sur l&#39;espace de référence, basé sur les paramètres d&#39;espacement cadre. Vérifiez que les intersections tombent dans l&#39;espace de référence. Étape 3: Le système va alors demander à l&#39;utilisateur de passer à l&#39;objectif plus fort grossissement et déplacer la scène à la première étape dissecteur 4:. A ce stade, le système invite l&#39;utilisateur à définir le haut et le bas de la section, puis le système définit l&#39;espace d&#39;échantillonnage dans l&#39;axe z Étape 5:. L&#39;utilisateur sera alors de cliquer sur chaque objet qui tombe dans le travers disector le plan z. Les objets qui touchent les lignes rouges ou le bas de la disector ne peuvent pas être comptés. Une fois que chaque objet est compté, cliquez sur suivant. La scène se déplace vers la prochaine et disector étapes 4 et 5 seront répétées. Une fois tous les disectors de la section ont été comptés, le système invite l&#39;utilisateur à insérer le paragraphe suivant séquentielle d&#39;être sondé. Etapes 1-5 sera répété jusqu&#39;à ce que toutes les sections séquentielles ontété échantillonnés. Le système fournira alors les calculs pour les ASF, SSF, TSF, et Σ Q. Basé sur ces paramètres, le système va générer un N estimé, le volume de référence et de CE pour les deux l&#39;estimation du nombre et du volume. Il donnera également des recommandations à devenir plus efficaces ou pour réduire la CE (figure 2). </li></ol> Partie 5: Résultats du représentant: Stéréologie Unbiased fournit des estimations fiables et efficaces des populations de cellules au sein d&#39;un espace de référence. Il ya un certain nombre de systèmes informatiques stéréologiques disponibles, qui s&#39;appuient sur un échantillonnage systématique et un espace de référence défini. Nous avons utilisé le système de vie BIOQUANT Sciences pour estimer la population totale des neurones du cortex cérébral de 2 ans à plus de vervets 828 millions (figure 3) avec une moyenne de 0,042 CE. Nous avons ensuite utilisé le système Stereologer à estimer que les comptes du lobe frontal pour environ la moitié du nombre de neurones corticaux 8. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 Computer Systems basée Stéréologie. Le set-up de base des systèmes stéréologie est le même, un microscope avec une platine motorisée (XYZ), un contrôleur de scène, caméra vidéo, informatiques et de logiciels. Le système qui est finalement choisie devrait être basée sur l&#39;efficacité, les besoins et l&#39;analyse des coûts. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Information sur l&#39;étude </td></tr><tr><td> Nom de l&#39;étude </td><td> Cortex frontal </td></tr><tr><td> Chercheur principal </td><td> MB </td></tr><tr><td> Espèces </td><td> AG </td></tr><tr><td> Référence espace frontal </td><td> Cortex </td></tr><tr><td colspan="2"> Remarques </td></tr><tr><td colspan="2"> INFORMATION DE CAS </td></tr><tr><td> Data Collector </td><td> MB </td></tr><tr><td> Date de </td><td> Mercredi 30 avril 2008 </td></tr><tr><td> Groupe </td><td> Contrôle </td></tr><tr><td> Sujet </td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Remarques </td></tr><tr><td colspan="2"> Caractéristiques d&#39;échantillonnage </td></tr><tr><td> Intervalle d&#39;échantillonnage Slab </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nombre total d&#39;articles </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Intervalle d&#39;échantillonnage section </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Section de départ </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRACTIONS </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> SOMMAIRE DES RÉSULTATS </td></tr><tr><td> Paramètre </td><td> Probe </td><td> Nom </td><td> Résultat </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Epaisseur </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17.8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Nombre </td><td> Disector </td><td> neurone </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Volume </td><td> Cavalieri point de grille </td><td> le volume </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> RECOMMANDATIONS </td></tr><tr><td> Probe </td><td> Nombre d&#39;objets (neurone) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Recommandations </td><td> CE est acceptable. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Nombre de vues Disectors est trop élevé, augmenter l&#39;espacement Disector. </td></tr><tr><td> Probe </td><td> Volume Région (en volume) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Recommandations </td><td> CE est acceptable. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> RÉSULTATS SECTION </td></tr><tr><td> Section </td><td> neurone neurone NumObjects NumCorners </td><td> RegPoints volumes </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9. 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10. 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Figure 2 Résultats du lobe Fontal obtenus avec le système Stereologer. Pour le lobe frontal, la partie la plus longue du processus stéréologiques était dans l&#39;échantillonnage systématique et de sectionnement. Estimer la topographie, le volume et neuronales ont été réalisées en une journée environ pour chaque sujet. L&#39;hémisphère gauche a été échantillonnée et le nombre est doublé dans le texte d&#39;approcher une estimation pour les deux hémisphères. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3 Estimation Cortex population neuronale Obtenu avec BIOQUANT. Le système nécessite une BIOQUANT topographie exacte avant le comptage des cellules. Voici une moyenne de 13 sections ont été échantillonnés. Topographie corticale et l&#39;estimation du volume subséquente a pris entre 15-20 heures pour chaque sujet. Topographie a été effectuée sous un objectif 2.5x et le comptage a été effectué en utilisant un objectif 100x à immersion (NA 1,3). Chaque section a été choisi 100e partout dans l&#39;hémisphère gauche avec une moyenne de 180 disectors échantillonnés. Une fois que la topographie a été achevé le comptage neuronal a pris environ une journée. L&#39;hémisphère gauche a été échantillonnée et le nombre est doublé dans le texte d&#39;approcher une estimation pour les deux hémisphères.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Aat+Rec%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+cut+it%3A+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li>
<li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMouton%2C+PR+%22Principles+and+Practices+of+Unbiased+Stereology%22">Principles and Practices of Unbiased Stereology</a>. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+banking%3A+Making+the+most+of+your+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP%2FPS1%3A+Neuroimaging%2C+Stereology%2C+And+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22AGE%22%5BJournal%5D)">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li>
<li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
</ol>

Stéréologie impartiaux dans un cerveau de primate est similaire à celle des autres échantillons biologiques. Toutefois, étant donné la taille du cerveau des primates, un plan de traitement minutieux est recommandée car un seul hémisphère de l&#39;singe vervet rendements de plus de 1200 sections quand tranché au 50 microns. Premièrement, nous recommandons stéréotaxique bloquant le cerveau en blocs de 1 cm, qui fournit un plan standard de la section entre les blocs et les sujets, minimise coupes partielles entre les blocs...

<table><tbody><tr><td>Stereologer</td><td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td><td>www.disector.com</td><td></td></tr><tr><td>Système Stereology Tool-Kit Stereologer</td><td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sachant ce qui compte: stéréologie impartial dans le cerveau des primates non humains

Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Le primate non-humain est une espèce importante translationnelle pour comprendre les processus normaux et pathologiques de la fonction du cerveau humain. Stéréologie impartiales, la méthode acceptée que l&#39;état de l&#39;art pour la quantification des objets biologiques dans des coupes de tissus<sup&gt; 2</sup&gt;, Génère des données fiables pour les caractéristiques biologiques de structure dans le cerveau des mammifères<sup&gt; 3</sup&gt;. Les composantes clés de l&#39;approche sont impartiales (systématique aléatoire) d&#39;échantillonnage des structures anatomiquement définis (espaces de référence), combinée à la quantification du nombre de cellules et des longueurs de taille, de fibres et capillaire, surfaces, volumes régionaux et les distributions spatiales des objets biologiques dans le espace de référence<sup&gt; 4</sup&gt;. Parmi les avantages de ces approches par rapport aux méthodes précédentes stéréologiques est l&#39;évitement de toutes les sources connues d&#39;erreur systématique (non aléatoire) découlant de fausses hypothèses et non vérifiables modèles. Cette étude documente une application biologique de stéréologie informatisé pour estimer la population totale des neurones dans le cortex frontal du cerveau de singe vervet (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;), Avec l&#39;aide de deux programmes stéréologie disponibles dans le commerce, Sciences de la Vie et de BIOQUANT Stereologer (figure 1). En plus de contraste et comparaison des résultats à la fois du BIOQUANT et<em&gt; Stereologer</em&gt; Systèmes, cette étude fournit un protocole détaillé pour la<em&gt; Stereologer</em&gt; Système.

L&#39;organisation anatomique du cerveau des primates peuvent fournir des indications importantes sur les conditions normales et pathologiques chez l&#39;homme. Stéréologie impartiale est une méthode précise et efficace pour l&#39;estimation du nombre de neurones totale (ou autre type cellulaire) dans un espace de référence donnée<sup&gt; 1</sup&gt;.

Sachant ce qui compte: Stéréologie impartial dans le cerveau des primates non humains

Le primate non humain est une espèce translationnelle importante pour comprendre le fonctionnement normal et les processus pathologiques du cerveau humain. De manière impartiale...

Cette procédure commence par la définition de l'espace de référence. Un atlas stéréotaxique peut être utile pour déterminer les limites de la zone d'intérêt. Ensuite, organisez les lames et déterminez la fréquence d'échantillonnage des sections.Insérez la première section à échantillonner dans le microscope et renseignez les paramètres d'échantillonnage. Dans le système tologiste, une grille sera placée sur l'espace de référence et, à chaque intersection, un déssecteur optique sera échantillonné. Une fois que tous les déssecteurs optiques de chaque section ont été échantillonnés, le système stéréologique fournira les résultats de l'étude.Bonjour, je suis le Dr Mark Burke du Laboratoire de neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Montréal. Bonjour, je suis la Dre Shaheen Zur, également du Laboratoire de neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Montréal. Bonjour, je suis le Dr Morris Petto, directeur du Laboratoire de neurosciences visuelles à l'École d'optométrie, Université de Montréal.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'effectuer une radiologie sans biais chez le primate non humain. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour estimer les populations neuronales totales dans diverses régions cérébrales. Commençons donc.Commencez ce protocole avec un cerveau que vous avez préalablement perfusé. Après fixation à l'aide d'un agent fixateur tel que le paraformaldéhyde, le cerveau doit être bloqué dans l'espace stéréotaxique, cryoprotégé et congelé. Pour consulter ces protocoles en détail, reportez-vous à notre récent article publié dans JoVE, intitulé Dissecting the Non-Human Primate Brain.Dans l'espace stéréotaxique, le cerveau doit être sectionné systématiquement de manière à inclure tout l'espace de référence. Pour consulter ce protocole en détail, reportez-vous à notre récent article publié dans JoVE, intitulé « Conservation du cerveau : tirer le meilleur parti de vos échantillons de recherche ». Dans cette expérience, nous utilisons le lobe frontal du cerveau du vervet.La série est définie à une section sur 10 dans tout le cortex et est coupée à 50 micromètres. Pour calculer le nombre estimé de cellules N, nous utilisons l'équation suivante où SSF est la fraction d'échantillonnage des sections et A SF est la fraction d'échantillonnage surfacique.Le FSÉ (fraction d'échantillonnage d'épaisseur) correspond à l'épaisseur mesurée du tissu divisée par la hauteur du dissector, et un cube représente le nombre total d'objets d'intérêt comptés dans le dissector. Pour déterminer la fraction d'échantillonnage de la coupe, il est nécessaire de bien définir tout l'espace de référence, de l'avant vers l'arrière et du dorsal vers le ventral. Ici, nous nous intéressons au lobe frontal, que nous définissons comme la région s'étendant depuis l'extrémité du pôle frontal jusqu'au sillon central et au sillon latéral.À l'exception de l'insula pour le lobe frontal de ce sujet, un total de 760 sections a été systématiquement collecté, dont 76 teintées au violet de crête. Étant donné que l'objectif était de sélectionner 10 sections réparties sur tout l'espace de référence, une section sur six parmi celles teintées au violet de crête a été échantillonnée. Cela conduit à une fraction d'échantillonnage des sections, ou SSF, d'environ une sur 60.Nous commençons aléatoirement par l'une des premières sections colorées en violet crânien et échantillonnons systématiquement le reste selon un prélèvement sur six. Ensuite, un total de 13 sections est prélevé pour le sujet sélectionné. Afin d'éviter les biais dus aux erreurs de reconnaissance, il est impératif de suivre une définition standard pour la caractéristique biologique d'intérêt particulière.Ici, nous souhaitions compter les neurones et avons défini un neurone comme une cellule possédant un noyau visible, situé de manière centrale, et un cytoplasme clairement délimité. Pour cette étude, nous utilisons Stereo, un système informatisé de théologie. Le système invite l'utilisateur à saisir les informations nécessaires de manière progressive.Dans la section des informations sur l'étude, les paramètres de l'étude sont définis. Le paramètre de volume doit être sélectionné afin de définir un espace de référence pour l'étude. Le volume de l'objet peut également être sélectionné ici pour estimer le volume pondéré par le nombre pour la population d'objets d'intérêt.Dans ce cas, seul le volume de l'espace de référence a été sélectionné. Pour chaque objet, sélectionnez le nombre et définissez la caractéristique d'intérêt, ici les neurones. Pour établir les informations d'échantillonnage, saisissez l'intervalle d'échantillonnage de la tranche.Si des tranches séparées de tissu sont découpées de façon exhaustive et que chaque section est placée en ordre séquentiel, saisissez-en une ici. Ensuite, indiquez le nombre total de sections réalisées à travers la référence, puis saisissez l'intervalle d'échantillonnage des sections. Le système calculera alors le nombre de sections à prélever.Pour définir la grille et disséquer une taille, utilisez un faible grossissement compris entre 2,5 et 10 x. Pour définir l'espacement de la grille dans le menu Édition du volume, l'objectif doit être utilisé à un grossissement de 100 x. La surface du cadre correspond à la taille du dissector.Dans ce cas, nous avons utilisé un écran de 50 %. La hauteur du cadre correspond à l'épaisseur du dissector. Ici, elle est fixée à 10 micromètres et déterminera la fraction d'échantillonnage du tissu.L'espacement des trames correspond à la taille de la grille. Pour les zones plus petites, une taille de grille plus réduite doit être utilisée pour ce sujet, et dans le lobe frontal, une taille de grille de 2 500 micromètres donne en moyenne 254 dissector. La taille du dissector doit permettre de comptabiliser entre zéro et cinq objets.Dans ce cas, les neurones, ainsi que la taille du dissecteur et la taille de la grille, sont utilisés pour calculer la fraction d'échantillonnage de la surface. Une fois que les paramètres de l'étude ont été établis, l'échantillonnage à travers le tissu peut commencer en faible grossissement. Le programme invitera l'utilisateur à tracer l'espace de référence sur la coupe.Le système placera ensuite une grille sur la section en fonction des paramètres pro. Cette grille est utilisée pour calculer le volume. Ensuite, l’utilisateur vérifiera que les points se situent dans l’espace de référence.Si un point ne se trouve pas dans l'espace de référence, cliquez simplement sur ce point et il ne sera pas pris en compte dans le calcul du volume. Ensuite, le système placera une nouvelle grille sur l'espace de référence en fonction des paramètres d'espacement des cadres. Les intersections de cette grille déterminent l'emplacement de chaque dissector.Maintenant, vérifiez que les intersections se situent à l'intérieur de l'espace de référence. Le système invite l'utilisateur à passer à l'objectif de plus grande puissance et à déplacer la platine vers le premier dissector. À ce stade, le système demande à l'utilisateur de définir le haut et le bas de la section.Cela est effectué afin de déterminer la fraction d'échantillonnage d'épaisseur (TSF) et sera répété à chaque emplacement du dissector. Pour déterminer l'épaisseur mesurée, focalisez-vous sur le plan Z jusqu'à ce que la première cellule devienne nette. Ensuite, reculez légèrement vers le sommet de la section jusqu'à ce que le dernier objet apparaisse, juste en dehors du foyer.Ensuite, pour trouver le fond du tissu, faites la mise au point à travers le plan Z jusqu'à ce que les cellules soient à peine hors de netteté tout en parcourant le plan Z. Notez que les cellules doivent être colorées à toutes les profondeurs. Dans le cas contraire, cela peut indiquer une pénétration incomplète du colorant ou une déshydratation non uniforme du tissu, auquel cas les sections doivent être reprises.La hauteur par défaut du dissector pour cette étude est de 10 micromètres. La différence entre la hauteur du dissector et l'épaisseur mesurée de la section correspond à la hauteur de garde, qui représente le volume de tissu dans lequel aucune structure biologique n'est comptée. Le système définit ensuite l'espace d'échantillonnage selon l'axe Z.L'utilisateur cliquera ensuite sur chaque objet qui se trouve dans le dissector à travers le plan Z. Les objets qui touchent les lignes rouges ou le fond du dissector ne sont pas comptabilisés. Une fois chaque objet compté, cliquez sur suivant.Cela permet de calculer le nombre total d'objets. La platine se déplacera vers le dissector suivant et répétera les étapes précédentes. Une fois que tous les dissectors de la section ont été comptés, le système invitera l'utilisateur à insérer la section suivante, dans l'ordre séquentiel, à analyser.Les étapes seront répétées jusqu'à ce que toutes les sections séquentielles aient été échantillonnées. Une fois terminé, le système fournira les calculs relatifs à l'échantillonnage de la surface, à l'échantillonnage de la fraction de section, à la fraction d'échantillonnage du tissu et au nombre total d'objets. À partir de ces paramètres, le système générera un volume de référence n estimé ainsi que les coefficients d'erreurs pour le nombre estimé et le volume.Il fournira également des recommandations pour devenir plus efficace ou pour réduire le coefficient d'erreurs. Nous venons de vous montrer comment réaliser une estimation sans biais en théologie sur un spécimen biologique. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se souvenir d'échantillonner systématiquement l'espace de référence dans son intégralité, de mesurer soigneusement l'épaisseur du tissu à chaque dissection optique et de disposer d'un objet d'intérêt bien défini.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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