Name: Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Découvrez comment induire la différenciation lactogène dans les cellules épithéliales mammaires HC11 de souris en formant des mammosphères. Ce protocole permet d'étudier la régulation hormonale de la différenciation mammaire in vitro.

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Les fonds provenant dirigé par le Congrès Fonds de recherche médicale de subvention (DAMD17-01-0264) à ML Cutler et Etats-Unis Militaire Cancer Institute à ML Cutler a soutenu le travail.

<ol><li> Le HC11 cellules ont été cultivées à confluence pendant 6 jours en milieu RPMI 1640 complété avec du sérum de veau foetal à 10%, l&#39;insuline 5μg/ml, HEPES 10 mM, 10ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF) pour établir la compétence. </li><li> Les cellules ont été lavées avec du PBS et maintenus dans un milieu de croissance sans EGF pendant 24 heures. </li><li> Pour induire la différenciation lactogène les cellules sont incubées dans les médias de différenciation, c&#39;est à dire RPMI avec la dexaméthasone (10 -6 M), l&#39;insuline (5 ug / ml) et la prolactine (5 ug / ml) appelé DIP. </li><li> A la fois affirmé après-DIP outre, mammospheres ont été photographiés et énumérés par microscopie à contraste de phase en utilisant un Olympus IX71 microscope avec appareil photo numérique. </li></ol> Les résultats représentatifs: Faible grossissement des monocouches de cellules mammaires normales épithéliales et mammospheres multiples, ainsi que de grossissement de haute puissance d&#39;une seule mammosphere sont présentés dans la figure 1, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="" /> Figure 1. Mammospheres. (A) mammaire normale monocouches de cellules épithéliales devrait être affichée comme une couche plane de cellules confluentes. (B) Après 3-5 jours de la stimulation DIP mammospheres multiples apparaissent. Photographie prise cinq jours après DIP addition. (C) Plus fort grossissement d&#39;un champ unique contenant mammospheres à 5 jours après l&#39;ajout DIP.

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

Pour que cette technique soit réussie et de la meilleure qualité, les cellules épithéliales doivent être maintenues à confluence avant d&#39;être induites par des hormones lactogènes. Il peut y avoir des situations où il ya de nombreuses mammospheres, ce qui rend la quantification difficile. Ainsi, à des fins quantitatives, il est préférable de photographier les mammospheres à un point alors que le nombre de mammospheres est capable d&#39;être comptés. Bien qu&#39;il existe différents marque...

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

souris cellules épithéliales mammaires forme mammospheres cours de la différenciation lactogène

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Une mesure phénotypique communément utilisé pour déterminer le degré de différenciation dans le lactogène mammaire de la souris des cultures de cellules épithéliales est la formation de structures cellulaires en forme de dôme appelé mammospheres<sup&gt; 1</sup&gt;. La ligne HC11 cellule a été employé comme un système modèle pour l&#39;étude de la régulation de la différenciation lactogène mammaires fois<em&gt; In vitro</em&gt; Et<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 2</sup&gt;. Le HC11 cellules se différencient et synthétisent les protéines de lait dans la réponse au traitement avec des hormones lactogènes. Suite à la croissance de la souris HC11 cellules épithéliales mammaires à confluence, la différenciation a été induite lactogène par l&#39;ajout d&#39;une combinaison d&#39;hormones lactogènes dont la dexaméthasone, d&#39;insuline, et la prolactine, appelé DIP. Le HC11 cellules induites à se différencier ont été photographiés à des moments jusqu&#39;à 120 heures après l&#39;induction de la différenciation et le nombre de mammospheres qui est apparu dans chaque culture a été dénombrée. La taille de la mammospheres individuelle est corrélée avec le degré de différenciation et cela est représenté dans les images des cellules différenciées.

HC11 différentiation lactogène peut être caractérisée par la formation de structures en forme de dôme appelé mammospheres. Les structures peuvent être énumérés par microscopie à contraste de phase afin d&#39;aider à quantifier différentiation lactogène.

Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

Une mesure phénotypique couramment utilisée pour déterminer le degré de différenciation lactogène dans les cultures de cellules épithéliales mammaires de souris est la formation de...

Bonjour, je suis Bethany Morrison du laboratoire de la Dre Mary Lou Cutler, du Département d’anatomie pathologique de l’Université des sciences de la santé des services uniformisés. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure permettant la formation de mammosphéroïdes à partir de cellules épithéliales mammaires murines HC 11. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la lactodifférenciation.Commen&ccedil;ons. Pour commencer ce protocole, les cellules HC 11 sont cultiv&eacute;es jusqu'&agrave; confluence pendant six jours dans un milieu RPMI 1640, suppl&eacute;ment&eacute; avec 10 % de s&eacute;rum de veau f&oelig;tal, 5 microgrammes par millilitre d'insuline, 10 micromolaire de HEPES et 10 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance &eacute;pidermique (EGF), afin d'&eacute;tablir la comp&eacute;tence.Ces cellules ont été largement utilisées par les laboratoires de Nancy Hines et de Bernard Groner pour étudier la régulation de la différenciation génique sous la hotte de culture cellulaire. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS et maintenues dans un milieu de croissance sans EGF pendant 24 heures. Après cette incubation, les cellules sont incubées dans un milieu de différenciation composé de RPMI enrichi de dexaméthasone, d'insuline et de prolactine afin d'induire une différenciation lactogène après incubation.Dans le milieu de différenciation, un microscope Olympus IX 71 équipé d'une caméra numérique est utilisé pour photographier et dénombrer les sphéroïdes mammaires. Par microscopie en contraste de phase, les sphéroïdes mammaires sont photographiés et dénombrés plusieurs fois au cours des 120 heures suivant l'induction. Cette image montre un grossissement faible d'une mémoire normale.Les cellules en monocouche épithéliale doivent être maintenues à confluence pendant environ trois jours avant d'être stimulées par des hormones géniques. Voici une observation de nouveaux mammosphéroïdes formés trois jours après l'induction, observés en grossissement faible. Ils commencent à apparaître sous forme de petites structures en dôme, espacées de manière aléatoire parmi les cellules épithéliales.À nouveau à faible grossissement. Voici une vue de plusieurs mammosphères qui se sont développées cinq jours après l'induction. Les mammosphères ont continué de croître à la fois en taille et en nombre ; ici, en fort grossissement, la caractéristique en forme de bulle ou de dôme de la mammosphère est clairement visible.Nous venons de vous montrer comment induire des cellules épithéliales afin qu'elles forment des sphéroïdes mammaires, utilisés comme marqueurs de la différenciation génique. Lors de cette procédure, il est important de maintenir les cellules en confluence avant l'induction, car durant cette période, les cellules produisent des protéines matricielles avec lesquelles elles doivent interagir pour être pleinement capables de répondre aux hormones géniques. Il est également essentiel de retirer l'EGF du milieu avant le traitement, car l'EGF inhiberait le processus de différenciation.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Biology

Biologie

Cette méthode décrit comment disséquer et d'évaluer le développement des glandes mammaires et de la fonction de souris. Excisées glandes mammaires sont évalués pour le degré de développement en utilisant mount ensemble, tandis que l'éjection du lait est évaluée en utilisant une ocytocine essai basé sur la contraction des cellules myoépithéliales.

Evaluation de développement des glandes mammaires et fonction dans des modèles murins

Une méthode simple est décrite pour analyser les effets de fibroblastes de tissus sur les cellules épithéliales associées. La combinaison de cette méthode et la culture de tissus en trois dimensions peut faciliter l'analyse des cellules après l'isolement de la 3D. La technique est applicable à des cellules plus ou moins de potentiel malin, permettant l'étude systématique des effets de associé à une tumeur du stroma sur les cellules tumorales.

Isolement des cellules épithéliales mammaires à partir de trois dimensions de cellules mixtes Sphéroïde Co-culture

Cette vidéo décrit l’isolement des cellules souches cancéreuses des lignées cellulaires du cancer du sein. Nous cultivons ces cellules souches cancéreuses pour générer des mammosphères primaires permettant d’évaluer l’auto-renouvellement et de calculer l’efficacité de formation des sphères, ce qui permet de comparer différentes densités d’ensemencement.

Génération de mammosphères primaires : une technique pour déterminer l’activité cellulaire

Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant&gt; 6 mois.

Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres

Les dosages de mammosphère flottante peuvent étudier le sous-ensemble de cellules cancéreuses du sein de type souche qui survivent en suspension et présentent une tumorigenèse accrue lorsqu’elles sont implantées chez la souris.  Ce protocole fournit une mesure in vitro pratique de la capacité de formation de sphères, un indicateur de la tumorigenèse in vivo, tout en facilitant l’analyse du paysage transcriptionnel associé aux tiges.

Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.

Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Ce protocole décrit des méthodes pour purifier, quantifier et caractériser les vésicules extracellulaires (EV) / les exosomes provenant de cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses et pour les utiliser pour transférer la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules épithéliales mammaires luminescentes. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige peuvent transférer cette propriété cellulaire vers des cellules qui ingerent les EV /...

Transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes

Nous décrivons des techniques pour l’induction de différenciation de deux lignes épithéliales de sein, HC11 et EpH4. Tandis que les deux exigent le sérum foetal de veau, l’insuline, et la prolactine pour produire des protéines de lait, les cellules d’EpH4 peuvent entièrement différencier dans les mammospheres dans la culture tridimensionnelle. Ces modèles complémentaires sont utiles pour les études de transduction de signal de différenciation et de néoplasie.

Différenciation des cellules Epithéliales De l’épithélial de souris HC11 et EpH4

Ici, nous décrivons la mise en œuvre et l'interprétation des résultats d'un essai quantitatif d'auto-renouvellement de la mammosphère in vitro.

Quantification de l'auto-renouvellement dans les cultures de la mammosphère murine

La glande mammaire est une structure bilayered, comprenant des cellules épithéliales myoépitheliales et internes intérieures. Présenté est un protocole pour préparer les organoïdes à l’aide de la trypsinisation différentielle. Cette méthode efficace permet aux chercheurs de manipuler séparément ces deux types de cellules pour explorer les questions concernant leurs rôles dans la forme et la fonction des glandes mammaires.

Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

Ce protocole décrit la méthode de mise en place du test de formation de la mammosphère pour étudier la steminité cancéreuse induite par l’inhibiteur de l’apoptose 5 (Api5) dans les cellules épithéliales mammaires non tumorigènes. Les lysats collectés dans des mammosphères de génération primaire sont analysés pour identifier différents marqueurs de tige afin d’évaluer l’induction de propriétés similaires à celles des cellules souches.

Le test de la mammosphère révèle une tige induite par Api5 dans les lignées cellulaires épithéliales mammaires non tumorigènes

Découvrez comment induire la différenciation lactogène dans les cellules épithéliales mammaires HC11 de souris en formant des mammosphères. Ce protocole permet d'étudier la régulation hormonale de la différenciation mammaire in vitro.

Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

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