Préparation standardisée des suspensions unicellulaires provenant de tissus pulmonaires de la souris en utilisant les dissociateur gentleMACS

Dans ce protocole vidéo, vous verrez comment dissocier le tissu pulmonaire d’une souris adulte à l’aide d’un max doux après dissociation du tissu pulmonaire. En présence de collagénase D et d’ADNAS, les suspensions à une cellule sont filtrées à l’aide d’une centrifugeuse à crépine de 70 microns et mises en suspension pour d’autres applications. Bonjour, je m’appelle Melanie Mlu et je travaille chez Mil Biotech en Allemagne.

Aujourd’hui, je vais vous montrer une procédure reproductible et automatisée pour la préparation d’une suspension unicellulaire à partir de tissu pulmonaire de souris en utilisant la dissociation GenX. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour préparer des suspensions de cellules uniques pour la préparation de leucocytes ou de cellules endothéliales. D’accord, commençons.

Avant de commencer le protocole, quelques solutions standard doivent être préparées et prêtes à l’emploi. Tout d’abord, nous aurons besoin du tampon Hebes. Deuxièmement, une solution de collagénase D contenant 100 milligrammes par millilitre d’enzyme et un tampon hebes.

Troisièmement, une solution de dase one contenant 20 000 unités par millilitre de dase one. Enfin, deux solutions de mise en mémoire tampon courantes. Un tampon PBS typique à pH 7,2 et un tampon PEB dérivé de la solution de rinçage AutoMax et de la solution mère BSA.

Nous commençons notre protocole avec un poumon disséqué dérivé d’une souris femelle à biopsie âgée de six à sept semaines. Assurez-vous que le poumon est exempt d’organes adjacents tels que le cœur et le thymus, les vaisseaux sanguins efférents et afférents, la trachée et les tissus conjonctifs. Rincez le tissu dans une boîte de Pétri contenant du PBS pour éliminer les érythrocytes.

En règle générale, un poumon de souris à cet âge pèse entre 110 et 150 milligrammes. Si vous envisagez d’associer des poumons d’animaux plus âgés ou d’autres souches de souris, pesez le tissu et tamponnez. Un maximum de 450 milligrammes de tissu peut être dissocié par tube.

Transférez le tissu pulmonaire dans un tube C max doux chargé de 4,9 millilitres de tampon heis. Ajoutez 100 microlitres de solution de collagénase D à une concentration finale de deux milligrammes par millilitre dans le tissu pulmonaire et le tampon. Maintenant 10 microlitres dase.

Une solution pour plus de 150 milligrammes de tissu. Ajouter 20 microlitres de dase une solution. Assurez-vous que le tube C est bien fermé et placez-le à l’envers sur le doux max dis.

Assurez-vous que le tissu est situé entre le rotor et le stator. Sélectionnez le programme pulmonaire et exécutez-le en appuyant sur le bouton de démarrage à la fin du programme. Retirez le tube C de l’instrument et incubez l’échantillon pendant 30 minutes.

Dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant l’incubation, le tube doit être tourné à l’aide du rotateur de tube max mix ou tourné manuellement toutes les cinq minutes. Après l’incubation, retournez le tube C dans l’associateur doux max et exécutez le deuxième programme pulmonaire Pendant que le programme est en cours, préparez un tube de 50 millilitres pour collecter les cellules filtrées en remplaçant le capuchon par une crépine de cellules à mailles de 70 micromètres. Une fois le programme dissocié terminé, en fonction de la répartition de l’échantillon dans le tube, vous voudrez peut-être centrifuger brièvement le tube pour concentrer l’échantillon.

Les cellules dissociées peuvent être retirées du tube par pipetage à travers le capuchon scellé au septum du tube C. À l’aide d’une pointe de pipette appropriée de 1000 microlitres, la suspension cellulaire est appliquée sur la crépine cellulaire pour éliminer les particules ou les agrégats plus gros. Une fois la solution égouttée, lavez la crépine cellulaire en ajoutant cinq millilitres supplémentaires de tampon à température ambiante et de tampon pour granuler les cellules filtrées.

Centrifugez le tube de 50 millilitres à 300 GS pendant 10 minutes. Aspirez maintenant le surnageant et mettez en suspension la pastille cellulaire dans le volume souhaité de température ambiante. Tampon PEB.

Ne décantez pas le surnageant. Vous pouvez maintenant passer à votre application en aval. La dissociation du tissu pulmonaire de souris à l’aide de cette procédure produira un pourcentage élevé de leucocytes et de cellules endothéliales viables.

Les suspensions unicellulaires dérivées ont été colorées avec du CD 45 PE sous forme de CD 1 46 FITC ou CD 31 FITC, et analysées par cytométrie en flux. Ce graphique montre l’enrichissement des cellules dendritiques à l’aide de microbilles de CD 11 C, d’un séparateur minimax et de deux colonnes MS. D’accord. Je viens de vous montrer comment préparer des suspensions unicellulaires à partir de tissu pulmonaire de souris de manière standardisée en utilisant la dissociation douce et les tubes C.

Cette méthode permet la dissociation tissulaire efficace et générale. Lors de cette procédure, il est important de disséquer correctement le poumon et de traiter le tissu immédiatement après la dissection. Les suspensions unicellulaires préparées peuvent ensuite être utilisées pour d’autres expériences.

Par exemple, le marquage magnétique des cellules, puis la séparation des leucocytes ou des cellules endothéliales. D’accord, c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.