Name: Préparation Cell Block de cytologie avec une prédominance de cellules individuellement épars (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Apprenez la méthode de Shidham pour préparer des blocs cellulaires à partir de cellules éparses en cytologie. Cette technique utilise le marqueur AV et le HistoGel pour améliorer l'analyse des profils immuno et des colorations spéciales.

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Les auteurs remercient Chris Chartrand, HT (ASCP) pour démontrer la section de coupe du bloc de cellules avec un marqueur AV.

Introduction: Ceci est une vidéo décrivant la méthode pour la préparation Shidham bloc cellulaire du liquide à base de cytologie (LBC) spécimen à l&#39;aide HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Par rapport à d&#39;autres approches aléatoires, les suivantes sont les deux caractéristiques essentielles de ce protocole pour la préparation de blocs de cellules à partir de spécimens relativement aux seules hypocellulaires dispersés cellules perdent (1-5). <ol><li> Ce protocole comporte des mesures pour concentrer les cellules le long du plan parallèle à la surface de coupe du bloc cellulaire. </li><li> Il inclut également une intégration comme une balise sombre de AV-marqueur (figure 1b), qui sert à deux fins suivantes: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Pour visualiser le niveau auquel les cellules sont concentrées. La zone du bloc de cellules avec les cellules d&#39;intérêt aujourd&#39;hui pourrait être visualisé par l&#39;histotechnologist lorsque la balise de couleur foncée est exposé pendant la coupe. Cette capacité à surveiller les empêche de couper à travers le niveau avec la plupart des cellules, ou ne pas couper trop superficielle dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l&#39;échantillon. </li><li> Pour servir comme point de référence de localisation dans la section du bloc cellulaire de série sur les différentes diapositives. Ce point de référence agit comme un phare pour aider à localiser les cellules ou groupes de cellules pour l&#39;évaluation d&#39;un modèle immunoréactivité coordonner avec l&#39;approche SCIP (6,7). </li></ol></li></ol> PROTOCOLE (figure 2) Préparation de l&#39;échantillon. <ol><li> Transférer le spécimen résiduelle LBC cytologie cervicale à un tube de verre à fond plat (15mm de diamètre x 45mm) (figure 2.1 à 2.4). Placez le tube de verre dans un tube en plastique plus grand transporteur (28 x 85mm) et centrifugeuse. Retirer le tube à fond de verre du tube transporteur et éliminer le surnageant. </li><li> Le tube de verre est alors plafonné (pour éviter les déversements d&#39;eau de chauffage dans l&#39;étape suivante) et replacé dans un grand tube à fond plat en plastique porteuse </li><li> Le tube en plastique support contenant le tube de verre est alors plafonné, placé dans une centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, Rayon-17cm de rotor) pendant cinq minutes (figure 2.5). </li><li> Les tubes sont ensuite retirés à la verticale de la centrifugeuse et le tube de verre plus petit est retiré avec une pince à partir du tube en plastique plus grand transporteur, sans perturber le culot de cellules sédimentées. </li><li> Le tube en verre avec spécimen est non plafonnés et le surnageant est vidé en prenant soin de ne pas perturber la couche plane de cellules sédimentent au fond (figure 2.6). </li></ol> L&#39;inclusion de la coordonnée de référence AV-marqueur et plus de gel <ol><li> Une balise noire AV-marqueur (environ 2 mm x 2 mm taille, plane surface, fragment de couleur foncée, le matériel sectionnable) (figure 3) est ajouté comme un poteau indicateur sur le tube de verre (Figure 2.7). </li><li> Liquéfier une aliquote de HG en le fondant au micro-ondes pendant 10 secondes à puissance moyenne. </li><li> Ajouter 0,5 ml de HG fondu pour le tube, mélanger avec le sédiment rapidement, et il récapitulation (figure 2.8) (Passez à l&#39;étape suivante rapidement sans laisser le HG pour commencer à se solidifier). </li><li> Ajoutez environ 2,5 ml d&#39;eau tiède (45 ° C) de l&#39;eau dans le tube en plastique de support (Figure 2.9). </li><li> Le tube de verre plus petit plafonné est placé à l&#39;intérieur du tube en plastique avec de l&#39;eau tiède. (Cette étape est nécessaire pour garder le HG de se solidifier au cours des prochaines étapes) (Figure 2.9). </li><li> Le tube en plastique transporteur est placé dans la centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, le rayon-17cm de rotor) pour cinq minutes. Le but de cette étape de centrifugation est de pousser le marqueur AV et pour concentrer les cellules dans une couche proche de la surface de coupe du bloc cellulaire de paraffine finale embarqués (figure 1d). </li><li> Les tubes sont ensuite retirés doucement et verticalement à partir de la centrifugeuse en prenant soin de ne pas perturber la couche sédimentée mince avec des cellules de l&#39;échantillon dans le fond. </li><li> Le tube en plastique est plus non plafonnés et le tube de verre plus petit est retiré verticalement par une pince sans déranger la couche de sédiments de cellules spécimen. </li><li> Le petit tube de verre est réfrigéré en position verticale pendant 15 minutes pour refroidir et se solidifier l&#39;HG (figure 2.11). </li></ol> Retrait du bloc cellulaire comme un bouton de gel avec un spécimen pour le traitement final <ol><li> Le disque HG solidifié, avec la couche de concentré / sédiments spécimens au fond est délogé du tube de verre à fond plat en injectant formol à 10% grâce à une aiguille de calibre 23 avec la seringue (figure 2.12). </li><li> L&#39;aiguille est insérée sur le côté du tube à la périphérie du disque de HG solidifié avec éprouvette (figure 2.12). </li><li> Le needle est tournée sur le côté du tube tout en formol est lentement poussé par la seringue. Il en résulte la séparation de la touche HG avec balise de couleur foncée AV-marqueur et le spécimen concentré dans ce fond plat de la du tube de verre (figure 2.12). </li><li> Le bloc de cellules (bouton de gel avec des cellules spécimen) est ensuite placé dans une cassette étiquetés et soumis pour le traitement des tissus à préparer des blocs de paraffine cellulaire embarqué (figure 2.13). </li></ol> Intégration et la coupe de l&#39;échantillon <ol><li> Le disque est inclus dans la paraffine avec le côté sombre de marqueur balise bas que la surface de coupe (figure 1). </li><li> Le bloc est sectionné jusqu&#39;à ce que la couleur foncée AV-marqueur comme un phare est exposée et visible. </li><li> Trois à quatre sections microns sont coupés de ce niveau qui devrait contenir la plupart des cellules dispersées individuellement à partir du spécimen. </li><li> Les coupes sont recueillies sur la lame de verre pour la coloration de loin, la coloration immunohistochimique, ou d&#39;autres tests comme indiqué. Les protocoles de ces essais, y compris le type de diapositives à utiliser pour le montage des sections peuvent varier. Généralement pour immunocoloration, des lames recouvertes sont utilisés pour l&#39;empêcher de flotter et de perte de sections de la glisse lors des étapes immunomarquage. </li></ol> Abréviations utilisées (par ordre alphabétique): CISH, chromogène tests d&#39;hybridation in situ; FISH, fluorescent tests d&#39;hybridation in situ; FFPE, fixés au formol et inclus en paraffine; FNA, aspiration à l&#39;aiguille fine; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, liquide cytologie; réaction PCR polymerase chain; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La structure du bloc cellulaire préparé par le protocole de Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Le résumé des différentes étapes de préparation du bloc cellulaire spécimen LBC par le protocole de Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Préparation d&#39;AV-marqueur de pelures de banane. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Comparaison des blocs de cellules et sections, avec et sans AV-marqueur. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Comparaison des cellularité des sections du bloc cellulaire avec et sans AV-marqueur.

<ol><li>Shidham, V. B., Epple, J. Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShidham%2C+VB+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. Forthcoming.</li>
<li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens. Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. 2009 Mar 7-13, Boston, Ma, , Abstract 424 97a-97a (2009).</li>
<li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li>
<li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22CytoJournal%22%5BJournal%5D)">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li>
<li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytol%22%5BJournal%5D)">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li>
<li>Atkinson, B. F. Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtkinson%2C+BF+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).</li>
<li>Shidham, V. B. Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShidham%2C+VB+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).</li>
</ol>

Blocs cellulaires sont un outil précieux pour l&#39;évaluation des différents échantillons de cytologie (1). Surtout, en plus des détails architecturaux de l&#39;échantillon, les blocs cellulaires permettent l&#39;évaluation des études auxiliaires tels que l&#39;immunocytochimie, fluorescent / chromogène tests d&#39;hybridation in situ (FISH / CISH) et in-situ de PCR. Une variété de méthodes pour la préparation du bloc cellulaire sont décrites. Cependant, la plupart d&#39;entre eux sont adaptés pour les échantillons de cytologie non gynécologique qui contiennent des cellules relativement nombreuses et avec microfragments tissus tels que dans les aspirations FNA et certaines sérosités tels que les épanchements (1,3,4,5). Parce que les blocs de cellules surtout l&#39;occasion pour l&#39;évaluation immunocytochimiques, leur traitement doit être de préférence similaire à celle de l&#39;fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) des tissus. Finalement, les résultats obtenus après évaluation immunocytochimique de sections bloc cellulaire sont comparés à ceux de la littérature publiée réalisée principalement sur des coupes de tissus FFPE. Toute modification dans le protocole potentiellement compromettre et d&#39;annuler la validité des résultats obtenus sur des blocs de cellules traitées par fixateurs différents et des séquences de réactifs autres que ceux utilisés pour la FFPE routine. Certaines techniques commerciales peuvent avoir l&#39;inconvénient de traitement à travers un protocole d&#39;exposition à d&#39;autres fixateur-réactif exposition. Diverses méthodes de préparation des blocs de cellules sont disponibles pour les spécimens avec une quantité importante de sédiments et de fragments de tissus. Principalement, les sédiments sont concentrées soutenu par un peu de gel ou d&#39;un principe de coagulation. Le bouton manoeuvrable est alors inclus dans la paraffine après traitement, comme les spécimens de pathologie chirurgicale / biopsies. Les gels utilisés comprennent la gélatine, l&#39;agar, le fibrinogène / plasma-thrombine, et autres gels commerciaux tels que HG. Les méthodes de concentration varient de granulation simple des sédiments par centrifugation à la concentration de cellules le long de divers types de membranes. Les exemples incluent: Milipore, collodin (celloïdine) sacs ou racler les cellules du frottis cytologique sur lames de verre (1). Nous avons aussi évalué une variété de gels en essayant différentes combinaisons d&#39;agar-agar et la gélatine. Aucune des combinaisons atteint la consistance d&#39;une entreprise assez pour obtenir un disque facile à manœuvrer de gel solidifié avec des cellules intégrées de l&#39;échantillon en un seul morceau. HG a montré une cohérence appropriée et dans notre expérience les résultats immunomarquage sur des sections de HG bloc cellulaire ont été excellents. La cytologie liquide (LBC) pour la cytologie cervico spécimens sont généralement moins cellulaires que les non-gynécologiques spécimens comme mentionné plus haut. En outre, les spécimens gynécologiques LBC contiennent majoritairement individuels dispersés exfoliée cellules superficielles de la muqueuse cervico. Pour cette raison, la cellularité appropriées dans les sections bloc cellulaire ne peut être atteint sans une approche particulière. Comme ces seules éparpillées composants cellulaires dans le bloc de la ne peut pas être vu par le histotechnologist lors de la coupe la section, le niveau auquel les cellules commencent à apparaître dans les sections ne peuvent pas être appréciés et peuvent être oubliées, soit en coupant passé le niveau avec la plupart des cellules ou non couper assez profondément dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l&#39;échantillon (figure 4). Protocole Shidham de traite à la fois de ces questions en utilisant HG que l&#39;intégration des équipements de laboratoire moyen et conventionnelles (2) (figure 2). Ce protocole comporte deux caractéristiques principales suivantes (figure 1): <ol><li> Concentration et l&#39;alignement des seules cellules dispersées dans un plan étroite adjacente et parallèle à la surface de coupe du bloc cellulaire (figure 5). </li><li> L&#39;inclusion d&#39;une balise de type sombres AV-marqueur comme un poteau indicateur. Cela est essentiel pour atteindre les caractéristiques suivantes: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Identifier et surveiller le niveau auquel les cellules sont concentrées dans le bloc cellulaire. L&#39;exposition du panneau de couleur foncée souligne le niveau auquel la plupart des cellules seules éparpillées dans le bloc cellulaire devraient être situés (figure 4). Cela empêche la surexploitation (découpe passé le niveau avec la plupart des cellules) ou une sous-cotation (ne pas couper assez profondément dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l&#39;échantillon) dans le bloc cellulaire et permettre la sélection des sections du niveau dans le bloc cellulaire correspondant à la plus forte concentration des cellules. </li><li> Le panneau de couleur foncée dans les sections sert aussi de point de référence pour l&#39;enquête et identifier exactement les mêmes cellules dans les différentes sections de série du bloc cellulaire sur des lames différentes (figure 4). Cela est essentiel tout interpréter et évaluer les propriétés de coordonner immunoprofile telles des cellules notamment par l&#39;approche SCIP à suivre les mêmes cellules dans les différentes sections (6,7). </li></ol></li></ol> Bien que ousr le protocole est normalisé et signalés pour liquide à base de spécimens cytologie cervicale, il peut également être utilisé pour améliorer le rendement diagnostique de nombreuses autres non gynécologique spécimens tels que des fluides épanchement, FNA, brossages, contenu du kyste etc En outre, le marqueur AV serait de faciliter l&#39;amélioration application de l&#39;approche SCIP lors de l&#39;évaluation immunohistochimique de sections de bloc cellulaire de ces spécimens. Le milieu d&#39;inclusion peuvent être remplacés par d&#39;autres réactifs avec les modifications appropriées aux étapes pertinentes. HG peut être remplacée par du plasma (fibrinogène) pour être gélifiée par la thrombine à la température ambiante (1).

préparation cell block de cytologie avec une prédominance de cellules individuellement épars

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Cette vidéo montre la méthode Shidham pour préparation des blocs de cellules de liquide à base de spécimens de cytologie cervico contenant des cellules dispersées individuellement et les groupes à petites cellules. Cette technique utilise HistoGel (Thermo Scientific) avec un équipement de laboratoire conventionnels. L&#39;utilisation de sections de bloc cellulaire est un outil précieux auxiliaires pour l&#39;évaluation de la non-cytologie gynécologique. Ils permettent d&#39;étudier l&#39;cytopathologiste supplémentaires détails morphologiques spécimen, y compris l&#39;architecture de la lésion. Surtout, ils permettent l&#39;évaluation des études auxiliaires tels que l&#39;immunocytochimie, tests d&#39;hybridation in situ (FISH / CISH) et in situ la réaction en chaîne polymérase (PCR). Les techniques traditionnelles de préparation des blocs cellulaires ont surtout été appliquée aux non-échantillons de cytologie gynécologique, typiquement pour des épanchements de liquide corporel et cytoponctions. Liquide à base de spécimens cervico sont relativement moins cellulaire que leurs homologues non-gynécologique avec de nombreuses cellules individuelles dispersées. Pour cette raison, la cellularité adéquate dans les sections bloc cellulaire est difficile à réaliser. En outre, le sectionnement histotechnologist le bloc ne peut pas visualiser le niveau auquel les cellules sont à la concentration maximale. Par conséquent, il est difficile de contrôler le niveau approprié au cours de laquelle des sections peuvent être sélectionnés pour être transférés à des lames de verre pour les tests. En conséquence, la zone du bloc de cellules avec les cellules d&#39;intérêt peut être manqué, soit en coupant passé ou ne pas couper assez profond. Protocole actuel pour la méthode Shidham aborde ces questions. Bien que ce protocole est normalisé et rapportées pour des échantillons liquides cytologie gynécologique base, il peut également être appliquée aux non-gynécologiques spécimens tels que des fluides épanchement, FNA, brossages, kyste etc contenus pour une meilleure qualité de matériel de diagnostic dans les sections de bloc cellulaire.

Shidham la méthode de préparation des blocs de cellules avec AV-marqueurs dans les échantillons de cytologie contenant des cellules dispersées individuellement et les groupes à petites cellules.

Préparation Cell Block de cytologie avec une prédominance de cellules individuellement épars

Cette vidéo présente la méthode de Shidham pour la préparation de blocs cellulaires à partir de prélèvements de cytologie cervico-vaginale en milieu liquide contenant des...

La préparation du bloc cellulaire commence par le transfert des cellules du prélèvement concentré dans un tube en verre à fond plat placé dans un tube plus grand. Les cellules sont ensuite déposées au fond par centrifugation avant l'ajout du marqueur AV et de l'HistoGel fondu. L'ajout d'eau tiède dans le tube en verre support garantit que l'HistoGel reste liquide.Une centrifugation ultérieure pousse le marqueur de valve auriculo-ventriculaire à travers le gel et concentre les cellules en une couche proche de la surface de coupe du bloc cellulaire. Une fois solidifié, le bouton de gel peut être retiré et préparé pour l'incorporation dans la paraffine. Bonjour, je suis le Dr George Varszegi, du service de cytologie du Département d'anatomie pathologique du Medical College of Wisconsin à Milwaukee, Wisconsin.Et je suis le Dr Vsam, également issu du service de cytopathologie du département d’anatomie pathologique du Medical College of Wisconsin à Milwaukee. Aujourd’hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de préparer des blocs cellulaires à partir de prélèvements cytologiques comportant majoritairement des cellules isolées. Nous utilisons cette méthode afin d’étudier le profil immunohistochimique des cellules présentes sous forme de cellules isolées dans les coupes de blocs cellulaires, ainsi que pour l’analyse de colorations spéciales sur ces coupes.Commençons. Pour commencer cette procédure, transférez environ 0,5 millilitre de l'échantillon, de préférence concentré, dans un tube en verre de fond plat de 45 millimètres de longueur et de 15 millimètres de diamètre. Ensuite, placez le tube en verre dans un tube porteur en plastique de grand format à fond plat et centrifugez à 1800 G pendant cinq minutes à température ambiante.Après la centrifugation, retirer le tube en verre à fond plat du tube porteur en plastique et verser délicatement le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber la couche plate de sédiment cellulaire au fond. Un marqueur sombre sur Johnny Vena ou un marqueur AV est ajouté aux cellules comme repère.Une fois les cellules incluses, un marqueur AV sert à identifier le niveau auquel les cellules sont concentrées dans le bloc de paraffine. À l’aide d’une pipette spéciale, ajoutez un cube de marqueur AV à surface plate, préalablement préparé, aux cellules présentes dans le tube. Commencez ensuite le processus d’ajout du gel : liquéfiez un aliquot de gel d’histologie ou HG en le faisant fondre au micro-ondes pendant 10 secondes à puissance moyenne, ou suivez les instructions du fabricant.Ajoutez 0,5 millilitres du HG fondu dans le tube contenant les cellules sédimentées. Mélangez rapidement et refermez le tube. Passez immédiatement à l'ajout d'environ deux millilitres et demi d'eau tiède à 45 degrés Celsius dans le tube en plastique porteur.Insérez ensuite le tube CAPA contenant les cellules, le marqueur AV et l'HistoGel. Manipulez rapidement et utilisez de l'eau tiède pour éviter que le gel ne durcisse durant les étapes suivantes. Centrifugez ensuite pour faire pénétrer le marqueur AV à travers le gel et concentrer les cellules en une couche qui sera plus proche de la surface de coupe du bloc cellulaire inclus dans la paraffine.Utilisez des godets rotatifs et non des godets à angle fixe afin que les cellules se concentrent perpendiculairement au fond plat du tube en verre, puis effectuez une centrifugation à 1800 G pendant cinq minutes à température ambiante. Une fois la centrifugation terminée, retirez délicatement et verticalement les tubes de la centrifugeuse en prenant soin de ne pas perturber la fine couche de sédiment cellulaire au fond. À l’aide de pinces, retirez le petit tube en verre verticalement sans perturber la couche de sédiment des cellules de l’échantillon.Enfin, réfrigérez le petit tube en verre en position verticale pendant 15 minutes afin de refroidir et solidifier le gel. Au terme des 15 minutes, procédez au retrait du gel contenant les cellules du tube en verre pour extraire le disque d'HG solidifié, qui contient une couche d'échantillon concentré au fond ainsi que le marqueur AV de couleur foncée. Utilisez une aiguille de calibre 23 fixée à une seringue remplie de formol à 10 %.Commencez par insérer l'aiguille le long du côté du tube, en périphérie du disque d'HG solidifié. Poursuivez en faisant tourner l'aiguille le long de la paroi du tube tout en poussant lentement la solution de Formine à travers la seringue. Observez la séparation du bouton d'HG du fond plat du tube en verre.Le bouton de gel séparé contenant le marqueur de balise AV de couleur foncée et l'échantillon concentré est appelé finition de bloc cellulaire en plaçant le bloc cellulaire dans une cassette étiquetée et en le soumettant au traitement tissulaire afin de préparer des blocs cellulaires inclus en paraffine. Une fois le bloc cellulaire inclus, procéder à la coupe de l'échantillon en commençant par découper le disque du bloc cellulaire inclus en paraffine ; monter le bloc cellulaire inclus en paraffine sur la microtomeuse et effectuer une coupe grossière pour aplanir la surface du bloc de paraffine et exposer le disque du bloc cellulaire jusqu'à ce que le marqueur AV de couleur foncée soit exposé et clairement visible. Une fois le marqueur AV de couleur foncée exposé, réaliser des coupes de trois à quatre micromètres d'épaisseur.Ces sections contiennent des cellules concentrées provenant du spécimen d'origine. Récoltez chaque section sur une lame de verre pour une coloration ultérieure suivie d'une microscopie. Ici, à faible grossissement, nous observons l'impact de l'inclusion d'un marqueur de pelure de banane encré dans le spécimen sur la cellularité de ces sections colorées à l'hématoxyline et à l'éosine.On peut voir sur l'image de gauche que ce marqueur permet de surveiller la profondeur de coupe des sections afin d'obtenir le niveau présentant une bonne cellularité. Le marqueur AV permet également de suivre l'orientation de différentes cellules, en particulier des sections, sur différentes coupes sériées réalisées sur d'autres lames en verre à l'aide du marqueur. En l'absence de ce marqueur, la profondeur de coupe ne pourrait pas être surveillée.Des échantillons de tissu ont été prélevés au niveau d'un plan de sectionnement présentant une faible cellularité. Le degré de cellularité présent dans les échantillons est encore plus évident en fort grossissement ; avec le marqueur AV présent, la profondeur de coupe peut être facilement surveillée, ce qui permet d'éviter aisément la récupération d'échantillons présentant une faible cellularité. Nous vous avons montré une méthode permettant de préparer le bloc cellulaire à partir d'un prélèvement composé de fragments et de cellules dispersés de manière lâche.Le marqueur AV sombre, que nous avons ajouté lors du traitement du bloc cellulaire, permet de sélectionner les sections présentant la plus forte concentration de cellules. Il permet également d'orienter correctement ces sections sur les lames en verre. Il est important que l'HistoGel soit à l'état fondu pendant que les cellules s'alignent le long du fond en verre du tube, qui constitue la surface de coupe.Cependant, cette procédure pourrait être modifiée pour d'autres méthodes, y compris les méthodes à froid telles que la thrombine, le fibrinogène, par des modifications appropriées. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos procédures.Merci.

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Ce protocole de fractionnement permettra aux chercheurs d’isoler des protéines cytoplasmiques, nucléaires, mitochondriales et membranaires à partir de cellules de mammifères. Les deux dernières fractions subcellulaires sont purifiées par gradient de densité isopycnique.

Fractionnement cellulaire de cellules U937 par purification par gradient de densité isopycnique

Le protocole fournit une approche fiable et optimisée de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides pour le séquençage multiome à l’aide de la plate-forme 10x Genomics, y compris des recommandations pour les conditions de dissociation des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires et l’évaluation des noyaux isolés.

Optimisation de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides fraîches et congelées pour le séquençage multiome

Apprenez la méthode de Shidham pour préparer des blocs cellulaires à partir de cellules éparses en cytologie. Cette technique utilise le marqueur AV et le HistoGel pour améliorer l'analyse des profils immuno et des colorations spéciales.

Préparation Cell Block de cytologie avec une prédominance de cellules individuellement épars

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