Name: Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture dîlots humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Découvrez la purification et la culture d'îlots pancréatiques humains par gradient de Ficoll pour la transplantation clinique. Cette méthode automatisée améliore la qualité et la reproductibilité des îlots isolés.

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Soutenu par la fondation de l&#39;Université de l&#39;Illinois à Chicago ainsi que des cellules des îlots Resource Center subvention du NIH (RFA-05-003 RR), la Fondation Christopher, la Fondation Efroymson, et la Fondation Tellabs.

1. Purification des îlots <ol><li> Pour lancer la procédure de purification d&#39;îlots, de charger le sac de COBE, pince tous les tubes sauf le tube vert, et définir la vitesse de 1500 et le super à 0. </li><li> Dans la hotte mis en place les gobelets de la pompe et du gradient et de connecter le tuyau de collecte sur le tube vert. </li><li> Maintenant le chargement du ficoll 1,100 peut commencer: push &quot;spin&quot;, puis ajouter 110 ml de Ficoll 1.100 dans le bécher avant, et démarrer la pompe, afin de charger le sac de COBE. Comme le Ficoll est chargé, appuyez sur Super, arrêter la pompe, desserrer la tête de pompe et régler la vitesse des super 100. </li><li> Lorsque le ficoll atteint le bécher et tout l&#39;air est expulsé de la tubulure, re-clamp à la tête de pompe. Réglez la vitesse d&#39;essorage de 3000, et la vitesse des super-0. </li><li> Maintenant se préparent à charger les dégradés en versant le gradient lourds dans le bécher avant. Légèrement libérer la pince entre les deux béchers pour enlever tout l&#39;air. Puis versez le gradient de la lumière dans le bécher dos. </li><li> Tournez sur l&#39;agitateur magnétique, appuyez sur «spin» sur la machine COBE, enlever le collier du tube reliant les deux béchers, et vérifier visuellement que les gradients de lourdes et légères sont un mélange. </li><li> Une fois les gradients commencé à mixer, mettez la centrifugeuse. Attendez une minute, puis rallumez la pompe à charger les gradients de mélange. </li><li> Pour charger le tissu laisse le gradient s&#39;épuiser dans le bécher avant, mais pas assez bas pour laisser l&#39;air entrer dans le tube de chargement, puis reclamp le tube qui relie les béchers et charger les tissus. </li><li> Continuez à ajouter le reste du tissu. Puis, lavez le tube qui a tenu le tissu avec 50 ml de solution de lavage, et l&#39;utiliser pour laver le bécher avant. </li><li> Comme le dernier des tissus entre dans le sac, en même temps arrêter la pompe, desserrez à la tête de pompe, tuyau et pince-dessus du sac. Continuer à centrifuger pendant 5 minutes. </li><li> Alors que la centrifugation continue, mettre les 12 tubes de prélèvement sur le capot et desserrer les bouchons. Fixez le tube de collecte dans le tube jaune, et placez le bout de prélèvement stérile dans le tube conique 1. Puis desserrez le tube jaune, et serrer le tube vert. </li><li> Lorsque la rotation se termine, soulevez lentement Superout à 100. Recueillir 150 ml dans le tube 1. Ramassez ensuite 30 ml dans des tubes de 2-12 (200 à 230 ml). </li><li> Une fois la collecte terminée, appuyez sur &quot;STOP&quot; sur le satellite COBE. Maintenant que la purification est terminée, les îlots peuvent être évalués et mis en culture. </li></ol> 2. L&#39;échantillonnage et la culture <ol><li> Après la collecte des fractions purifiées d&#39;îlots, prélever un échantillon de chacun des 12 tubes de collecte et de tache avec dithizone. La coloration va montrer quelles sont les couches contiennent des îlots de grande pureté vs couches avec des îlots de faible pureté. </li><li> Recueillir les tissus de haute pureté et faible et piscine chaque ensemble. </li><li> Spin et laver deux fois. Après le second lavage, porter le volume de chaque à 250 ml avec les médias lavage final. </li><li> Pour évaluer les fractions regroupées commencer par prendre deux échantillons de 1 ml de la haute de l&#39;fractions regroupées et un échantillon de 1 ml à partir du bas. Transférer chaque échantillon de 1 ml dans un tube conique contenant 9 ml de solution de lavage. </li><li> Puis transférer 1 ml de chaque tube 15 ml pour une boîte de comptage. Examiner et compter les cellules sous le microscope. </li><li> Après avoir compté les cellules calculer le nombre de flacons nécessaires à la culture des îlots en utilisant la formule suivante: (EIN total / pureté des îlots en décimal) / (30000 EIN par flacon). Par exemple, 100 000 îlots de pureté de 90% sont cultivées dans 4 flacons. </li><li> Transfert des îlots au T175 flacons et la culture dans un 37 ˚ C et 5% de CO 2 incubateur. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

En dépit des progrès significatifs dans les techniques d&#39;isolement d&#39;îlots humains, le rendement des îlots restent très variable et imprévisible. Purification du tissu pancréatique digérée est crucial de récupérer une masse suffisante Isle après digestion enzymatique de succès pour la transplantation. Le procédé de purification UIC est recommandée, car une reprise supérieure de très grande pureté îlots humains a été démontré en utilisant cette méthode. Par ailleurs, jusqu&#39;à 50 ml de tissu digéré peut être ch...

<table><tbody><tr><td>Centrifugeuse</td><td>équipement</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Procédé cellulaire Cobe 2991</td><td>équipement</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>purification d'îlots</td></tr><tr><td>Microscopie inversée MZ6 TLBD4.1</td><td>équipement</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire avec grille de 2 mm</td><td>équipement jetable</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>dénombrement d'îlots</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique DS L1</td><td>équipement</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Sac COBE</td><td>équipement jetable</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture T175</td><td>équipement jetable</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>Solution de l'Université du Wisconsin (UW)</td><td>réactif</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée de Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td>réactif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>réactif</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Milieu M199 (solution de lavage)</td><td>réactif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Solution finale de lavage/milieu de culture</td><td>réactif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement îlots pancréatiques humaines: partie ii: purification et culture d&#39;îlots humains

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Gestion diabète de type 1 est lourde, tant pour l&#39;individu et la société, ce qui coûte plus de 100 milliards de dollars annuellement. Malgré l&#39;utilisation répandue de la surveillance du glucose et des préparations d&#39;insuline nouvelles, de nombreuses personnes encore développer des complications secondaires dévastateurs. Transplantation d&#39;îlots pancréatiques peut restaurer à proximité de contrôle de la glycémie normale chez les patients diabétiques<sup&gt; 1</sup&gt;, Sans courir le risque d&#39;épisodes hypoglycémiques graves qui sont associées à une insulinothérapie intensive. Fournir la masse des îlots suffisant est important pour la transplantation d&#39;îlots de succès. Cependant, les caractéristiques des donneurs, le prélèvement d&#39;organes et de la préservation affecter le résultat d&#39;isolement<sup&gt; 2</sup&gt;. À l&#39;Université de l&#39;Illinois à Chicago (UIC), nous avons développé un protocole d&#39;isolement de succès avec un gradient de purification améliorée<sup&gt; 3</sup&gt;. Le programme a démarré en Janvier 2004 et plus de 300 isolements ont été effectuées jusqu&#39;à Novembre 2008. Le pancréas ont été envoyés dans les solutions de conservation par le froid (UW, Université du Wisconsin ou de HTK, histidine-tryptophane cétoglutarate)<sup&gt; 4-7</sup&gt; À l&#39;isolement des cellules en laboratoire à l&#39;UIC pour l&#39;isolement des îlots. Les îlots pancréatiques ont été isolés en utilisant la méthode de l&#39;UIC qui est une version modifiée de la méthode initialement décrite par Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Comme décrit dans la Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques, le pancréas humain était paré, perforée, perfusé, et digéré. Après la collecte et au moins 30 minutes d&#39;incubation dans la solution UW, le tissu a été chargé dans le séparateur de cellules (COBE 2991, Cobe, Denver, CO) pour la purification<sup&gt; 3</sup&gt;. Après purification, le rendement des îlots (exprimés en équivalents îlot, IEQ), le volume des tissus, et la pureté a été déterminée selon les méthodes standard<sup&gt; 9</sup&gt;. Îlots isolés ont été cultivés dans CMRL-1066 médias (Mediatech, Herndon, VA), complété avec 1,5% d&#39;albumine humaine, 0,1% d&#39;insuline-transferrine-sélénium (STI), 1 ml de ciprofloxacine, 5 ml de HEPES 1M, et 14,5 ml de Bicarbonate de sodium 7,5% en T175 flacons à 37 ° C la nuit avant de la culture des îlots ont été transplantés ou utilisés pour la recherche.

Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d&#39;îlots humains est l&#39;une des conditions préalables importantes pour la transplantation d&#39;îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l&#39;isolement des îlots pancréatiques humains (partie II: la purification et la culture d&#39;îlots humains) en utilisant une méthode modifiée automatisés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d&#39;îlots humains

La prise en charge du diabète de type 1 est contraignante, tant pour l'individu que pour la société, avec un coût annuel dépassant les 100 milliards de dollars. Malgré l'utilisation généralisée de...

Dans cette vidéo, un tissu pancréatique précédemment isolé et digéré est soumis à une purification par gradient de fial, ce qui permet d'obtenir une fraction purifiée d'îlots pancréatiques pouvant finalement être cultivée dans des flacons de culture tissulaire jusqu'à la transplantation. Bonjour, je suis American Chief du Programme sur les îlots humains du Département de chirurgie de l'Université de l'Illinois à Chicago. Bonjour, je m'appelle Barbara Barbero et je fais également partie du Programme sur les îlots humains.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'isolement d'îlots pancréatiques humains. Nous utilisons cette procédure dans notre établissement afin de récolter des îlots humains de haute qualité destinés à un usage clinique. Commençons.Pour commencer la procédure de purification par eyelet, bloquer toutes les tubes du sac COBE sauf le tube vert et régler la vitesse sur 1500 et la sortie super sur zéro dans la hotte. Installer la pompe et les béchers de gradient, puis raccorder le tube de collecte au tube vert. La charge de l'appel FI peut maintenant commencer : appuyer sur spin.Ensuite, ajoutez 110 millilitres de fi. Appuyez sur le bécher avant et démarrez

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Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie I: la digestion et la collecte des tissus pancréatiques) en utilisant une méthode modifiée automatisés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques

L'alimentation de type 2 diabétiques îlots pour la recherche est insuffisant. Ici, nous partageons notre protocole pour isoler les îlots de patients subissant une pancréatectomie partielle. Cette approche représente un lieu unique pour obtenir des îlots de diabétiques de type 2 et cliniquement correspondance des sujets non diabétiques, en nombre suffisant pour les études fondamentales et cliniques.

L&#39;isolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés

Les îlots pancréatiques, également appelés îlots de Langerhans, sont un amas de cellules endocrines qui produisent des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Ce protocole explique une méthode pour isoler les îlots pancréatiques en perfusant d’abord la collagénase via l’ampoule de Vater pour digérer le tissu pancréatique exocrine et une centrifugation simplifiée par gradient de densité pour purifier les îlots des souris.

Isolement des îlots pancréatiques par perfusion de collagénase : une méthode enzymatique pour isoler les cellules des îlots pancréatiques

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

Un haut contenu<em&gt; In vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Ici, nous présentons un protocole pour produire des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle des cellules simples des îlots pancréatiques humains isolés utilisant une technologie microfluidique de séquençage d'ARN à base de gouttelettes.

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Ce protocole fournit un guide étape par étape pour l’obtention d’un pancréas porcin pour l’isolement et la purification des îlots de Langerhans.

Perfusion chirurgicale et isolement du pancréas porcin pour l’isolement des îlots

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Découvrez la purification et la culture d'îlots pancréatiques humains par gradient de Ficoll pour la transplantation clinique. Cette méthode automatisée améliore la qualité et la reproductibilité des îlots isolés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d'îlots humains

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