Name: Génération de lhomme CD40-B activés cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Apprenez à générer des cellules B activées par CD40 à partir de cellules mononucléaires de sang périphérique. Cette méthode ex vivo utilise le ligand CD40 et l'interleukine-4 pour explorer les fonctions des cellules B en immunologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le protocole pour la génération des cellules B CD40 humains activés à partir des PBMC est divisé en deux parties: la partie A montre la préparation du ligand CD40 exprimant cellules NIH/3T3, qui sera utilisée comme plaque de cellules nourricières lié. Partie B décrit les réelles CD40-B de la culture. A. Préparation de cellules nourricières (tCD40L NIH/3T3) Le NIH/3T3 tCD40L est une adhérente lignée murine de cellules fibroblastes, qui ne devrait jamais devenir complètement confluentes. Les cellules sont donc découpé deux fois par semaine. La culture sur plus de six semaines n&#39;est pas recommandée. <ol><li> Retirer ancien milieu de la culture primaire avec une pipette stérile et laver les cellules avec 10 ml de PBS 1x. Aspirer le PBS après le lavage. </li><li> Ajouter 4 ml de trypsine / EDTA dans un flacon de 75 cm2 pendant 5-10 minutes à 37 ° C. Utilisez tapotant doucement pour détacher les cellules. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de type sauvage et pivotant doucement. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml avec une pipette stérile et le spin des cellules vers le bas à 225 xg pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot dans 10 mL de milieu de type sauvage. Comptez le nombre de cellules d&#39;une aliquote de la suspension cellulaire et préparer trois tubes de 50 ml avec le nombre approprié de cellules: <ol><li> 1,5 x 10 6 cellules pour repiquage </li><li> 0,2 x 10 6 cellules / puits pour l&#39;irradiation utilisée pour la culture de cellules CD40-B </li><li> restant à geler (si nécessaire). </li></ol></li><li> Faites tourner les cellules vers le bas à 225 xg pendant 5 min. </li><li> Enlever le surnageant. <ol><li> Pour repiquage: resuspendre 1,5 x 10 6 cellules dans 10 ml de type moyenne sauvages dans un flacon de 75 cm2 de culture de cellules (1,5 densité cellulaire x 10 5 cellules / mL), ajouter G-418 [0,7 mg / ml] et incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. Fractionner les cellules deux fois par semaine. </li><li> Pour la culture de cellules CD40-B: Vous avez besoin de 1,2 x 10 6 cellules pour une plaque de 6 puits. Resuspendre les cellules dans un milieu de type sauvage à une densité de 0,1 x 10 6 cellules / ml et les irradier à 78 Gy. Planche 2 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits et les incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Utilisez cette assiettes préparées pour la stimulation des lymphocytes B lors tCD40L cellules NIH/3T3 sont adhérentes (au moins 4 heures: vérifier l&#39;adhérence avec le microscope, ne pas attendre plus de 24 h pour commencer la stimulation des lymphocytes B). (Continuer avec B.) </li></ol></li></ol> B. CD 40-B de culture cellulaire I. Préparation des PBMC pour CD40-stimulation (jour 0): S&#39;il vous plaît noter: avant de continuer de s&#39;assurer que les cellules nourricières sont adhérentes. Toujours ajouter de nouvelles solutions de l&#39;interleukine-4 et la cyclosporine A au milieu de croissance immédiatement avant utilisation. <ol><li> Prenez PBMC, frais ou décongelés de façon appropriée. Resuspendre PBMC deux fois dans 50 ml de PBS 1x pour les laver et de spin-down première fois à 265 xg pendant 7 min et une seconde fois à 190 xg pendant 7 min pour éliminer d&#39;autres cellules. Rejeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 20 ml de PBS. Déterminer le nombre de cellules dans une aliquote de la suspension cellulaire. </li><li> Isoler quantité requise de cellules à 225 xg pendant 5 min. Pour une plaque à 6 puits 4 x 10 6 cellules / puits sont nécessaires, donc 24 x 10 6 cellules par plaque. </li><li> Enlever le surnageant et remettre en suspension les PBMC à 1 x 10 6 cellules / ml dans le CD40-B milieu de culture fraîchement supplémenté avec 50 U / ml d&#39;interleukine-4 comme un facteur de croissance et de 0,63 g / mL cyclosporine A pour prévenir la excroissance de cellules T (Compte tenu de la concentration se référer à un milieu de culture ml!). </li><li> Retirer le surnageant de 6 puits plaque pré-incubées avec des cellules NIH/3T3 tCD40L. </li><li> Laver les adhérents tCD40L cellules NIH/3T3 avec 2 ml de PBS par puits d&#39;abord et dans une seconde étape avec 2 ml de milieu B CD40-linge. </li><li> Ajouter délicatement 4 ml de suspension PBMC (1 x 10 6 cellules / ml) dans chaque puits de la plaque de 6 puits. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Au jour 7, les cellules reculture (Continuez à 3.2.). </li></ol> II. Remise en culture des cellules B CD40 (7 jours, puis tous les 3-4 jours): <ol><li> La récolte des grappes CD40 des cellules B à partir de 6 puits plaque par remise en suspension avec une pipette de 10 ml et de les mettre dans un tube de 50 ml. </li><li> Isoler à 225 xg pendant 7 minutes et remplacer complètement le surnageant avec CD40-B milieu de lavage. Alors que le comptage des cellules du montant d&#39;une aliquote, tourner les cellules vers le bas à 225 xg pendant 5 minutes. Resuspendre les cellules CD40-CD40-B en B milieu de culture à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Ajouter de nouvelles solutions de l&#39;interleukine-4 à une concentration de 50 U / ml et 0,63 mg / ml de cyclosporine A dans le milieu. </li><li> Retirer le surnageant dans une plaque de 6 puits de pré-incubées avec des cellules NIH/3T3 tCD40L. </li><li> Laver les cellules adhérentes avec 2 ml de PBS par puits d&#39;abord et dans une seconde étape avec 2 ml de milieu B CD40-linge. </li><li&gt; Ajouter délicatement 4 ml (1 x 10 6 cellules / ml) de suspension CD40-B pour chaque puits de la plaque à 6 puits. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Repiquer les cellules à nouveau tous les 3-4 jours pour finir avec très pure des cellules B CD40-activé après un total de 14 jours. </li></ol> C. Dépannage - Que faire si les cellules CD40-B ne poussent pas? <ol><li> Avez-vous vérifié l&#39;expression du ligand CD40 des cellules nourricières? </li><li> La plaque lié cellules nourricières utilisé pour la stimulation ne doit pas être âgés de plus de 24h? </li><li> Est-ce une contamination par des mycoplasmes possibles? </li><li> Était la solution interleukine-4 utilisé pour la supplémentation fraîchement dégelé et avait l&#39;activité biologique approprié? </li><li> Cyclosporine A a été ajoutée dans la concentration correcte? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figure 1" /> Figure 1. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">cliquez ici</a> pour une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figure 2" /> Figure 2. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">cliquez ici</a> pour une version agrandie de la figure 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

A. Préparation des médias: <table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Cellules nourricières type de support sauvages </td><td colspan="2"> Milieu de sélection de cellules Feeder </td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> Concentration </td><td> Réactifs </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 365 pg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 365 pg / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> G-418 </td><td> 0,7 mg / ml </td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40-B milieu de lavage </td><td colspan="2"> CD40-B milieu de culture </td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> Concentration </td><td> Réactifs </td><td> Concentration </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L-Glutamine </td><td> 584 pg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 584 pg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25 mM </td><td> HEPES </td><td> 25 mM </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> rh transferrine </td><td> 50 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> L&#39;insuline rh </td><td> 5 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB-Humanserum </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Réactifs Divers: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Ordonnance n </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> AAP </td><td> Pas de chat: E15-813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (10x) </td><td> AAP </td><td> Cat No H15-011 </td></tr><tr><td> AB-sérum humain </td><td> Invitrogen </td><td> Cat No 34005100 </td></tr><tr><td> holo-transferrine humaine </td><td> Sigma </td><td> Aucun chat T0665 </td></tr><tr><td> Insuline humaine </td><td> Sigma </td><td> Aucun chat I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td> Sélectionnez Delta </td><td> Art Pas 7395800 </td></tr><tr><td> Interleukine-4 de l&#39;homme </td><td> Immunotools </td><td> Cat No 11130045 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Novartis </td><td> Cat No 0078-0109-01 NDC </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Aucun chat DE14-802C </td></tr><tr><td> Tampon HEPES </td><td> AAP </td><td> Cat No S11-001 </td></tr><tr><td> G-418 Sulfate </td><td> AAP </td><td> Aucun chat P02-012 </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table> C. Fournitures diverses: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Ordonnance n </td></tr><tr></tr><tr><td> Stérile pipette </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-même la plaque </td><td> NUNC </td><td> Cat No 140675 </td></tr><tr><td> 50mL tube conique </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Cat No 352070 </td></tr><tr><td> Flacon de culture tissulaire </td><td> SARSTEDT </td><td> Aucun chat 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

génération de l&#39;homme cd40-b activés cellules

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activé des cellules B (CD40-cellules B) ont été identifiés comme une source alternative de l&#39;immuno-stimulation des cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC) pour l&#39;immunothérapie du cancer 1-3. Comparé aux cellules dendritiques (CD), la meilleure APC caractérisée, les cellules CD40-B ont plusieurs propriétés biologiques distinctes et techniques. Similaires aux PED, les cellules B montrent une augmentation de l&#39;expression du CMH et des molécules de co-stimulation (Fig. 1b), présentent une forte capacité migratoire et la présentation des antigènes présents efficacement aux cellules T, après stimulation par un ligand interleukine-4 et CD40 (CD40L). Cependant, contrairement aux CD immatures ou matures, les cellules CD40-B expriment la triade lymphatiques pleine noeud homing composé de CD62L, CCR7/CXCR4, et la fonction des leucocytes antigènes-1 (LFA1, CD11a/CD18), nécessaires à tête chercheuse d&#39;organes lymphoïdes secondaires (Fig.1a) 3. Cellules CD40-B peuvent être générés sans difficultés à partir de très petites quantités de sang périphérique qui peut être élargi in vitro à de très grandes quantités de très-pur-CD40 des cellules B (&gt; 10 9 cellules par patient) provenant de donneurs sains ainsi que le cancer patients (Fig.1c, d) 1,4. Dans ce protocole, nous montrons comment obtenir pleinement activé CD40-B à partir des cellules PBMC humaines. Molécules clés pour la culture cellulaire sont CD40-ligand, l&#39;interleukine-4 (IL-4) et la cyclosporine A. (CSA), qui sont reconstituées dans un cycle de culture de 3-4 jours Aux fins de laboratoire CD40-stimulation est fournie par des cellules exprimant NIH/3T3 humaine recombinante ligand CD40 (tCD40L NIH/3T3) 5. Pour éviter la contamination par des cellules non transfectées, l&#39;expression du ligand CD40 humaine sur les transfectants doit être vérifié régulièrement (Fig.2). Après 14 jours de CD40-B cultures cellulaires consistent de plus de 95% de cellules B pur et une expansion des cellules CD40-B de plus de 65 jours est souvent possible sans aucune perte de fonction 1, 4. Cellules CD40-B efficacement relever, traiter et présenter les antigènes aux cellules T 6. Ils ne sont pas seulement naϊve écoute, mais également d&#39;élargir les cellules T mémoire 7,8. CD40-activé des cellules B peut être utilisé pour étudier activation des cellules B, la différenciation et la fonction. Par ailleurs, ils représentent un outil prometteur pour la vaccination thérapeutique ou préventive contre les tumeurs 9.

Dans cette vidéo, nous présentons les<em&gt; Ex vivo</emGénération&gt; et l&#39;expansion des cellules B CD40-activées (CD40-B) à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par stimulation par CD40 ligand et l&#39;interleukine-4.

Génération de l&#39;homme CD40-B activés cellules

Les lymphocytes B activés par le CD40 (lymphocytes B-CD40) ont été identifiés comme une source alternative de cellules présentatrices d'antigène (APC) immunostimulatrices pour le cancer...

Bonjour, je m'appelle Alexander Shiku Van Hagen. Je suis membre du Laboratoire d'Immunologie et d'Immunologie de la Transplantation de l'Hôpital Universitaire de Cologne. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment nous pouvons générer des cellules B humaines activées par le CD40 à partir de cellules mononucléées du sang périphérique.L'un des principaux intérêts de notre laboratoire est l'étude des fonctions indépendantes des anticorps des cellules BB. Au-delà de leur rôle de productrices d'anticorps, les cellules B jouent un rôle important en tant que cellules présentatrices d'antigènes, tant dans des conditions physiologiques qu'au cours des maladies auto-immunes. Après activation, les cellules B peuvent acquérir des capacités puissantes de présentation de l'antigène et d'immunostimulation, en particulier lorsqu'elles sont activées via le CD40.CD 40. Les cellules B activées présentent plusieurs avantages par rapport aux cellules dendritiques. Elles peuvent être facilement amplifiées à un coût relativement faible à partir de faibles quantités de sang périphérique, même chez des patients atteints de cancer.Notre étudiante au doctorat, Tanya Leic, et notre technicienne LER, vont maintenant vous présenter étape par étape la méthode permettant d'obtenir des cellules B humaines activées par CD40 à partir de sang périphérique. Bonjour, je m'appelle Tanya Livi. Je suis étudiante au doctorat et je vais vous montrer comment générer des cellules B humaines activées par CD40.Cette procédure a été optimisée dans notre laboratoire. Les principales étapes sont, tout d'abord, la préparation des cellules nourricières. Pour cela, nous utilisons des cellules N IH 33 transfectées avec le ligand humain du CD 40, qui sont irradiées avec 78 gray et mises en culture dans des plaques à six puits.Deuxièmement, nous commençons la culture de cellules B activées par le CD40 humain à partir de PBMC purifiés, qui sont traités par l'interleukine-4 humaine et la cyclosporine A. Ces cellules sont ensuite mises en culture sur des cellules FEEDER dans des plaques de six puits. Cette procédure est répétée au jour 7, puis tous les trois à quatre jours jusqu'au jour 14 de la culture cellulaire. Pour obtenir des cellules B activées par le CD40 humain hautement pures, nous démarrons la génération de cellules B activées par le CD40 à partir de PBMC humains fraîchement purifiés ou correctement conservés. Tout d'abord, nous lavons les PBMC deux fois, puis nous resuspendons les cellules dans 50 millilitres de PBS. Centrifuger les PBMC pendant sept minutes à 1300 tr/min, ce qui correspond à 260,5 ×g. Retirer le surnageant, puis resuspendre à nouveau les cellules dans 50 millilitres de PBS et centrifuger de nouveau pendant sept minutes à 1100 tr/min, ce qui correspond à 190 ×g. Conserver ce surnageant pour la détermination du nombre de cellules. Suspendez les PBMC dans 20 millilitres de PBS, mélangez soigneusement les cellules par vortexage et déterminez le nombre de cellules. Faites centrifuger la quantité requise de PBMC destinée à la culture de CD 40 B pendant cinq minutes à 1200 tr/min, ce qui correspond à 220 5G. En utilisant une plaque à six puits, vous avez besoin de quatre fois 10 à la puissance six cellules par puits, plus 24 fois 10 à la puissance six cellules par plaque.Ensuite, resuspendre les PBMC à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre dans le milieu de culture CD40B. Compléter la suspension cellulaire avec de l'IL-4 humaine fraîche à une concentration de 50 unités par millilitre pour la stimulation et de la ciclosporine A à une concentration de 0,63 microgramme par millilitre afin d'inhiber la prolifération des lymphocytes T. La suspension de PBMC est désormais prête à être stimulée par le ligand CD40.À notre connaissance, il n'existe actuellement aucun ligand fonctionnel de CD40 de qualité GMP disponible. Par conséquent, nous utilisons des cellules NIH/3T3 transfectées par le ligand humain de CD40 pour stimuler la survie, la différenciation et la prolifération cellulaires, car la lignée cellulaire NIH/3T3 peut survivre en culture pendant plusieurs mois. Une perte d'expression du ligand de CD40 doit être régulièrement exclue par cytométrie en flux.Le ligand du CD40 transfecté, NIH 3T3, est une lignée cellulaire adhérente cultivée à 37 degrés avec 5 % de CO₂ dans un milieu de sélection supplémenté en G418 à une concentration de 0,7 milligramme par millilitre. Cette lignée de cellules fibroblastes adhérentes ne doit jamais devenir complètement confluente et doit être divisée deux fois par semaine. Pour diviser les cellules adhérentes, aspirez le milieu, rincez une fois avec 10 millilitres de PBS en agitant doucement. Aspirez à nouveau le milieu et ajoutez 4 millilitres de trypsine-EDTA dans un flacon de 75 centimètres carrés.Incuber le flacon pendant cinq à dix minutes à 37 degrés dans l'incubateur. Retirer à nouveau le flacon. Utiliser des tapotements doux pour détacher les cellules du plastique.Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de type sauvage, agitez doucement par mouvements de rotation et transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres. Faites centrifuger les cellules NA83T3 pendant cinq minutes à 1200 tr/min, ce qui correspond à 125 × g. Resuspendez soigneusement les cellules déposées dans 10 millimètres de milieu de type sauvage.Déterminez le nombre de cellules pour la sous-culture N IH trois trois et resuspendez 1,5 × 10⁶ cellules nourricières dans 10 millilitres de milieu sauvage. Transférez-les dans un flacon de 75 centimètres carrés et ajoutez la G 4 1 8 à une concentration de 0,7 milligramme par millilitre pour sélectionner les cellules transfectées qui portent la résistance à la néomycine. Incubez enfin les cellules nourricières à 37 degrés dans 5 %CO₂ pour la stimulation des cellules B CD 40.Prendre le reste des cellules NI 8 3 3 et les irradier de manière létale avec une dose de 78 Gray afin d'arrêter leur prolifération. Diluer les cellules nourricières irradiées dans un milieu de type « wire » à une densité cellulaire de 0,1 × 10⁶ cellules par millilitre, en plaquant 2 millilitres par puits dans une plaque de 6 puits. Laisser les cellules dans la plaque à 6 puits redevenir adhérentes avant de les utiliser comme cellules nourricières, en les incubant pendant 24 heures à 37 °C et 5 % CO₂ pour la stimulation des lymphocytes B par le ligand CD40.Vérifiez au microscope si les cellules nourricières ensemencées la veille sont adhérentes. Si les cellules nourricières sont adhérentes, retirez le SUP natin de chaque puits et rincez-les rapidement deux fois. Effectuez d'abord un lavage de chaque puits avec deux millilitres de PBS, puis un second avec deux millilitres.Milieu de lavage CD40 B pour la stimulation de la suspension de PBMC. Préparer shortly avant avec une densité cellulaire de 1 × 10⁶ cellules par millilitre pour les cellules nourricières. Pour ce faire, transférer délicatement quatre millilitres de la suspension cellulaire dans chacun.Incuber correctement la plaque à 37 degrés dans une atmosphère à 5 % de CO2 au septième jour. Les cellules B CD40 peuvent être repiquées pour le premier passage des cellules B CD40. Les cellules B activées au septième jour et lors des passages suivants tous les trois à quatre jours.Prélève délicatement les cellules groupées des six plaques 12 en les resuspendant avec une pipette de 10 millilitres. Transfère les cellules B CD40 dans un tube de 50 millilitres. Fais centrifuger les cellules B CD40 pendant sept minutes à 1200 tr/min, ce qui correspond à 220,5 ×g, complètement.Remplacer le milieu par le milieu de lavage CD40B et déterminer le nombre de cellules CD40. Ré-suspendre les cellules B activées à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre dans le milieu de culture CD40B.Ensuite, complétez à nouveau la suspension cellulaire avec de l'IL humaine quatre fraîche à une concentration de 50 unités par millilitre et de la ciclosporine A à une concentration de 0,63 microgramme par millilitre pour la stimulation. Uc, des cellules nourricières irradiées préparées un jour auparavant. Bien entendu, les cellules nourricières irradiées doivent à nouveau être vérifiées quant à leur adhérence au microscope juste avant utilisation.Si les cellules adhérentes, laver rapidement les cellules nourricières deux fois : une fois avec du PBS et une autre fois avec le milieu de lavage CD40B, puis ajouter soigneusement quatre millilitres du suspenseur CD40B ajusté à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre dans chaque puits d'une plaque de six puits. La sous-culture est répétée de manière identique après trois à quatre jours, deux fois par semaine, afin d'obtenir des agrégats cellulaires composés de cellules B humaines activées par CD40 de haute pureté au jour 14 de culture.À ce stade, les lymphocytes B activés par le CD40 expriment des molécules co-stimulatrices telles que le CD80, le CD86, le CD83, les molécules CMH, ainsi que la triade d’homing vers les ganglions lymphatiques composée du ligand CD62, du CCR7 et de la LFA-1, qui peuvent être vérifiées par Fox lors de la génération, à des fins de dépannage. Veuillez vous référer à la version textuelle de ce protocole. Nous espérons que, dans l'avenir, les lymphocytes B activés par le CD40 serviront d'outil important pour l'immunothérapie du cancer.Bonne chance avec vos expériences.

generation-of-human-cd40-activated-b-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure d'activation de CD40-et à l'expansion des cellules B murines à partir de splénocytes de souris C57BL / 6, qui peut être utilisé comme un modèle de cellule présentatrice d'antigène (APC) pour étudier l'induction de l'immunité.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

Un système efficace de structure et de l'analyse fonctionnelle d'un gène dans...

Recombinante de production et infection rétrovirale des cellules B

Cette vidéo présente un test in vitro pour générer des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) à partir de cellules progénitrices lymphoïdes communes (CLP). Lors de la co-culture de CLP purifiés avec des cellules nourricières irradiées par γ en présence d’un ligand tyrosine kinase-3 (FL) de type Fms, les CLP se différencient en pDC non adhérentes, dont la présence est confirmée par cytométrie en flux.

Génération in vitro de cellules dendritiques plasmacytoïdes à partir de progéniteurs lymphoïdes communs

Cette vidéo présente un test permettant de générer des cellules T CD8αβ+ dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques de l’antigène tumoral. Les iPSC spécifiques de l’antigène tumoral sont cultivées sur une monocouche de cellules stromales et différenciées en cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC). Les HPC sont différenciés en lymphocytes T CD4+ CD8+ doublement positifs à l’aide d’un milieu de différenciation. Ces cellules sont ensuite stimulées pour générer des...

Génération de lymphocytes T CD8 positifs uniques à partir de cellules souches pluripotentes induites

Cet article décrit une méthode de génération et de propagation de clones de lymphocytes T humains qui répondent spécifiquement à un alloantigène défini. Ce protocole peut être adapté pour le clonage de lymphocytes T humains spécifiques à une variété de ligands peptide-CMH.

Génération de cellules T humaines allo-spécifiques du sang périphérique

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour produire des récepteurs de cellules T spécifiques de l'antigène (TCR) par couplage du TCRa ou TCRβ d'un TCR existant, possédant l'antigène de la spécificité d'intérêt, avec hemichain complémentaire du répertoire des récepteurs des cellules T périphériques. Les TCR de novo générés conservent l' antigène de spécificité avec une affinité variable.

Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

Ici, nous démontrons comment les monocytes sont isolés par séparation par billes magnétiques des cellules mononucléées du sang périphérique après centrifugation par gradient de densité du sang anticoagulé humain. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains sont différenciés en cellules dendritiques immatures et sont prêts pour des procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Nous décrivons une méthode pour la production d’anticorps humains spécifiques pour un antigène d’intérêt, à partir de rares cellules B circulant dans le sang humain. Génération de ces anticorps naturels est efficace et rapide, et les anticorps obtenus peuvent distinguer les antigènes fortement connexes.

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

À l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes, les auteurs rapportent une in vitro de cellules B au modèle de différenciation de cellules de plasma.

Dans modèle de différenciation in Vitro des cellules de la mémoire humaine normale B à longue durée de vie des cellules de Plasma

Ce protocole fournit un flux de travail rationalisé pour générer et tester des cellules T régulatrices du récepteur antigénique chimérique humain (CAR Tregs).

Génération de lymphocytes T régulateurs du récepteur de l’antigène chimérique humain

Apprenez à générer des cellules B activées par CD40 à partir de cellules mononucléaires de sang périphérique. Cette méthode ex vivo utilise le ligand CD40 et l'interleukine-4 pour explorer les fonctions des cellules B en immunologie.

Génération de l'homme CD40-B activés cellules

Explorer plus de vidéos