Génération de l'homme CD40-B activés cellules

Bonjour, je m'appelle Alexander Shiku Van Hagen. Je suis membre du Laboratoire d'Immunologie et d'Immunologie de la Transplantation de l'Hôpital Universitaire de Cologne. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment nous pouvons générer des cellules B humaines activées par le CD40 à partir de cellules mononucléées du sang périphérique.

L'un des principaux intérêts de notre laboratoire est l'étude des fonctions indépendantes des anticorps des cellules BB. Au-delà de leur rôle de productrices d'anticorps, les cellules B jouent un rôle important en tant que cellules présentatrices d'antigènes, tant dans des conditions physiologiques qu'au cours des maladies auto-immunes. Après activation, les cellules B peuvent acquérir des capacités puissantes de présentation de l'antigène et d'immunostimulation, en particulier lorsqu'elles sont activées via le CD40.

CD 40. Les cellules B activées présentent plusieurs avantages par rapport aux cellules dendritiques. Elles peuvent être facilement amplifiées à un coût relativement faible à partir de faibles quantités de sang périphérique, même chez des patients atteints de cancer.

Notre étudiante au doctorat, Tanya Leic, et notre technicienne LER, vont maintenant vous présenter étape par étape la méthode permettant d'obtenir des cellules B humaines activées par CD40 à partir de sang périphérique. Bonjour, je m'appelle Tanya Livi. Je suis étudiante au doctorat et je vais vous montrer comment générer des cellules B humaines activées par CD40.

Cette procédure a été optimisée dans notre laboratoire. Les principales étapes sont, tout d'abord, la préparation des cellules nourricières. Pour cela, nous utilisons des cellules N IH 33 transfectées avec le ligand humain du CD 40, qui sont irradiées avec 78 gray et mises en culture dans des plaques à six puits.

Deuxièmement, nous commençons la culture de cellules B activées par le CD40 humain à partir de PBMC purifiés, qui sont traités par l'interleukine-4 humaine et la cyclosporine A. Ces cellules sont ensuite mises en culture sur des cellules FEEDER dans des plaques de six puits. Cette procédure est répétée au jour 7, puis tous les trois à quatre jours jusqu'au jour 14 de la culture cellulaire. Pour obtenir des cellules B activées par le CD40 humain hautement pures, nous démarrons la génération de cellules B activées par le CD40 à partir de PBMC humains fraîchement purifiés ou correctement conservés.

Tout d'abord, nous lavons les PBMC deux fois, puis nous resuspendons les cellules dans 50 millilitres de PBS. Centrifuger les PBMC pendant sept minutes à 1300 tr/min, ce qui correspond à 260,5 ×g. Retirer le surnageant, puis resuspendre à nouveau les cellules dans 50 millilitres de PBS et centrifuger de nouveau pendant sept minutes à 1100 tr/min, ce qui correspond à 190 ×g. Conserver ce surnageant pour la détermination du nombre de cellules.

Suspendez les PBMC dans 20 millilitres de PBS, mélangez soigneusement les cellules par vortexage et déterminez le nombre de cellules. Faites centrifuger la quantité requise de PBMC destinée à la culture de CD 40 B pendant cinq minutes à 1200 tr/min, ce qui correspond à 220 5G. En utilisant une plaque à six puits, vous avez besoin de quatre fois 10 à la puissance six cellules par puits, plus 24 fois 10 à la puissance six cellules par plaque.

Ensuite, resuspendre les PBMC à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre dans le milieu de culture CD40B. Compléter la suspension cellulaire avec de l'IL-4 humaine fraîche à une concentration de 50 unités par millilitre pour la stimulation et de la ciclosporine A à une concentration de 0,63 microgramme par millilitre afin d'inhiber la prolifération des lymphocytes T. La suspension de PBMC est désormais prête à être stimulée par le ligand CD40.

À notre connaissance, il n'existe actuellement aucun ligand fonctionnel de CD40 de qualité GMP disponible. Par conséquent, nous utilisons des cellules NIH/3T3 transfectées par le ligand humain de CD40 pour stimuler la survie, la différenciation et la prolifération cellulaires, car la lignée cellulaire NIH/3T3 peut survivre en culture pendant plusieurs mois. Une perte d'expression du ligand de CD40 doit être régulièrement exclue par cytométrie en flux.

Le ligand du CD40 transfecté, NIH 3T3, est une lignée cellulaire adhérente cultivée à 37 degrés avec 5 % de CO₂ dans un milieu de sélection supplémenté en G418 à une concentration de 0,7 milligramme par millilitre. Cette lignée de cellules fibroblastes adhérentes ne doit jamais devenir complètement confluente et doit être divisée deux fois par semaine. Pour diviser les cellules adhérentes, aspirez le milieu, rincez une fois avec 10 millilitres de PBS en agitant doucement. Aspirez à nouveau le milieu et ajoutez 4 millilitres de trypsine-EDTA dans un flacon de 75 centimètres carrés.

Incuber le flacon pendant cinq à dix minutes à 37 degrés dans l'incubateur. Retirer à nouveau le flacon. Utiliser des tapotements doux pour détacher les cellules du plastique.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de type sauvage, agitez doucement par mouvements de rotation et transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres. Faites centrifuger les cellules NA83T3 pendant cinq minutes à 1200 tr/min, ce qui correspond à 125 × g. Resuspendez soigneusement les cellules déposées dans 10 millimètres de milieu de type sauvage.

Déterminez le nombre de cellules pour la sous-culture N IH trois trois et resuspendez 1,5 × 10⁶ cellules nourricières dans 10 millilitres de milieu sauvage. Transférez-les dans un flacon de 75 centimètres carrés et ajoutez la G 4 1 8 à une concentration de 0,7 milligramme par millilitre pour sélectionner les cellules transfectées qui portent la résistance à la néomycine. Incubez enfin les cellules nourricières à 37 degrés dans 5 %CO₂ pour la stimulation des cellules B CD 40.

Prendre le reste des cellules NI 8 3 3 et les irradier de manière létale avec une dose de 78 Gray afin d'arrêter leur prolifération. Diluer les cellules nourricières irradiées dans un milieu de type « wire » à une densité cellulaire de 0,1 × 10⁶ cellules par millilitre, en plaquant 2 millilitres par puits dans une plaque de 6 puits. Laisser les cellules dans la plaque à 6 puits redevenir adhérentes avant de les utiliser comme cellules nourricières, en les incubant pendant 24 heures à 37 °C et 5 % CO₂ pour la stimulation des lymphocytes B par le ligand CD40.

Vérifiez au microscope si les cellules nourricières ensemencées la veille sont adhérentes. Si les cellules nourricières sont adhérentes, retirez le SUP natin de chaque puits et rincez-les rapidement deux fois. Effectuez d'abord un lavage de chaque puits avec deux millilitres de PBS, puis un second avec deux millilitres.

Milieu de lavage CD40 B pour la stimulation de la suspension de PBMC. Préparer shortly avant avec une densité cellulaire de 1 × 10⁶ cellules par millilitre pour les cellules nourricières. Pour ce faire, transférer délicatement quatre millilitres de la suspension cellulaire dans chacun.

Incuber correctement la plaque à 37 degrés dans une atmosphère à 5 % de CO2 au septième jour. Les cellules B CD40 peuvent être repiquées pour le premier passage des cellules B CD40. Les cellules B activées au septième jour et lors des passages suivants tous les trois à quatre jours.

Prélève délicatement les cellules groupées des six plaques 12 en les resuspendant avec une pipette de 10 millilitres. Transfère les cellules B CD40 dans un tube de 50 millilitres. Fais centrifuger les cellules B CD40 pendant sept minutes à 1200 tr/min, ce qui correspond à 220,5 ×g, complètement.

Remplacer le milieu par le milieu de lavage CD40B et déterminer le nombre de cellules CD40. Ré-suspendre les cellules B activées à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre dans le milieu de culture CD40B.

Ensuite, complétez à nouveau la suspension cellulaire avec de l'IL humaine quatre fraîche à une concentration de 50 unités par millilitre et de la ciclosporine A à une concentration de 0,63 microgramme par millilitre pour la stimulation. Uc, des cellules nourricières irradiées préparées un jour auparavant. Bien entendu, les cellules nourricières irradiées doivent à nouveau être vérifiées quant à leur adhérence au microscope juste avant utilisation.

Si les cellules adhérentes, laver rapidement les cellules nourricières deux fois : une fois avec du PBS et une autre fois avec le milieu de lavage CD40B, puis ajouter soigneusement quatre millilitres du suspenseur CD40B ajusté à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre dans chaque puits d'une plaque de six puits. La sous-culture est répétée de manière identique après trois à quatre jours, deux fois par semaine, afin d'obtenir des agrégats cellulaires composés de cellules B humaines activées par CD40 de haute pureté au jour 14 de culture.

À ce stade, les lymphocytes B activés par le CD40 expriment des molécules co-stimulatrices telles que le CD80, le CD86, le CD83, les molécules CMH, ainsi que la triade d’homing vers les ganglions lymphatiques composée du ligand CD62, du CCR7 et de la LFA-1, qui peuvent être vérifiées par Fox lors de la génération, à des fins de dépannage. Veuillez vous référer à la version textuelle de ce protocole. Nous espérons que, dans l'avenir, les lymphocytes B activés par le CD40 serviront d'outil important pour l'immunothérapie du cancer.

Bonne chance avec vos expériences.