Utilisation de la limule, Limulus Polyphemus, En recherche sur la vision

Bonjour, je suis Chris Paglia, directeur du laboratoire de traitement de l'information visuelle au sein du département de génie biomédical de l'Université de Boston. Bonjour, je suis Jacque Liu, étudiante au doctorat dans le laboratoire du Dr Paglia. Les travaux de recherche de notre laboratoire visent à comprendre les calculs neuronaux qui permettent aux animaux de voir.

Pour cette recherche, nous utilisons l'une des créatures les plus anciennes de la Terre, le crabe fer à cheval américain. Ces animaux sont désormais des fossiles vivants. Ils continuent de jouer un rôle indispensable dans la recherche biomédicale.

Non seulement leur sang contient-il des cellules particulières que les scientifiques utilisent pour détecter les toxines bactériennes dans nos médicaments, mais leurs yeux possèdent également un réseau neuronal qui a permis de mieux comprendre le fonctionnement de notre système visuel. La base cellulaire de processus tels que l'adaptation à la lumière et l'inhibition latérale a été mise en évidence pour la première fois lors d'études portant sur les yeux latéraux composés de cet animal, et c'est pour ces travaux pionniers que le Dr Keffer Hartline a reçu le prix Nobel en 1967. Le crabe-ferré reste un modèle privilégié pour la recherche en vision car l'animal est de grande taille et robuste pour un invertébré, et ses neurones rétiniens sont volumineux et facilement accessibles.

Son système visuel est compact et largement étudié, et son comportement visuel est bien défini. De plus, la structure et la fonction des yeux sont modulées quotidiennement par une horloge circadienne située dans le cerveau de l'animal. En résumé, le système visuel des crabes-ferrés est suffisamment simple pour être compris, tout en étant assez complexe pour présenter un intérêt scientifique.

Dans cette vidéo, nous illustrerons trois paradigmes expérimentaux permettant d'étudier les bases neurologiques de la vision, qui peuvent être réalisés in vivo avec ce modèle animal classique. Pour la recherche en vision, il s'agit de l'enregistrement électrorétinogrammique, de l'enregistrement du nerf optique et de l'enregistrement intrarétinien. Les crabes fers à cheval sont maintenus dans un réservoir d'eau salée aérée, placé dans une pièce exposée à un cycle lumineux sombre régulé.

Avant de commencer l'une de ces techniques d'enregistrement, les animaux sont refroidis dans un seau de glace pendant environ 10 minutes, puis fixés sur une plateforme en bois en insérant deux vis en acier inoxydable dans le pro soma et deux autres dans le soma des EPI. La plateforme est lestée en dessous avec du granit afin qu'elle s'enfonce dans l'eau. L'électrorétinogramme ou ERG est utilisé pour surveiller la sensibilité oculaire au fil du temps.

Il mesure la réponse électrique globale de toutes les cellules de l'œil. Pour produire un éclair lumineux, les outils nécessaires à cette procédure comprennent un tournevis, de la vaseline, une solution de Ringer, une pipette, une DEL, une chambre d'enregistrement, des vis en acier inoxydable et un coton-tige. Nous utilisons une chambre d'enregistrement fabriquée maison pour mesurer le potentiel évoqué rétinien (ERG).

Le corps est conçu pour contenir un réservoir de solution saline en contact avec l'œil. Le couvercle contient un fil de chlorure d'argent permettant de coupler la solution conductrice à un amplificateur, ainsi qu'un petit orifice dimensionné pour accueillir une DEL avant l'assemblage. La face inférieure de la chambre est recouverte de gelée de pétrole.

Les chambres sont ensuite fixées sur l'œil du crabe fer à cheval à l'aide de deux vis remplies de solution saline et bouchonnées. L'animal est placé dans une cage étanche à la lumière, dans un réservoir rempli d'eau de mer recouvrant les branchies. Le câble de la DEL est inséré dans le couvercle de la chambre.

Le câble de signal est fixé au fil de la chambre et le câble de référence à l'une des vis implantées, et les deux câbles sont connectés à l'étage d'entrée d'un amplificateur différentiel à haute impédance pour l'amplification du signal et le filtrage du bruit. La cage est ensuite fermée afin d'empêcher la lumière ambiante d'atteindre l'animal. L'étage d'entrée est connecté à l'amplificateur, et les filtres de l'amplificateur sont réglés pour laisser passer les fréquences inférieures à environ 10 hertz.

À partir de là, le signal monte vers l'oscilloscope pour visualisation et vers une carte d'acquisition de données pour l'analyse et le stockage par ordinateur. Nous utilisons un programme personnalisé écrit dans LabVIEW pour délivrer des stimuli lumineux provenant de la DEL et pour enregistrer le signal d'ERG. La DEL est déclenchée par une impulsion de 100 millisecondes à cinq volts toutes les 10 minutes. À gauche, on affiche la forme d'onde d'ERG correspondant à chaque éclair lumineux, et à droite, on trace l'amplitude crête à crête des formes d'onde successives afin de suivre les variations de la sensibilité oculaire au fil du temps.

À l'aide des enregistrements du potentiel de réponse rétinien (ERG), on peut étudier les effets de l'adaptation à la lumière et de la modulation neuronale circadienne. L'œil transmet des messages visuels au cerveau et les réponses en potentiels d'action de ses fibres du nerf optique. Ces messages codés peuvent être analysés par un enregistrement extracellulaire réalisé sur des fibres nerveuses individuelles.

Les messages du rythme circadien rétroagissant vers l'œil peuvent également être étudiés selon cette méthode. Les outils nécessaires à cette procédure comprennent un tournevis, une solution de Ringer, des pinces à verge, des ciseaux, une chambre d'enregistrement, des pinces courbes, une sonde fine en forme d'aiguille, un scalpel émoussé, des ciseaux chirurgicaux et une électrode sectionnelle. Les chambres d'enregistrement sont conçues avec une languette permettant d'accommoder le nerf ; 20 millilitres de sang peuvent être prélevés du cœur du crabe en insérant une aiguille de calibre 16 entre les muscles de la charnière et le cœur.

L'exsanguination n'est pas nécessaire, mais facilite la dissection du nerf optique lorsque l'animal est fixé sur la plateforme. L'emplacement du nerf optique est estimé en traçant une ligne légèrement courbe sur le carpe entre les yeux latéral et médian. Un trou circulaire est ensuite pratiqué dans le carpe à l'aide d'un refin.

Le trou possède le même diamètre que le fond de la chambre. Le centre du trou se situe à environ deux centimètres en avant de l’œil latéral et légèrement en dorsal par rapport à la ligne, de sorte que le nerf s’étende le long de la portion ventrale de la chambre. Le tissu conjonctif recouvrant est retiré jusqu’à ce qu’une longueur complète du nerf soit visible, et le nerf exposé est dégagé des tissus environnants et sous-jacents. Un brin de fil est passé autour du nerf et tiré dans la chambre à travers l’ouverture semi-circulaire située en bas.

Par cette même ouverture, le nerf est doucement guidé dans la chambre en tirant sur le fil. Lorsque le nerf pénètre dans la chambre, le fond est poussé dans le trou afin de minimiser l'étirement du nerf. La chambre est ensuite fixée avec deux vis et remplie de solution de Ringer.

Après la fixation de la chambre, l'animal est placé dans une cage à marée claire dans un réservoir rempli d'eau de mer recouvrant les branchies. L'intérieur de la chambre est visualisé au stéréomicroscope et de la ouate est disposée autour de l'ouverture inférieure afin d'empêcher toute fuite de sang dans la chambre et de ringer à l'extérieur. La chambre est remplie à nouveau avec une solution de Ringer fraîche.

Les tissus résiduels sont retirés à l’aide de ciseaux fins et de pinces. Une petite incision est pratiquée dans la gaine qui encapsule le nerf, puis le nerf est séparé de la gaine à l’aide d’une sonde fine. La gaine est progressivement déroulée et retirée en coupant longitudinalement le long du nerf.

Un petit faisceau de fibres est alors séparé du nerf à l’aide de la sonde et coupé à l’extrémité la plus éloignée de l’œil pour l’enregistrement des fibres afférentes, et à l’extrémité la plus proche de l’œil pour l’enregistrement des fibres efférentes. Nous utilisons une électrode à section d’AM remplie de solution saline pour l’enregistrement, qui est reliée par un tube à une seringue de Gilson pour l’aspiration. La pointe de l’électrode est fabriquée en chauffant et en polissant l’extrémité d’une capillarité en verre borosilicaté de un millimètre de diamètre. Une connexion A et B assure la liaison du signal, tandis que la liaison de référence est constituée par un fil en chlorure d’argent enroulé autour de l’électrode afin de réduire le bruit.

L'extrémité de l'électrode est positionnée dans la chambre d'enregistrement et l'extrémité coupée du faisceau nerveux est aspirée dans l'embout en verre. Les câbles du signal et de référence sont reliés à l'étage d'entrée d'un amplificateur différentiel pour l'amplification du signal et le filtrage du bruit. La sortie de l'amplificateur est ensuite envoyée vers un oscilloscope pour visualisation, ainsi que vers une carte d'acquisition de données pour analyse et stockage informatiques.

Nous utilisons un programme personnalisé écrit en LabVIEW pour contrôler les stimuli lumineux et un discriminateur numérique de pics pour enregistrer les trains de pics. Un guide de lumière en fibre optique est utilisé pour l'illumination de cellules individuelles, tandis qu'un écran vidéo contrôlé par ordinateur sert à la stimulation par motifs avec des enregistrements du nerf optique, permettant d'étudier la transmission du signal entre les yeux et le cerveau au niveau intrarétinien. L'enregistrement consiste à insérer une microélectrode directement dans les cellules de l'œil et à mesurer les fluctuations de potentiel intracellulaire induites par la lumière.

Les outils nécessaires pour cette procédure comprennent un tournevis, une plateforme lucide en forme de L. Les trous filetés accueillent un micro-électrode au-dessus de l'électrode en verre, des vis en acier inoxydable, des pinces et un scalpel fin. Après avoir préparé le crabe, un arbre stable, une plateforme en bois, une plaque lucide équipée de trous filetés prédéfinis est fixée au carpe avec deux vis sur le côté et une sur le dessus.

L'animal est placé dans une cage étanche à la lumière, dans un réservoir rempli d'eau de mer recouvrant les branchies. Un micropositionneur motorisé est fixé solidement à la lame à l'aide de vis, et le bras du positionneur est aligné au-dessus de l'œil. Un lot de micro-pipettes en verre est tiré à partir de verre silicaté de un millimètre de diamètre extérieur, et les pointes sont remplies par capillarité.

En plaçant les pipettes dans un flacon contenant une solution de chlorure de potassium à trois molaire pendant quelques minutes, le reste de la pipette est rempli manuellement avec la solution saline et inséré dans un porte-électrode microscopique prérempli de solution afin d'éviter la formation de bulles. Le porte-électrode est ensuite inséré dans l'étage de tête d'un amplificateur intracellulaire fixé au micropositionneur. Une section de la rétine est exposée en découpant soigneusement un petit carré de la cornée dorsale.

Avec le scalpel, une goutte de solution de Ringer est déposée sur le tissu exposé afin d'éviter son assèchement, et la micropipette est avancée vers la rétine. Lorsque la pointe de la pipette touche la solution, le mode d'injection de courant de l'amplificateur intracellulaire est activé et l'impédance de l'électrode est mesurée ; les micropipettes dont l'impédance n'est pas comprise entre 20 et 70 mégohms sont écartées. Celles dont l'impédance se situe dans cette plage sont avancées, par pas de taille micrométrique, dans la rétine et pénétrées dans les cellules en faisant vibrer électroniquement la pointe ; des stimulations lumineuses sont alors appliquées pour pénétrer les cellules à l’aide d’un câble de fibre optique ou d’un écran vidéo.

Trois types de cellules peuvent être observés dans l'œil du crabe fer à cheval : les cellules ular, les cellules excentriques et les cellules pigmentaires. Les cellules ular présentent une importante réponse dépolarisante à la lumière, les cellules excentriques émettent une série de potentiels d'action superposés à une réponse dépolarisante, tandis que les cellules pigmentaires ne montrent aucune réponse à la lumière. La réponse est observée sur un oscilloscope et enregistrée sur un ordinateur à l'aide d'enregistrements intrarétiniens. On peut ainsi étudier la base cellulaire de la vision.

En conclusion, nous avons montré comment réaliser des enregistrements d'électrorétinogrammes, des enregistrements du nerf optique et des enregistrements intrarétiniens chez les crabes fers à cheval in vivo. Ces méthodes, largement utilisées, offrent des aperçus uniques sur les mécanismes neuronaux du traitement de l'information visuelle chez les crabes fers à cheval. Elles sont non seulement simples à appliquer dans un laboratoire de recherche, mais peuvent également être facilement intégrées dans un laboratoire d'enseignement de neurophysiologie visuelle.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.