Grand Insérer production bibliothèque génomique de l'environnement

Bonjour, je m’appelle Marcus to et je travaille dans le laboratoire de Steven Helm au Département de microbiologie et d’immunologie de l’Université de la Colombie-Britannique. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour la construction d’une grande bibliothèque environnementale d’inserts. Je suis assisté dans la procédure d’aujourd’hui par San Lee, qui effectuera l’emballage des phages et l’infection de l’hôte de la bibliothèque, e coli, ainsi qu’Elise Hawley et Chin Yang qui effectueront le prélèvement de la colonie.

Nous avons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la structure et le métabolisme des communautés microbiologiques dans les environnements marins et terrestres. Alors commençons. Ce protocole de création d’une bibliothèque d’ADN commence à la suite de procédures d’isolement et de cisaillement de l’ADN génomique à partir d’échantillons de biomasse que nous avons détaillées dans la série d’articles ci-joints.

Les prochaines étapes préparent l’ADN SHE à la ligature dans le vecteur SMID PCC. La première étape consiste à réparer les extrémités des morceaux d’ADN SHE et à phosphoryler. Les cinq extrémités principales, tous les réactifs nécessaires à cette étape sont inclus dans le kit de production de la banque PCC un SMID de l’épicentre pour mettre en place la réaction de réparation finale, décongeler tous les réactifs sur de la glace, puis combiner le tampon de réparation d’extrémité DNTP, mélanger un TP jusqu’à 20 microgrammes d’ADN d’insertion à 0,5 microgramme par microlitre de mélange d’enzymes et d’eau Pour atteindre 80 microlitres, centrifuger brièvement le tube pour amener tout le liquide à la fond.

Incuber la réaction de réparation d’extrémité à température ambiante pendant 45 minutes à une heure. Ensuite, chauffez, il inactive les enzymes à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pendant l’incubation de la réparation finale, vous pouvez préparer le gel pour l’étape suivante.

L’électrophorèse sur gel en champ pulsé ou PFGE permet d’isoler des molécules d’ADN allant de 30 à 60. L’électrophorèse est une méthode électrophorétique permettant de résoudre ces gros fragments qui s’assemblent lors de l’électrophorèse standard. Pour commencer, préparez un gel à 1 % en utilisant des aros à faible point de fusion dans 150 millilitres d’un tampon de fonctionnement XTAE.

Choisissez des peignes qui vous permettront de charger l’intégralité de l’échantillon de 80 microlitres d’ADN de réparation d’extrémité plus le tampon de chargement dans un ou deux puits. Soyez particulièrement prudent lors de la manipulation du gel car il s’agit de gels agricoles à faible point de fusion. Se casse très facilement pendant que le gel se solidifie.

Préparez la chambre d’électrophorèse. Ajoutez 2,2 litres d’un XTAE dans la chambre et allumez la machine pour faire circuler la mémoire tampon en marche. Réglez le dispositif de refroidissement à 14 degrés Celsius et réglez la pompe à 70 tr/min.

Inclure un marqueur PFG de milieu de gamme également de NEB. Pour éviter de couper trop fortement votre gel, extrudez des aros de la seringue de gel et coupez un petit bouchon à l’extrémité avec le scalpel. Placez le bouchon à l’avant du puits et scellez-le avec de l’aros fondu.

Assurez-vous que le tampon de fonctionnement a refroidi à 14 degrés Celsius avant de charger votre gel. Dans le premier puits, chargez cinq microlitres de New England Biolabs Lambda Hindi, trois digestes. Dans le deuxième puits, chargez un microlitre du marqueur de taille de contrôle Smid, dilué dans 10 microlitres d’eau stérile et un tampon de chargement.

Ensuite, chargez votre extrémité réparée et inactivée à la chaleur ainsi que le tampon de chargement. Fermez le couvercle et programmez la machine. Le gel fonctionnera toute la nuit ou 12 heures.

Lorsque le gel a fini de couler, utilisez une coloration cyber gold pour visualiser l’ADN diluer le cyber or. Dans 250 millilitres d’un XTAE, placez votre gel dans la solution et colorez pendant une heure dans le noir cyberg gold est sensible à la lumière pendant que le gel tache. Préparez un bain-marie à 70 degrés Celsius et un F 45 degrés Celsius pour l’étape d’extraction du gel qui suit.

L’étape suivante consiste à exciser et à gélifier. Purifiez l’ADN dans la plage de taille souhaitée de 30 à 60 kilobases. Emportez votre gel coloré avec un tube de micro-subterfuge vide, déchiré et étiqueté et un scalpel stérile jusqu’au transluminateur de lumière bleue.

Tapissez le transluminateur d’une pellicule plastique pour éviter de contaminer votre gel. Levez les lunettes et allumez la lumière bleue. Maintenant, vous pouvez voir votre ADN génomique réparé et le marqueur de taille de contrôle FO smid Avec le scalpel, excisez une tranche de gel de cinq à sept millimètres de large qui a migré avec et légèrement au-dessus du marqueur de taille de contrôle smid.

Utilisez le marqueur PFG comme limite supérieure pour votre tranche. Transférez la tranche dans le tube déchiré. Vous pouvez conserver les tranches à moins 20 degrés Celsius jusqu’à un an avant de continuer.

Il est maintenant temps de se solidifier. Purifiez l’ADN de votre tranche. Pesez le tube contenant votre tranche de gel et calculez le poids de la tranche en soustrayant le poids de la déchirure.

Ensuite, faites fondre la tranche dans le bain-marie à 70 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Une fois que votre tranche de gel est complètement fondue, transférez rapidement le tube dans le bain-marie à 45 degrés Celsius. En gardant à l’esprit qu’un milligramme de gel solide a un volume d’un microlitre après fusion.

Ajouter une unité ou un microlitre de préparation d’enzyme Jase pour 100 microlitres d’aros fondus. Incuber à 45 degrés Celsius pendant une heure. Ajoutez ensuite deux à quatre microlitres de plus et incubez à 45 degrés Celsius pendant une heure de chaleur supplémentaire.

Inactivez le gel à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes après la chaleur. En inactivant l’enzyme, placez le tube sur de la glace pendant 10 minutes puis centrifugez à vitesse maximale. 13 000 tr/min pendant 15 minutes pour granuler les particules insolubles.

Veiller à ne pas déranger le granulé. Retirez le surnageant supérieur contenant votre ADN purifié et transférez-le dans un tube de faucon de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez-le à trois millilitres d’eau stérile pour laver et concentrer l’ADN.

Transférez la solution du tube Falcon de 15 millilitres vers l’unité de filtration centrifuge Ancon Ultra à quatre avec une membrane ultra cell 10. Placez l’unité de filtration dans un rotor à godets oscillants à l’aide d’un tube faucon de 50 millilitres comme adaptateur et tournez à 4 000 GS pendant six à huit minutes. Centrifuger jusqu’à environ 100 à 500 microlitres de solution.

Restez sur le filtre et jetez le flux. Ajoutez ensuite trois millilitres supplémentaires d’eau stérile dans le tube de faucon vide. Transférez la solution dans le tube Amon et répétez l’étape de centrifugation.

Lavez une troisième fois le tube de faucon et réduisez le volume final collecté sur le filtre à 50 à 100 microlitres. Vous n’avez pas à vous soucier de perdre l’échantillon. Le filtre retiendra 50 microlitres de liquide même après une centrifugation prolongée.

Transférez la solution d’ADN restante du tube AmCon dans une unité de filtration centrifuge MicroCon YM 50 prélavée et rincez le tube Amon avec 50 microlitres supplémentaires d’eau stérile pour récupérer toute la centrifugeuse d’ADN. L’unité de filtration centrifuge MicroCon YM 50 dans une micro-centrifugeuse à 10 000 GS jusqu’à ce que le filtre soit encore légèrement recouvert de liquide. Vérifiez chaque minute.

S’il ne reste qu’une petite quantité de liquide sur le filtre. Retournez le filtre et récupérez votre solution d’ADN par une deuxième étape de centrifugation à 1000 GS pendant trois minutes dans un micro tube de centrifugation frais. Le volume résultant ne doit pas dépasser 10 à 15 microlitres au total.

Sinon, votre ADN pourrait être trop dilué pour la ligature. Vérifiez la concentration de la solution d’ADN résultante par NanoDrop ou Pico Green Assay. Récupéré et réparé.

L’ADN est maintenant prêt à être ligaturé au vecteur de clonage SMID PCC one FO pour la ligature et la décongélation de tous les réactifs sur la glace. Puis combiné dans l’ordre indiqué ici, en mélangeant après chaque ajout. Tout d’abord, ajoutez de l’eau stérile pour atteindre un volume de réaction de 10 microlitres.

Ensuite, 10 x tampon de ligature de liaison rapide, 10 millimolaires A-T-P-P-C-C un vecteur SMID et inséré à un rapport de 10 pour une molaire. Et enfin, lien rapide : l’ADN Ligase. Centrifugez brièvement le tube pour faire passer tout le liquide au fond.

Tapotez le tube et tournez à nouveau. Incuber la réaction de ligature à température ambiante pendant deux heures et inactiver l’enzyme à la chaleur pendant 10 minutes à 70 degrés Celsius. À ce stade, vous pouvez soit stocker la réaction de ligature à moins 20 degrés Celsius, soit passer à l’étape de l’emballage du phage.

L’étape suivante consiste à générer des phages bactériens qui fonctionneront pour introduire votre banque FO SMID dans e coli deux ou trois jours avant que vous ne prévoyiez de faire l’étape d’emballage du phage, étalez la souche de placage EPI 300 T fournie sur une simple plaque LB et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour obtenir des colonies uniques. Vous pouvez sceller cette plaque et la stocker à quatre degrés Celsius pour une utilisation future. La veille des réactions d’emballage, inoculez 50 millilitres de bouillon Albee plus 10 millimolaires de sulfate de magnésium avec une seule colonie de votre assiette Epi 300 Secouez à 225 tr/min et 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Le jour de l’emballage, les réactions inoculent un bouillon frais de 50 millilitres de LB plus 10 millimolaires de sulfate de magnésium avec cinq millilitres de culture de nuit. Culture, la bactérie à 37 degrés Celsius à une DO 600 de 0,8 à 1,0. Ne dépassez pas OD 600 de 1,0.

Diluez votre échantillon avant de mesurer sur le spectrophotomètre afin d’obtenir un résultat précis. Conserver sur de la glace ou à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous soyez prêt à continuer ou jusqu’à 72 heures. Maintenant que les bactéries sont prêtes pour l’infection, il est temps de préparer le dégel des phages.

Le maximum de plaques Lambda Packaging extrait sur de la glace. En utilisant un tube par réaction de ligature, la décongélation prendra environ 10 à 15 minutes. Pendant ce temps, pré-refroidissez un tube vide de 1,5 millilitre sur de la glace en utilisant à nouveau un tube par réaction.

Une fois que les extraits d’emballage Lambda ont été décongelés, transférez immédiatement dans 25 microlitres de chaque extrait d’emballage dans le tube de micro-fuge de 1,5 millilitre pré-réfrigéré et placez-le sur de la glace. Remettre le reste de l’extrait de l’emballage à moins 80 degrés Celsius. Laisser les extraits d’emballage décongelés sur de la glace trop longtemps réduira l’efficacité de l’infection.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la réaction de ligature à chaque 25 microlitres d’extraits décongelés sur de la glace mélangés en pipetant la solution plusieurs fois sans introduire de bulles d’air. Centrifuger brièvement pour consolider tout le liquide au fond des tubes et incuber les réactions d’emballage dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après 80 minutes d’incubation, décongeler l’extrait d’emballage restant sur de la glace.

Une fois la réaction d’emballage de 90 minutes terminée, ajoutez les 25 microlitres restants d’extrait d’emballage dans chaque tube de réaction. Incuber les réactions pendant 90 minutes supplémentaires à 30 degrés Celsius. Après la deuxième incubation, ajoutez 100 microlitres du tampon de dilution de phage préparé dans chaque tube d’emballage et mélangez doucement pour ajouter cinq microlitres de chloroforme dans chaque tube.

Maintenant, vous devriez avoir un volume total de 165 microlitres dans le tube. Un précipité visqueux peut se former après l’édition du chloroforme. Évitez ce précipité ainsi que la phase chloroforme organique lors du pipetage des particules de phages.

À ce stade, vous pouvez stocker les particules de phage emballées à quatre degrés pendant plusieurs jours si nécessaire, mais utilisez des phages fraîchement préparés pour de meilleurs résultats. Vous êtes maintenant prêt à infecter les cellules hôtes, que vous avez développées tout au long des étapes d’emballage du phage avec le phage emballé. Ajouter le phage emballé à l’EPI 300 T une cellule hôte résistante OD 600.8 à 1.0 dans le rapport de 400 microlitres d’epi 300 T une cellule résistante pour 10 microlitres de particules de phage.

Pour éviter de pipeter du chloroforme à partir du fond du tube de phage emballé, nous utilisons 125 microlitres de particules de phage emballées et cinq millilitres de cellules hôtes résistantes epi 300 T préparées mélangées doucement, puis incubées à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. L’étape suivante consiste à déterminer le titre du phage emballé. Pour ce faire, vous devez placer les bactéries infectées sur un support pour sélectionner les cellules infectées.

Ensuite, en comptant les colonies résultantes et en divisant par le volume de phage ajouté aux bactéries que vous avez placées. Le SMID C one contient un gène de résistance au chloramphénicol. Donc, pour sélectionner les clones infectés, placez la bactérie sur des plaques LB contenant du chloramphénicol.

Étalez deux fois 50 microlitres et deux fois 10 microlitres de cellules résistantes EPI 300 T infectées par des phages sur quatre plaques distinctes et placez les plaques à l’envers dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures, pas plus de 48 heures jusqu’à ce que des colonies se forment. Pendant ce temps, récoltez les cellules résiduelles résistantes à l’EPI 300 T one de l’infection de cinq millilitres par centrifugation à 3 500 GS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant.

Ajoutez un millilitre de LB avec 20 % de glycérol dans le tube de reus. Suspendez la pastille de cellule et le quat à 100 microlitres chacun dans des tubes de flacon cryogénique de deux millilitres, congelez immédiatement et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour une utilisation ultérieure dans l’étape de cueillette de la colonie le lendemain, comptez le nombre de clones sur les quatre plaques de l’incubateur à 37 degrés Celsius et déterminez le titre du phage emballé, que vous utiliserez à l’étape suivante.

Le stock de glycérol résistant EPI 300 T one congelé contient des cellules transduites avec tous les différents plasmides de votre bibliothèque. Ensuite, étalez une quantité appropriée en fonction du titre viral et de la taille de la plaque de chaque smid. Cloner sur 2 carrés de 45 x 2 45 millimètres.

Plaques d’essai biologique de LB avec chloramphénicol à l’aide de billes de verre. Ajoutez également une petite quantité de bouillon LB dans l’assiette pour répartir uniformément vos cellules. Gardez à l’esprit que la préparation du stock de glycérol concentre en outre environ cinq fois vos cellules.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures les jours de cueillette des colonies, préparer 96 ou 3 plaques de 84 puits remplies de 200 microlitres ou 70 microlitres par puits de bouillon LB. Complété par 12,5 microgrammes de chloramphénicol par millilitre de bouillon pour la sélection des antibiotiques et 10 % de glycérol pour la congélation. Nous utilisons le système automatisé de remplissage de trois plaques qfi pour cette étape.

L’étape suivante consiste à prélever des colonies de vos plaques de LB CHLORAMPHÉNICOL préparées dans vos plaques préparées de 96 ou 3 84 puits pour la congélation. Pour cette étape, nous utilisons le robot de prélèvement de clones qix deux, selon le manuel d’utilisation, pour créer un environnement stérile autour de la zone de prélèvement de clones. Allumez la lumière UV pendant 30 minutes pendant que la lumière UV est allumée.

Préparez 500 millilitres d’eau de Javel à 1 %, 500 millilitres d’eau déminéralisée stérile et 500 millilitres d’éthanol à 80 %. Lorsque la lumière UV s’éteint, remplissez les plateaux comme indiqué de l’arrière vers l’avant. Remplissez 1 % d’eau de Javel, puis d’eau déminéralisée en autoclave et 80 % d’éthanol dans le plateau avant.

Assurez-vous qu’ils sont pleins car les aiguilles de cueillette ne peuvent pas être lavées correctement sans une solution de lavage suffisante. Après avoir configuré les paramètres pour un prélèvement optimal, retirez les couvercles de vos plaques bactériennes et de vos plaques de 96 ou 3 84 puits remplies de LB et positionnez-les entre les poteaux dans les pics Q. Les plaques de la zone de travail doivent être serrées contre le coin avant droit afin qu’elles ne puissent pas bouger pendant le prélèvement.

Fermez ensuite le panneau avant. Une fois tous les paramètres définis, la procédure de prélèvement peut commencer. Lorsque toute la cueillette est terminée, rincez les brosses et les plateaux avec de l’eau déminéralisée et laissez-les sécher sur le banc.

Nettoyez tous les déversements qui ont pu se produire et essuyez l’intérieur du CICS avec de l’éthanol à 80 %. Assurez-vous que toutes les plaques de stock de glycérol sont étiquetées et placez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures pour faire pousser une culture à partir de chaque colonie choisie. Laissez une note sur l’incubateur qui contient la date, le nombre de plaques incubées, l’heure d’incubation, l’heure de retrait et vos initiales.

Après l’incubation, vous avez votre bibliothèque. Chaque puits contient une culture d’un clone bactérien contenant le PCC un pour cent ligaturé à un morceau d’ADN pur de votre échantillon de départ. Congelez les plaques à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme et félicitez-vous d’un travail bien fait.

Le protocole présenté décrit la procédure de génération d’une bibliothèque de smids environnementaux pour capturer le contenu génétique d’une communauté microbienne dans un habitat donné. Ce protocole doit créer une bibliothèque SMID, représentative du contenu génétique de l’environnement échantillonné, et doit permettre au lecteur d’optimiser les étapes critiques. Si la quantité de clones FO smid obtenus à la fin de l’ensemble de la procédure est trop faible.

Nous venons de vous montrer comment construire la banque FO SMID à partir d’ADN génomique dérivé d’un échantillon d’eau de mer. Lors de cette procédure, il est important de commencer avec de l’ADN génomique de haute qualité. Préparez toutes vos plaques et tous vos réactifs avant de commencer et prévoyez suffisamment de temps pour ce processus en plusieurs étapes.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.