Grand Insérer production bibliothèque génomique de l'environnement

Bonjour, je suis Marcus to du laboratoire de Steven Helm au Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de la Colombie-Britannique. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour la construction d'une bibliothèque environnementale à grand insert. M'aidant dans cette procédure aujourd'hui, San Lee effectuera l'encapsidation des phages et l'infection de l'hôte bactérien de la bibliothèque e coli, ainsi que Elise Hawley et Chin Yang qui se chargeront du prélèvement des colonies.

Nous disposons de cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la structure et le métabolisme des communautés microbiennes dans les environnements marins et terrestres. Commençons donc. Ce protocole de création d'une bibliothèque d'ADN fo smid commence après l'isolement et la fragmentation de l'ADN génomique provenant d'échantillons de biomasse, des étapes que nous avons détaillées dans des articles JoVE accompagnants.

Les quelques étapes suivantes préparent l'ADN SHE pour la ligature dans le vecteur SMID PCC one. La première étape consiste à réparer les extrémités des fragments d'ADN SHE et à les phosphoryler. Concernant les extrémités 5', tous les réactifs nécessaires à cette étape sont inclus dans le kit de production de bibliothèque PCC one SMID d'Epicenter. Pour mettre en place la réaction de réparation des extrémités, décongeler tous les réactifs sur de la glace, puis combiner le tampon de réparation des extrémités, le mélange de dNTP, l'enzyme T4 polynucléotide kinase (TP), jusqu'à 20 microgrammes d'ADN insert SHE à une concentration de 0,5 microgramme par microlitre, le mélange enzymatique et de l'eau afin d'obtenir un volume final de 80 microlitres. Centrifuger brièvement le tube pour rassembler tout le liquide au fond.

Incuber la réaction de réparation des extrémités à température ambiante pendant 45 minutes à une heure. Ensuite, inactiver les enzymes par une élévation de température à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pendant l'incubation de la réparation des extrémités, vous pouvez préparer le gel pour l'étape suivante.

Électrophorèse en champ pulsé, ou PFGE, votre objectif est d'isoler des molécules d'ADN allant de 30 à 60 kilobases. La PFGE est une méthode électrophorétique permettant de séparer ces grands fragments qui migrent ensemble lors d'une électrophorèse standard. Pour commencer, préparez un gel à 1 % en utilisant de l'agarose à bas point de fusion dans 150 millilitres de tampon de migration 1X TAE.

Choisissez des peignes qui vous permettront de charger tout l'échantillon de 80 microlitres d'ADN après réparation des extrémités, additionné de tampon de charge, dans un ou deux puits. Manipulez particulièrement avec précaution le gel, car les gels en agarose à bas point de fusion se brisent très facilement pendant la solidification.

Préparez la chambre d'électrophorèse. Ajoutez 2,2 litres de XTAE dans la chambre et mettez la machine en marche pour faire circuler le tampon de migration. Réglez le dispositif de refroidissement sur 14 degrés Celsius et le pompe sur 70 tr/min.

Inclure un marqueur PFG à gamme intermédiaire provenant également de NEB. Pour éviter de couper votre gel trop haut, extruder de l'agarose à partir de la seringue à gel et prélever un petit bouchon à l'extrémité à l'aide du scalpel. Placer le bouchon à l'avant du puits et sceller avec de l'agarose fondue.

Veillez à ce que le tampon de migration ait refroidi à 14 degrés Celsius avant de charger votre gel. Dans le premier puits, chargez cinq microlitres du digestif Lambda Hindi III de New England Biolabs. Dans le deuxième puits, chargez un microlitre du marqueur de taille témoin Smid dilué dans 10 microlitres d'eau stérile additionnée de tampon de charge.

Ensuite, chargez votre mélange réparé à l'extrémité et inactivé par la chaleur, ainsi que le tampon de charge. Fermez le couvercle et programmez l'appareil. Le gel migrera toute la nuit ou pendant 12 heures.

Lorsque l'électrophorèse est terminée, utilisez une coloration au cyber gold pour visualiser l'ADN. Diluez le cyber gold dans 250 millilitres de tampon 1X TAE, placez votre gel dans la solution et laissez colorer pendant une heure à l'abri de la lumière, car le cyber gold est sensible à la lumière. Pendant que le gel colore, préparez un bain-marie à 70 degrés Celsius et un autre à 45 degrés Celsius pour l'étape d'extraction du gel qui suit.

L'étape suivante consiste à exciser et purifier sur gel l'ADN dans la plage de taille souhaitée, comprise entre 30 et 60 kilobases. Prenez votre gel coloré, un tube microcentrifuge vide, déchiré et étiqueté, ainsi qu'un scalpel stérile, et rendez-vous au transilluminateur à lumière bleue.

Recouvrez le transluminateur d'un film plastique afin d'éviter toute contamination croisée de votre gel. Mettez les lunettes de protection et allumez la lumière bleue. Vous pouvez maintenant observer votre ADN génomique réparé aux extrémités ainsi que le marqueur de taille FO smid. À l'aide du scalpel, excisez un morceau de gel d'une largeur de cinq à sept millimètres, ayant migré au niveau du marqueur de taille smid ou légèrement au-dessus.

Utilisez le marqueur PFG comme limite supérieure pour votre coupe. Transférez la coupe dans le tube percé. Vous pouvez conserver les tranches à moins 20 degrés Celsius pendant jusqu'à un an avant de poursuivre.

Il est maintenant temps de faire la gélose. Purifiez l'ADN à partir de votre tranche. Pesez le tube contenant votre tranche de gel et calculez le poids de la tranche en soustrayant le poids à vide.

Ensuite, faites fondre la tranche de gel dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Une fois que votre tranche de gel est complètement fondue, transférez rapidement le tube dans un bain-marie à 45 degrés Celsius. Gardez à l'esprit qu'un milligramme de gel solide a un volume d'un microlitre après fusion.

Ajoutez une unité ou un microlitre de préparation enzymatique Jase par 100 microlitres d'aros fondu. Incubez à 45 degrés Celsius pendant une heure. Ajoutez ensuite deux à quatre microlitres supplémentaires de les et incubez à 45 degrés Celsius pendant une heure supplémentaire à chaleur.

Inactiver le gel à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes après chauffage. Après inactivation de l'enzyme, placer le tube sur de la glace pendant 10 minutes, puis centrifuger à vitesse maximale, 13 000 tr/min pendant 15 minutes, afin de former un culot avec les particules insolubles.

En prenant soin de ne pas perturber le culot. Retirer le surnageant supérieur contenant l'ADN purifié et le transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, le diluer avec trois millilitres d'eau stérile pour laver et concentrer l'ADN.

Transférez la solution du tube Falcon de 15 millilitres vers l'unité de filtration centrifuge Ancon Ultra 4 munie d'une membrane ultra cell 10. Placez l'unité de filtration dans un rotor à godets oscillants en utilisant un tube Falcon de 50 millilitres comme adaptateur et faites tourner à 4 000 ×g pendant six à huit minutes. Effectuez la centrifugation jusqu'à l'obtention d'environ 100 à 500 microlitres de solution.

Restez sur le filtre et jetez le flux traversant. Ensuite, ajoutez trois millilitres supplémentaires d'eau stérile dans le tube falcon vide. Transférez la solution dans le tube Amon et répétez l'étape de centrifugation.

Rincez le tube Falcon une troisième fois et réduisez le volume final recueilli sur le filtre à 50 à 100 microlitres. Vous n'avez pas à vous inquiéter de perdre l'échantillon. Le filtre retiendra 50 microlitres de liquide même après une centrifugation prolongée.

Transférez la solution d'ADN restante du tube AmCon vers une unité de filtration centrifuge MicroCon YM 50 préalablement lavée et rincez le tube Amon avec 50 microlitres supplémentaires d'eau stérile afin de récupérer tout l'ADN lors de la centrifugation. Placez l'unité de filtration centrifuge MicroCon YM 50 dans une microcentrifugeuse à 10 000 ×g jusqu'à ce que le filtre soit encore légèrement recouvert de liquide. Vérifiez toutes les minutes.

Si seulement une petite quantité de liquide reste sur le filtre, retournez le filtre et récupérez votre solution d'ADN par une seconde étape de centrifugation à 1000 GS pendant trois minutes dans un nouveau tube microcentrifuge. Le volume obtenu ne doit pas dépasser 10 à 15 microlitres au total.

Sinon, votre ADN pourrait être trop dilué pour la ligation. Vérifiez la concentration de la solution d'ADN obtenue par NanoDrop ou par dosage au Pico Green. Récupéré et réparé.

L'ADN est désormais prêt à être ligaturé au vecteur de clonage PCC one FO SMID. Dégeler toutes les réactifs sur de la glace. Ensuite, les combiner dans l'ordre indiqué ici, en mélangeant après chaque ajout. Ajouter d'abord de l'eau stérile afin d'obtenir un volume réactionnel de 10 microlitres.

Ensuite, ajouter 10 x tampon de ligature rapide, de l'ATP-CCPC à 10 millimolaire, un vecteur SMID et l'insert à un ratio molaire de 10 pour 1. Et enfin, la ligase ADN rapide. Centrifuger brièvement le tube afin de rassembler tout le liquide au fond.

Tapotez le tube et effectuez une nouvelle centrifugation. Incubez la réaction de ligation à température ambiante pendant deux heures, puis inactiver l'enzyme par une incubation de 10 minutes à 70 degrés Celsius. À ce stade, vous pouvez soit conserver la réaction de ligation à moins 20 degrés Celsius, soit passer à l'étape d'encapsidation dans le phage.

L'étape suivante consiste à générer des bactériophages qui permettront d'introduire votre banque FO SMID dans E. coli. Deux ou trois jours avant la réalisation de l'étape d'encapsidation des phages, étaler la souche de EPI 300 T1 résistant fournie sur une plaque LB ordinaire et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius afin d'obtenir des colonies isolées. Vous pouvez sceller cette plaque et la conserver à 4 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. La veille des réactions d'encapsidation, inoculer 50 millilitres de bouillon Albee supplémenté de 10 millimolaire de sulfate de magnésium avec une colonie unique provenant de votre plaque Epi 300. Agiter à 225 tr/min à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit.

Le jour des réactions d'emballage, inoculer 50 millilitres frais de bouillon LB contenant 10 millimolaire de sulfate de magnésium avec 5 millilitres de la culture prélevée de la veille. Faire croître les bactéries à 37 degrés Celsius jusqu'à une DO 600 comprise entre 0,8 et 1,0. Ne pas dépasser une DO 600 de 1,0.

Diluez votre échantillon avant de le mesurer au spectrophotomètre afin d'obtenir un résultat précis. Conservez-le sur de la glace ou à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que vous soyez prêt à poursuivre, ou jusqu'à 72 heures. Maintenant que les bactéries sont prêtes pour l'infection, il est temps de préparer le dégel du bactériophage.

Les extraits de plaques max Lambda pour l’emballage sont conservés sur glace. En utilisant un tube par réaction de ligature, la décongélation prendra environ 10 à 15 minutes. Pendant ce temps, pré-refroidissez à nouveau un tube vide de 1,5 millilitre sur glace, en utilisant un tube par réaction.

Une fois les extraits d’emballage Lambda décongelés, transférez immédiatement 25 microlitres de chaque extrait d’emballage dans un tube microfuge de 1,5 millilitre préalablement refroidi et placez-le sur de la glace. Remettez le reste de l’extrait d’emballage à moins 80 degrés Celsius. Laisser les extraits d’emballage décongelés trop longtemps sur la glace réduira l’efficacité d’infection.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la réaction de ligation à chacun des 25 microlitres des extraits décongelés sur de la glace en mélangeant la solution plusieurs fois par pipetage, sans introduire de bulles d'air. Faites une courte centrifugation pour regrouper tout le liquide au fond des tubes, puis incubez les réactions d'encapsidation dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après 80 minutes d'incubation, décongelez le reste de l'extrait d'encapsidation sur de la glace.

Une fois la réaction d'emballage de 90 minutes terminée, ajouter les 25 microlitres restants d'extrait d'emballage à chaque tube de réaction. Incuber les réactions pendant 90 minutes supplémentaires à 30 degrés Celsius. Après la deuxième incubation, ajouter 100 microlitres du tampon de dilution de bactériophages préparé dans chaque tube d'emballage et mélanger doucement ; ajouter ensuite cinq microlitres de chloroforme à chaque tube.

Vous devez maintenant avoir un volume total de 165 microlitres dans le tube. Un précipité visqueux peut se former après l'ajout de chloroforme. Évitez ce précipité ainsi que la phase organique de chloroforme lors du prélèvement des particules phagiques à la pipette.

À ce stade, vous pouvez conserver les particules de phage conditionées à quatre degrés pendant plusieurs jours si nécessaire, mais utilisez du phage fraîchement préparé pour de meilleurs résultats. Vous êtes maintenant prêt à infecter les cellules hôtes, que vous avez fait croître pendant les étapes de conditionnement du phage, avec le phage conditioné. Ajoutez le phage conditioné à des cellules hôtes résistantes EPI 300 T1 ayant un OD 600 compris entre 0,8 et 1,0, selon un rapport de 400 microlitres de cellules résistantes EPI 300 T1 pour chaque 10 microlitres de particules de phage.

Pour éviter de pipeter du chloroforme provenant du fond du tube contenant les particules de phage emballés, nous utilisons 125 microlitres de particules de phage emballés et cinq millilitres de cellules hôtes résistantes epi 300 T1 préparées, que l'on mélange doucement, puis on incube à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. L'étape suivante consiste à déterminer le titre du phage emballé. Pour ce faire, on étale les bactéries infectées sur un milieu permettant de sélectionner les cellules infectées.

Ensuite, comptez les colonies obtenues et divisez par le volume de bactériophages ajouté aux bactéries que vous avez ensemencées. Le C un SMID contient un gène de résistance au chloramphénicol. Ainsi, pour sélectionner les clones infectés, ensemencez les bactéries sur des plaques de milieu LB contenant du chloramphénicol.

Étaler deux fois 50 microlitres et deux fois 10 microlitres des cellules EPI 300 résistantes au T1 infectées par le bactériophage sur quatre plaques séparées, puis placer les plaques retournées dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures, sans dépasser 48 heures, jusqu'à formation des colonies. Pendant ce temps, récolter les cellules EPI 300 résistantes au T1 résiduelles du milieu d'infection de cinq millilitres par centrifugation à 3 500 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant.

Ajoutez un millilitre de LB contenant 20 % de glycérol au tube de resuspension. Suspendez le culot cellulaire et répartissez en aliquotes de 100 microlitres chacune dans des tubes cryogéniques de deux millilitres, puis congélez immédiatement et stockez à moins 80 degrés Celsius. Pour une utilisation ultérieure lors de l'étape de sélection des colonies le jour suivant, comptez le nombre de clones sur les quatre plaques placées dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et déterminez la titration du phage emballé, que vous utiliserez à l'étape suivante.

La souche glycérolée congelée d'EPI 300 T résistante contient des cellules transduites avec tous les plasmides différents de votre banque. Ensuite, étalez une quantité appropriée en fonction du titre viral et de la taille de la plaque de chaque smid. Clonez sur un carré de 2,45 par 2,45 millimètres.

Plaques de bioessai d'agar LB contenant du chloramphénicol, utilisant des billes de verre. Ajoutez également une petite quantité de bouillon LB sur la plaque afin de répartir uniformément vos cellules. Gardez à l'esprit que la préparation du stock de glycérol concentre en outre vos cellules d'environ cinq fois.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures les jours de prélèvement des colonies ; préparer 96 ou 3 plaques de 84 puits contenant respectivement 200 microlitres ou 70 microlitres de bouillon LB par puit. Le bouillon est supplémenté avec 12,5 microgrammes de chloramphénicol par millilitre pour la sélection antibiotique et 10 % de glycérol pour la congélation. Nous utilisons le système automatisé de remplissage de plaques qfi trois pour cette étape.

L'étape suivante consiste à prélever des colonies à partir de vos boîtes LB CHLORAMPHÉNICOL préparées et à les déposer dans vos plaques 96 ou 3 84 puits préparées pour congélation. Pour cette étape, nous utilisons le robot de sélection de clones qix two, conformément au manuel de l'utilisateur, afin de créer un environnement stérile autour de la zone de sélection des clones. Allumez la lampe UV pendant 30 minutes ; la lampe UV doit rester allumée pendant toute cette durée.

Préparez 500 millilitres d'eau de Javel à 1 %, 500 millilitres d'eau déionisée stérile et 500 millilitres d'éthanol à 80 %. Lorsque la lumière UV s'éteint, remplissez les bacs étiquetés de l'arrière vers l'avant. Remplissez d'abord avec l'eau de Javel à 1 %, puis avec l'eau déionisée stérilisée au autoclave, et enfin avec l'éthanol à 80 % dans le bac avant.

Veillez à ce qu'ils soient pleins, car les aiguilles de prélèvement ne peuvent pas être correctement lavées sans une solution de lavage suffisante. Après avoir configuré les paramètres optimaux pour le prélèvement, retirez les couvercles de vos boîtes de culture bactériennes et de vos plaques de 96 ou 384 puits remplies de LB, puis placez-les entre les supports du Q Picks. Les plaques situées dans la zone de travail doivent être bien serrées contre le coin avant droit afin qu'elles ne puissent pas bouger pendant le prélèvement.

Ensuite, fermez le panneau avant. Une fois tous les paramètres définis, la procédure de prélèvement peut commencer. Lorsque tout le prélèvement est terminé, rincez les brosses et les plateaux avec de l'eau déionisée et placez-les sur la paillasse pour les faire sécher.

Nettoyez tout déversement éventuel et essuyez l'intérieur du CICS avec de l'éthanol à 80 %. Assurez-vous que toutes les plaques de stocks glycérolés sont étiquetées, puis placez-les dans l'incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures afin de faire croître une culture à partir de chaque colonie prélevée. Laissez un mot sur l'incubateur indiquant le nombre de plaques incubées, la date, l'heure d'incubation, l'heure de retrait et vos initiales.

Après l'incubation, vous disposez de votre banque. Chaque puits contient une culture d'un clone bactérien portant le PCC, dans lequel un fragment d'ADN génomique a été ligaturé à un morceau d'ADN fragmenté provenant de votre échantillon initial. Congelez les plaques à moins 80 degrés Celsius pour une conservation à long terme et félicitez-vous pour un travail bien accompli.

Le protocole présenté décrit la procédure permettant de générer une bibliothèque environnementale d'ADN intégré à un vecteur SMID afin de capturer le contenu génétique d'une communauté microbienne dans un habitat donné. Ce protocole doit permettre de créer une bibliothèque SMID représentative du contenu génétique de l'environnement échantillonné et doit aider le lecteur à optimiser les étapes critiques. Si la quantité de clones SMID FO obtenue à la fin de l'ensemble de la procédure est trop faible.

Nous venons de vous montrer comment construire la bibliothèque FO SMID à partir d'ADN génomique obtenu à partir d'un échantillon d'eau de mer. Lors de cette procédure, il est important de commencer avec un ADN génomique de haute qualité. Ayez toutes vos plaques et réactifs prêts avant de commencer et prévoyez suffisamment de temps pour ce processus en plusieurs étapes.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.