Name: Grand Insérer production bibliothèque génomique de lenvironnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: Découvrez la construction d'une bibliothèque environnementale à grands inserts pour étudier la structure et le métabolisme des communautés microbiennes marines. Cette méthode permet l'analyse fonctionnelle et le séquençage futur.

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Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique et les sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada pour soutenir les études en cours sur les régions pauvres en oxygène des eaux côtières et océaniques ouverts. MT et SL ont été soutenus par des bourses de la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution (cmde). MT a également reçu le soutien de la bourse de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

Une procédure est décrite la manière la plus efficace de générer une grande bibliothèque-insert fosmide avec l&#39;ADN génomique provenant d&#39;un échantillon des eaux côtières. En amont d&#39;extraction d&#39;ADN génomique est décrit dans un protocole séparé [3]. Comme la production fosmide-bibliothèque est un multi-processus, le plan d&#39;au moins deux à trois semaines à temps pour toute la procédure, y compris toutes les étapes quatre présentées. L&#39;extraction de l&#39;ADN génomique ...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Étape II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de production de bibliothèque de fosmides CopyControl&amp;#8482;</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>suffisant pour générer 9 à 10 bibliothèques de fosmides</td></tr><tr><td>Agarose SeaPlaque</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante agitateur</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de migration 1,0X TAE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d'électrophorèse en champ pulsé CHEF Mapper XA, comprenant module de refroidissement et pompe à vitesse variable</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion de l'ADN &amp;#955; par HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur PFG MidRange I</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold 10 000X</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Plastique micro-ondable</td><td>Saran premium wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur Safe Imager</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Préparation GELase pour la digestion de gel d'agarose</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-4 avec membrane Ultracel-10</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge Microcon YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'essai Quant-iT PicoGreen dsDNA *2000 dosages*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Chauffe-bloc numérique à sec</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifugeurs, 1,7 mL, transparents</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubes centrifugeurs de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Étape III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bouillon LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de dilution de bactériophages</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Vials cryogéniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Étape IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque 96 puits avec couvercle</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 384 puits avec couvercle</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 100 mm de diamètre x 15 mm de hauteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 150 mm de diamètre x 15 mm de hauteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 x 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar Difco</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Billes de verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Tubes centrifugeurs de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Prélèveur de colonies QPix</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>Embout de prélèvement (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

grand insérer production bibliothèque génomique de l&#39;environnement

Large Insert Environmental Genomic Library Production

La grande majorité des microbes dans la nature restent actuellement inaccessibles aux méthodes de culture traditionnelles. Au cours des dix dernières années, la culture indépendante génomique environnementale (<em&gt; À savoir</em&gt; Métagénomique) approches ont émergé, permettant aux chercheurs de combler cette lacune de culture en capturant le contenu génétique des populations autochtones des communautés microbiennes directement à partir de l&#39;environnement. À cette fin, banques d&#39;ADN génomique sont construits en utilisant la norme mais astucieuse des techniques de clonage en laboratoire. Nous décrivons ici la construction d&#39;une bibliothèque génomique insérer des grandes environnement fosmide avec l&#39;ADN provenant du continuum profondeur verticale d&#39;un fjord saisonnière hypoxiques. Ce protocole est directement liée à une série de protocoles reliés y compris l&#39;échantillonnage des eaux côtières marines [1], la filtration grand volume de biomasse microbienne [2] et une extraction d&#39;ADN et protocole de purification [3]. A l&#39;origine, de haute qualité est l&#39;ADN génomique fin réparé avec la création de la 5-phosphorylés des extrémités franches. Fin réparé ADN est soumis à une électrophorèse en champ pulsé (PFGE) pour la sélection de taille et d&#39;extraction de gel est effectuée pour récupérer des fragments d&#39;ADN entre 30 et 60 mille paires de base (Ko) de longueur. L&#39;ADN est purifié Taille sélectionnés loin de la matrice du gel PFGE et ligaturé au traité à la phosphatase à bout émoussé fosmide CopyControl pCC1 vecteur (EPICENTRE<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). Concatémères linéaire de pCC1 et insert d&#39;ADN sont ensuite emballés dans des headfull des particules de phage lambda par terminase, avec une infection ultérieure du phage résistant<em&gt; E. coli</em&gt; Cellules. Réussir clones transduits sont récupérés sur des plaques d&#39;agar LB sous sélection antibiotique et archivés dans le format de 384 puits plaque à l&#39;aide d&#39;une colonie automatisé picking robot (Qpix2, GENETIX). Le protocole actuel s&#39;inspire de diverses sources, y compris le kit CopyControl fosmide production bibliothèque d&#39;Epicentre et les oeuvres publiées de multiples groupes de recherche [4-7]. Chaque étape est présentée avec les meilleures pratiques à l&#39;esprit. Autant que possible nous mettons en évidence les subtilités de l&#39;exécution afin d&#39;améliorer la qualité et l&#39;efficacité globales de la production de la bibliothèque. L&#39;ensemble du processus de production et la cueillette des bibliothèques fosmide colonie automatisé prend au moins 7-10 jours comme il ya de nombreuses étapes d&#39;incubation inclus. Cependant, il existe plusieurs points d&#39;arrêt possibles qui sont mentionnés dans le protocole.

Construction d&#39;une bibliothèque fosmide avec l&#39;ADN génomique environnementale isolé du continuum profondeur verticale d&#39;un fjord saisonnière hypoxiques est décrite. La bibliothèque clone résultant est capté dans les plaques 384 puits et archivées pour le séquençage et l&#39;aval de criblage fonctionnel par l&#39;application d&#39;un système de picking colonie automatisés.

Grand Insérer production bibliothèque génomique de l&#39;environnement

La vaste majorité des microbes présents dans la nature demeurent actuellement inaccessibles aux méthodes de culture traditionnelles. Au cours de la dernière décennie, les approches indépendantes de la culture...

Bonjour, je suis Marcus to du laboratoire de Steven Helm au Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de la Colombie-Britannique. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour la construction d'une bibliothèque environnementale à grand insert. M'aidant dans cette procédure aujourd'hui, San Lee effectuera l'encapsidation des phages et l'infection de l'hôte bactérien de la bibliothèque e coli, ainsi que Elise Hawley et Chin Yang qui se chargeront du prélèvement des colonies.Nous disposons de cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la structure et le métabolisme des communautés microbiennes dans les environnements marins et terrestres. Commençons donc. Ce protocole de création d'une bibliothèque d'ADN fo smid commence après l'isolement et la fragmentation de l'ADN génomique provenant d'échantillons de biomasse, des étapes que nous avons détaillées dans des articles JoVE accompagnants.Les quelques étapes suivantes préparent l'ADN SHE pour la ligature dans le vecteur SMID PCC one. La première étape consiste à réparer les extrémités des fragments d'ADN SHE et à les phosphoryler. Concernant les extrémités 5', tous les réactifs nécessaires à cette

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Grands écrans des banques métagénomiques

Nous décrivons ici une méthode pour la préparation des deux simples de lecture et jumelé fin Illumina ARNm-Seq bibliothèques de séquençage de l'analyse d'expression génique basée sur l'ARN T7 linéaires d'amplification. Ce protocole ne nécessite que 10 nanogrammes d'ARN total de départ et génère des bibliothèques très cohérente représentant transcriptions ensemble.

Simple Lire et jumelés bibliothèques Fin Illumina ARNm-Seq de 10 nanogrammes d&#39;ARN total

Le test du rapporteur génétique est un outil bien établi et puissant pour disséquer la relation entre les séquences d’ADN et leurs activités de régulation des gènes. Le couplage d’éléments régulateurs candidats à des gènes rapporteurs portant des marqueurs de séquence d’identification permet une parallélisation massive de ces tests.

Essais Reporter massivement parallèles dans des cellules de mammifères en culture

Ce manuscrit décrit une approche automatisée de sélection de la taille du gel pour purifier les fragments d’ADN pour le séquençage de nouvelle génération. La technologie Ranger permet une automatisation complète de l’ensemble du processus de chargement de gel d’agarose, d’analyse électrophorétique et de récupération de fragments d’ADN ciblés, ce qui permet d’obtenir des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération à haut débit et de haute qualité.

Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d&#39;échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement

Méthodes pour générer des bibliothèques gRNA à grande échelle devraient être simple, efficace et rentable. Les auteurs décrivent un protocole pour la production de bibliothèques gRNA issu de la digestion enzymatique de l’ADN cible. Cette méthode, CORALINA (génération de bibliothèque gRNA globale par activité nucléasique contrôlé) présente une alternative à la synthèse d’oligonucléotides personnalisée coûteux.

Un protocole universel pour à grande échelle gRNA bibliothèque Production provenant de toute Source d’ADN

Un vecteur binaire pBIBAC-GW permet de générer des plantes transgéniques avec insertions de simple copie intactes, un processus facile. Une série de protocoles est présentée ici, qui guide le lecteur à travers le processus de génération des plantes transgéniques d’Arabidopsis et tester les plantes pour l’intégrité et de copier le nombre des plaquettes.

Génération de plantes transgéniques avec Insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW

Nous décrivons une méthode pour générer des bibliothèques mutantes transposons saturantes chez les bactéries gramnégatives et la préparation subséquente des bibliothèques d’amiplicons d’ADN pour le séquençage à haut débit. À titre d’exemple, nous nous concentrons sur l’agent pathogène ESKAPE, Acinetobacter baumannii, mais ce protocole est accessible à un large éventail d’organismes gramnégatifs.

Génération de bibliothèques d’insertion transposon dans les bactéries gramnégatives pour le séquençage à haut débit

Ce protocole détaille une approche globale pour la culture, le séquençage et l’assemblage hybride de novo du génome des bactéries urinaires. Il fournit une procédure reproductible pour la génération de séquences génomiques complètes et circulaires utiles pour étudier les éléments génétiques chromosomiques et extrachromosomiques contribuant à la colonisation urinaire, à la pathogenèse et à la dissémination de la résistance aux antimicrobiens.

Assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue

La mutagenèse insertionnelle est un outil essentiel en génétique avancée pour identifier les éléments génomiques fonctionnels. Ici, nous décrivons l’InSET, une méthode de détection des sites d’intégration des lentivirus au sein d’une bibliothèque de cellules de mutagenèse insertionnelle basée sur les lentivirus.

Identification de sites d’intégration de lentivirus fonctionnellement pertinents dans une banque de cellules de mutagenèse insertionnelle

Ce protocole fournit une méthode pour l’optimisation globale systématique des biocapteurs génétiquement codés par la génération et l’évaluation de bibliothèques génétiques assistées par automatisation. Ceci est associé à des méthodologies de conception d’expérience pour rationaliser l’expérimentation et permettre la sélection de composants génétiques pour ajuster les biocapteurs à des résultats de conception spécifiques.

Échantillonnage efficace de l’espace de conception de biocapteurs génétiquement codés grâce à un plan d’expériences et à un flux de travail d’automatisation

Cette étude présente un protocole multiome spatial Trekker–CUT&amp;Tag combinant le codage à barres spatial direct d’une section tissulaire avec l’analyse multiome unicellulaire. Cette approche permet simultanément un profilage spatial de l’expression génique par une seule cellule et la modification de l’histone H3K27ac, offrant des perspectives mécanistes sur la régulation génique dans le contexte de la microanatomie tissulaire.

Profilage multiomique spatialement résolu et intégré à cellules uniques du transcriptome et des cibles épigénomiques dans les sections de tissu gelé

Découvrez la construction d'une bibliothèque environnementale à grands inserts pour étudier la structure et le métabolisme des communautés microbiennes marines. Cette méthode permet l'analyse fonctionnelle et le séquençage futur.

Grand Insérer production bibliothèque génomique de l'environnement

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