Name: Suivi dynamique de prise de greffe musculaire chez les petits animaux par des In Vivo Fluorescent Imaging (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Découvrez l'imagerie de fluorescence in vivo pour surveiller la régénération musculaire chez la souris en utilisant des myoblastes marqués au GFP. Cette méthode permet d'étudier l'engrèvement cellulaire en temps réel avec moins d'animaux.

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Le travail de Yang Z et Y Wang a été rendu possible par la subvention du K02 AR051181 NIAMS / NIH, les subventions des Muscular Dystrophy Association et de Harvard Stem Cell Institute for Y Wang. Le travail de Q et X Xu Zeng sont soutenus par un programme de subvention attribué au laboratoire d&#39;imagerie optique du Brigham and Women &#39;s Hospital. Les auteurs tiennent à remercier M. Wen Liu du département d&#39;anesthésie, BWH, pour une aide technique dans le travail de la cellule.

Préparation de cellules <ol><li> L&#39;isolement cellulaire par satellite <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Sous anesthésie, des muscles des membres des souris transgéniques GFP (C57BL / Ka-βactin-EGFP) sont supprimés. Après avoir coupé en petits morceaux, les cellules satellites sont enzymatiquement dissocié en incubant le tissu hachée avec une solution dispase collagénase 2% pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Neutraliser la digestion enzymatique avec les milieux de croissance contenant Ham F-10 et de 20% de FBS, dissocier les muscles par trituration répétée avec une pipette Pasteur. Les cellules sont filtrés à travers une passoire cellule (ø70-100 microns) et ensuite étalées sur un plat non revêtus pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Retirer délicatement le surnageant et la plaque de les sur un plat recouvert de collagène. Répétez cette étape 1 heure plus tard, pour purifier les myoblastes. (Pré-plaque) </li><li> Changer les médias et les plaques des cellules dans le temps. Les myoblastes final purifié sont cultivées dans un milieu contenant Ham F-10, 20% de FBS, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (milieu de croissance) à 37 ° C avec 5% de CO2, 95% d&#39;air. </li></ol> </li><li> Culture et élargir les myoblastes primaires en milieu de croissance avec l&#39;ajout de FGF basique de 10 ng / ml. </li><li> Pour toutes les expériences in vivo, nous injectons 5x10 5 cellules par muscle TA. </li><li> Lorsque la récolte des myoblastes, nous détacher les cellules en utilisant 0,25% de trypsine / EDTA et les laver avec du PBS deux fois. Le nombre de cellules sont comptées avec un hémocytomètre et les cellules sont remises en suspension dans HBSS à une concentration de 5x10 4 cellules / ul. Les cellules concentrées dans HBSS sont placés sur la glace et injecté 1 heure après la collecte. </li></ol> L&#39;imagerie in vivo <ol><li> Homme souris mdx à l&#39;âge de 4-6 semaines sont achetés auprès de Jackson laboratoire et maintenue à une facilité de logement des animaux. </li><li> Après environ une semaine d&#39;hébergement à l&#39;environnement, les souris sont prêts à être implantés avec des cellules cultivées. </li><li> Avant la transplantation de cellules, la souris est anesthésiée par une intrapéritonéale (ip) d&#39;injection du mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Puis les cheveux autour de la zone du muscle TA est éliminé par l&#39;application de Nair à la jambe et d&#39;attendre 30 secondes pour l&#39;essuyer avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Alors que la souris est toujours sous anesthésie, 5x10 5 cellules dans HBSS 10 ul sont injectés lentement dans chaque muscle TA à 3 points à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 30. </li><li> Après l&#39;étape 4, la souris peut être régulièrement imagés par imagerie de fluorescence in vivo. L&#39;imagerie de fluorescence station de NightOwl LB981 (Berthold Technologies, Inc), équipé d&#39;une haute sensibilité à couplage de charge appareil, est utilisé pour obtenir des images à partir des jambes d&#39;entraver des souris. </li><li> Le jour de l&#39;imagerie in vivo, nous avons d&#39;abord vérifier la repousse des cheveux sur le muscle TA. Si nécessaire, nous ré-appliquer Nair pour enlever les poils comme décrit ci-dessus, après avoir anesthésier la souris avec le mélange de kétamine et de xylazine. </li><li> Alors que la souris est sous anesthésie, nous plaçons la souris dans une position couchée sur un morceau de noir non fluorescent papier (papier noir Artagain de Strathmore). Pour bien exposer le muscle TA pour une meilleure imagerie, nous bande les pattes arrières sur le papier. </li><li> On place la souris dans la chambre de l&#39;imagerie et la position de la patte postérieure à imager au centre du champ de vision de la caméra. Nous avons d&#39;abord passer par le filtre d&#39;émission de prendre un classique de gris image photographique de la jambe avec un temps d&#39;exposition de 5 secondes. Réajuster la position de la souris et l&#39;orientation de la caméra si nécessaire. Les paramètres d&#39;imagerie, y compris le temps d&#39;exposition (1250 ms), la hauteur des spécimens (0,9 cm), etc sont maintenus constants dans le processus expérimental. </li><li> Nous avons ensuite passer dans le filtre d&#39;émission approprié pour la longueur d&#39;onde la protéine fluorescente verte. Nous prenons l&#39;image de fluorescence avec un temps d&#39;exposition de 1.250 ms et un certain nombre de binning 1. Après l&#39;imagerie, la souris est retirée de la chambre d&#39;imagerie pour une cage d&#39;attendre la récupération. </li><li> Pour l&#39;analyse, nous tirons une région d&#39;intérêt (ROI) sur les signaux fluorescents pour mesurer leur intensité en termes de photons par seconde. Nous mesurons également la taille du ROI en termes de nombre de pixels comme une autre valeur de quantification. Les expériences d&#39;imagerie peut être répété chaque semaine ou plus souvent en quelques mois, si nécessaire, d&#39;acquérir des données longitudinales. </li></ol> A la fin des expériences, la souris est euthanasié et le muscle TA est récolté pour une analyse histologique.

<ol><li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li>
<li>Green, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li>
<li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li>
<li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li>
<li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 Forthcoming.</li>
<li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci+Vis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li>
<li>In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li>
<li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+I.+A+histological%2C+morphometric+and+biochemical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li>
<li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li>
<li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li>
<li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li>
<li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li>
<li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells%2C+bone+marrow+cells%2C+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li>
<li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient%2C+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li>
</ol>

Nous mettons en place une plateforme d&#39;imagerie fiable et stable pour le suivi de la fluorescence étiquetés cellules transplantées dans le muscle squelettique d&#39;hôte dans cette étude. GFP-étiquetée myoblastes de souris transgéniques GFP représente un type de cellules souches adultes qui seront candidats pour la thérapie cellulaire à l&#39;avenir. Une manipulation constante, y compris le nombre de cellules, l&#39;injection de cellules, sur fond clair, la position de l&#39;imagerie et le paramètre machine est important pour gagner la haute qualité d&#39;image et surtout pour l&#39;analyse quantitative. L&#39;imagerie par fluorescence a de nombreuses applications dans la recherche biomédicale comme il est non invasif, facile à utiliser, et a un débit élevé. En plus de l&#39;imagerie de fluorescence peut fournir une mesure quantitative basée sur les comptages de photons, mais à cause de la dispersion, l&#39;atténuation et l&#39;absorption, la lumière ne peut pas pénétrer sur une grande distance dans les tissus, ce qui est une lacune de la technique. Des efforts ont été entrepris pour l&#39;utilisation journaliste de rouge ou le proche infrarouge pour augmenter la profondeur de pénétration de la lumière. Un autre avantage de l&#39;imagerie de fluorescence, c&#39;est qu&#39;il est traduisible dans les cliniques si le journaliste fluorescente spécifique est approuvé pour usage humain. Par rapport à l&#39;IRM, CT, et la TEP, imagerie de fluorescence a une grande flexibilité car elle ne nécessite pas de matériel coûteux et des agents d&#39;imagerie. Un exemple est basées sur la fluorescence endoscope et les micro-endoscope qui ont été utilisés dans les cliniques. En combinant l&#39;imagerie de fluorescence avec d&#39;autres modalités, nous nous attendons à atteindre la capacité d&#39;acquérir à la fois des informations anatomiques et fonctionnelles sur les processus biologiques sous-jacents.

<table><tbody><tr><td>NightOwl LB981</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

suivi dynamique de prise de greffe musculaire chez les petits animaux par des in vivo fluorescent imaging

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Les dystrophies musculaires sont un groupe de maladies musculaires dégénératives caractérisées par une perte progressive des cellules musculaires contractiles. Actuellement, il n&#39;existe aucun traitement curatif. Les avancées récentes en biologie des cellules souches ont généré de nouveaux espoirs pour le développement de thérapies cellulaires efficaces basées pour traiter ces maladies. La transplantation de différents types de cellules souches étiquetées avec des protéines fluorescentes dans les muscles de modèles animaux dystrophiques a été largement utilisé dans le domaine. Une technique non invasive avec la capacité de suivre le destin des cellules transplantées longitudinalement peuvent encore notre capacité à évaluer la prise de greffe de muscle par les cellules transplantées plus précise et efficace. Dans la présente étude, nous démontrons que la fluorescence in vivo d&#39;imagerie est une méthode sensible et fiable pour le suivi de la GFP transplantés (Green Fluorescent Protein) cellules marquées dans les muscles squelettiques de souris. En dépit de la préoccupation de fond dû à l&#39;utilisation d&#39;une lumière extérieure nécessaire à l&#39;excitation de la protéine fluorescente, nous avons constaté que ce soit en utilisant la souris nude ou en éliminant les cheveux avec des réactifs d&#39;épilation beaucoup plus de ce problème est éliminé. En utilisant une caméra CCD, le signal fluorescent peut être détecté dans le jambier antérieur (TA) du muscle après l&#39;injection de 5 x 10 5 cellules soit de souris transgéniques GFP ou EGFP transduites la culture des myoblastes. Pour des muscles plus superficielles telles que l&#39;extenseur commun des orteils (EDL), l&#39;injection de moins de cellules produit un signal détectable. L&#39;intensité du signal peut être mesurée et quantifiée comme le nombre de photons émis par seconde dans une région d&#39;intérêt (ROI). Depuis les images acquises montrent des limites claires délimitant la zone implantée, la taille de la ROI peut être mesuré aussi bien. Si les jambes sont placés systématiquement à chaque fois, les changements dans le nombre total de photons par seconde et par les muscles et la taille de la ROI de refléter les changements dans le nombre de cellules greffées et la taille de la zone greffée. Par conséquent, les modifications dans le même muscle au cours du temps sont quantifiables. In vivo technique d&#39;imagerie fluorescente a été utilisée principalement pour suivre la croissance des cellules tumorigène, notre étude montre qu&#39;il est un outil puissant qui nous permet de suivre le destin des cellules souches transplantées.

Nous décrivons une<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie de fluorescence protocole à suivre la régénération du muscle par la GFP-étiquetée myoblastes après la transplantation dans les muscles squelettiques des souris à la fois sain et dystrophiques. Ce protocole peut être adapté à l&#39;étude la régénération musculaire par transplantation d&#39;autres types de cellules et dans d&#39;autres conditions musculaires ainsi.

Suivi dynamique de prise de greffe musculaire chez les petits animaux par des In Vivo Fluorescent Imaging

Les dystrophies musculaires constituent un groupe de maladies musculaires dégénératives caractérisées par une perte progressive des cellules musculaires contractiles. À l'heure actuelle, il n'existe pas de...

Bonjour, je suis Juwan Ma du Département d'anesthésie de l'Hôpital Bergham pour femmes à Boston. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une technique permettant d'acquérir des images de fluorescence in vivo afin de suivre l'évolution de la régénération musculaire chez la souris. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'attecement des cellules souches musculaires transplantées.Commençons. Les cellules marquées par la GFP destinées à la transplantation sont isolées et cultivées à partir de souris transgéniques exprimant la GFP. Avant de poursuivre, une pression sur l'orteil confirme que la souris est complètement anesthésiée. Les muscles de la patte arrière sont ensuite retirés. Dans des conditions aseptiques, le muscle est ensuite macéré.Les cellules satellites sont dissociées en incubant le tissu haché avec une solution de collagénase à 2 % à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation, un milieu de croissance contenant du Ham F10 et 20 % de SBF est ajouté pour arrêter la digestion enzymatique. Les muscles sont ensuite dissociés par des passages répétés à l’aide d’une pipette Pasteur.Ensuite, les cellules sont filtrées à l'aide d'un tamis cellulaire, puis ensemencées dans une boîte de culture non revêtue. La boîte est placée pendant une heure dans une incubateur standard de culture cellulaire. Afin de séparer les cellules satellites des autres populations cellulaires possédant des propriétés d'adhérence plus fortes, le surnageant est transféré par décantation dans une boîte revêtue de collagène et incubé pendant une heure supplémentaire.Après cette incubation, le surnageant enrichi en cellules satellites obtenu est de nouveau prélevé et appliqué sur une nouvelle plaque revêtue de collagène, puis cultivé jusqu'à l'observation de colonies de myoblastes. Ce processus est appelé préplaque. Les cellules sont mises en passage lorsqu'elles atteignent une confluence cellulaire de 60 à 70 %. Une petite proportion des cellules est utilisée pour la cytochimie immunocytochimique, en les colorant avec des marqueurs de cellules myogéniques afin de vérifier la pureté des cellules musculaires en culture.Une fois la pureté des cellules myogéniques confirmée, les cellules sont amplifiées dans la même culture. Avant la transplantation, les cellules sont détachées à l’aide de trypsine 0,25 % N. Les cellules sont lavées deux fois et resuspendues dans du HBSS à une concentration de cinq fois 10 puissance sept cellules par millilitre ; 10 microlitres de la solution cellulaire sont injectés par muscle tibial antérieur, ou muscle TA.Pour l'imagerie in vivo, des myoblastes marqués par la GFP sont d'abord transplantés chez des souris mâles âgées de quatre à six semaines. La souris est anesthésiée avec du xylazine-kétamine, et la procédure commence après confirmation de l'état anesthésique. Afin de réduire le bruit de fond, les poils des deux membres postérieurs sont éliminés en appliquant du nare sur les pattes, puis en attendant 30 secondes avant de l'essuyer.Pour l'application avec l'embout cotonné, les pattes sont ensuite essuyées à nouveau avec un nouvel embout cotonné imprégné d'eau distillée afin d'éliminer les résidus de narine et de poils avant la transplantation des cellules dans la souris. Aspirez d'abord cinq fois 10 puissance 5 cellules dans 10 microlitres de HBSS dans une seringue Hamilton. À l'aide d'une aiguille de calibre 30, injectez un nombre égal de cellules en trois points situés le long de l'axe longitudinal du muscle tibial antérieur, partie médiale supérieure et partie inférieure.Après chaque injection, maintenir l'aiguille en place pendant deux minutes avant de la retirer du muscle afin d'éviter toute fuite le long de l'aiguille. Pendant la période d'attente, prélever la même quantité de cellules dans une autre seringue et injecter le muscle tibial antérieur controlatéral de la même manière. Après les injections cellulaires, placer immédiatement la souris en position pronaire sur une feuille de papier noir non fluorescent, fixer solidement les deux pieds sur le papier, la plante vers le bas, et écarter les pattes à 90 degrés. La souris est ensuite placée dans la chambre d'une station d'imagerie de fluorescence Night Owl, LB 981.Équipé d'une caméra CCD très sensible, une patte arrière est positionnée au centre du champ de vision de la caméra. Commencez par prendre une photographie traditionnelle en niveaux de gris de la patte. Pour commencer l'imagerie, le filtre d'émission approprié, avec une longueur d'onde spécifique pour la protéine fluorescente verte, est sélectionné.Prenez une image avec une exposition de 1 250 millisecondes, suivie d'une autre avec une exposition de 500 millisecondes. Nous constatons qu'un temps d'exposition plus long permet la détection d'un signal faible, tandis qu'une exposition plus courte révèle davantage de détails. Une fois qu'une patte arrière a été imagée, positionnez l'autre patte arrière au centre du champ de vision de la caméra et imagez cette patte de la même manière que précédemment indiqué.Pour garantir des résultats comparables, la hauteur de l'échantillon doit rester inchangée. Après l'acquisition d'images, la souris est transférée dans une cage et sa récupération de l'anesthésie est surveillée. Pour l'analyse, une région d'intérêt est dessinée sur les signaux fluorescents afin de mesurer les photons par seconde.Nous mesurons également la taille de la région d'intérêt en nombre de pixels afin d'obtenir une valeur quantitative supplémentaire pour acquérir des données longitudinales ; les expériences d'imagerie peuvent être répétées à différents jours ou semaines selon les besoins. Pour les expériences, une image fluorescente d'une patte arrière de la souris prise le jour où les cellules marquées par la GFP ont été injectées a montré une intensité de signal élevée. L'intensité du signal a ensuite diminué le deuxième jour, puis augmenté pour atteindre un niveau stable aux jours 7, 14 et 21. Lorsque ces variations de fluorescence ont été quantifiées en mesurant l'intensité du signal en photons par seconde, nous avons observé une diminution marquée de l'intensité du signal un jour après l'injection, reflétant une réduction du nombre de cellules positives pour la GFP.Cependant, aux jours sept, 14 et 21, l'intensité du signal avait augmenté jusqu'à un niveau stable, indiquant que la régénération musculaire s'était produite. Nous venons de vous montrer comment utiliser l'imagerie par fluorescence in vivo pour suivre l'évolution de la régénération musculaire après l'injection de cellules marquées au GFP. Grâce à cette méthode, nous sommes en mesure d'étudier la dynamique de la régénération musculaire après l'injection de tous types de cellules marquées par fluorescence.Étant donné que les images peuvent être acquises de manière non invasive à des intervalles définis, des données longitudinales plus précises peuvent être recueillies avec moins d'animaux et une charge de travail réduite. Lorsque des paramètres de mesure fixes sont utilisés, les images provenant des mêmes animaux au fil du temps doivent être quantitativement comparables. Il est extrêmement important de maintenir une surface cutanée propre au-dessus du muscle afin de réduire le bruit de fond ; il est absolument essentiel d'éliminer tous les poils recouvrant les pattes et de nettoyer soigneusement la zone avec des cotons-tiges ou des compresses.Et n'oubliez pas d'utiliser chaque fois le même ensemble de paramètres afin d'assurer une cohérence entre toutes vos mesures. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Cet article décrit une séquence d'événements optimisé pour l'imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l'imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d'imagerie sur un seul animal permet cellulaire d'évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

Cette vidéo montre le protocole d’implantation orthotopique de cellules cancéreuses du pancréas exprimant des protéines fluorescentes vertes dans le pancréas de la souris. Le modèle murin orthotopique aide à étudier l’efficacité de nouvelles thérapies sur les tumeurs primaires et métastatiques.

Modèle de souris orthotopique fluorescente : implantation de cellules cancéreuses exprimant la GFP dans une souris pour évaluer la progression tumorale in vivo

A moyen non invasif pour évaluer le succès de la transplantation de myoblastes est décrite. La méthode tire parti d'un gène rapporteur de fusion unifié composé de gènes dont l'expression peut être visualisé avec différentes modalités d'imagerie. Ici, nous utilisons...

L&#39;imagerie moléculaire à la cible transplanté des cellules progénitrices musculaires

Les progéniteurs myogéniques dérivés de cellules souches pluripotentes induites (csps) sont des candidats prometteurs pour les stratégies de thérapie cellulaire visant à traiter les dystrophies musculaires. Ce protocole décrit la transplantation et les mesures fonctionnelles exigées pour évaluer l’engraftment et la différentiation des mesoangioblasts iPSC-dérivés (un type de progéniteurs de muscle) dans des modèles murins de régénération aiguë et chronique de muscle.

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

Nous décrivons une méthode relativement simple pour ex vivo l'imagerie en direct de la tumeur interactions cellule-stroma dans les métastases du poumon, en utilisant journalistes fluorescentes chez la souris. Utilisation à disque rotatif microscopie confocale, cette technique permet de visualiser les cellules vivantes pendant au moins 4 heures et peut être adapté à l'étude d'autres maladies pulmonaires inflammatoires.

Ex vivo l&#39;imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement

La microscopie intravitale fluorescence (IVFM) de la voûte crânienne est appliquée en combinaison avec des modèles animaux génétiques pour étudier la domiciliation et la greffe de cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse (BM) niches.

Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse

Les auteurs décrivent un protocole précliniques in vivo suivi des métastases cancéreuses. Il est issu d’un reporter de radionucléide-fluorescence combinant le sodium iodure symport, détecté par non invasive [18F] tétrafluoroborate-PET et une protéine fluorescente simplifiée ex vivo de confirmation. La méthode est applicable pour précliniques in vivo la cellule de suivi au-delà de biologie tumorale.

Gène rapporteur de radionucléide-fluorescence Imaging pour suivre la Progression tumorale dans les modèles de rongeurs tumeur

Ici nous utilisons bioluminescent, radiographie et tomographie par émission de positons/calculé tomographie imaging pour étudier comment inhiber l’activité mTOR impacts tumeurs myélome de la moelle osseuse-implanté dans un modèle de xénogreffe. Cela permet des analyses physiologiquement pertinents, non invasif et multimodales de l’effet anti-myélome de thérapies ciblant myélome de la moelle osseuse-greffée tumeurs in vivo.

Multimodal bioluminescentes et émission positronique tomographie/Computational imagerie par tomographie des xénogreffes de moelle osseuse de myélome Multiple chez les souris NOG

Nous présentons ici un protocole pour vivre-imagerie des fragments de l’endomètre humains fluorescent étiquetés greffés chez des souris. La méthode permet d’étudier les effets des médicaments de choix sur la taille de la lésion endometriotic grâce à la surveillance et la quantification de la fluorescence émise par le journaliste fluorescent en temps...

Surveillance non invasive de la taille de la lésion dans un modèle murin hétérologues d’endométriose

Cet article explique comment effectuer une myographie d’impédance électrique in vivo (à l’aide de réseaux d’électrodes de surface et à aiguilles) et ex vivo (à l’aide d’une cellule diélectrique) sur le muscle gastrocnémien du rongeur. Il démontrera la technique chez les souris et les rats et détaillera les modifications disponibles (c.-à-d. animaux obèses, petits).

Réalisation de myographie d’impédance électrique in vivo et ex vivo chez les rongeurs

Découvrez l'imagerie de fluorescence in vivo pour surveiller la régénération musculaire chez la souris en utilisant des myoblastes marqués au GFP. Cette méthode permet d'étudier l'engrèvement cellulaire en temps réel avec moins d'animaux.

Suivi dynamique de prise de greffe musculaire chez les petits animaux par des In Vivo Fluorescent Imaging

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