Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

Bonjour, je suis Hillary Kemp du laboratoire de Cecilia Owens. Et je m’appelle Cecilia Owens. Hillary et moi sommes dans la division des sciences fondamentales du Centre de recherche sur le cancer Fred Hutchinson à Seattle.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une technique pour fabriquer des embryons de poisson-zèbre chimériques, également connus sous le nom de mosaïques génétiques. Cette procédure nous permet d’évaluer la base cellulaire de la fonction des gènes au cours du développement. Nous pouvons nous demander si un gène donné fonctionne dans les cellules avec un phénotype mutant connu sous le nom de fonction autonome cellulaire, ou dans l’environnement cellulaire connu sous le nom de non-autonomie cellulaire.

Nous fabriquons ces mosaïques en transplantant des cellules entre des embryons mutants de type sauvage à un stade blastula ou gastro précoce. Nous évaluons ensuite la fonction des gènes en observant le phénotype et le génotype des cellules dérivées de donneurs dans leur environnement hôte. Alors commençons.

Dans cette partie du protocole, un colorant de lignée est injecté dans l’embryon du donneur afin que le destin des cellules dérivées du donneur puisse être suivi après la transplantation. N’importe quelle variété d’acides nucléiques peut également être injectée en utilisant cette technique, cependant, omettez l’étape de décoration lors de l’injection d’ADN avant de travailler avec les embryons, préparez un bol d’injection en insérant une lame de verre à un angle de 45 degrés sur la partie la plus large d’une boîte de Pétri. Les trois quarts sont remplis de 1,2 % d’aros dans un milieu d’embryon de streptocoque.

Retirez la glissière une fois que l’agro a pris pour faire une auge biseautée. Remplissez l’auge avec du milieu d’embryon de streptocoque. Procédez maintenant à la décoration enzymatique des embryons au stade d’une cellule.

Incuber les embryons au stade d’une cellule pendant une à cinq minutes dans un milligramme par millilitre. Solution Pronase. Surveillez de près la décoration.

Dès que le corion commence à s’effondrer visiblement, immergez les embryons dans l’eau du système Et cela déverse tout le corium et les embryons restent en bas au bas de la courbe du bec. Et il est vraiment important que les embryons ne touchent pas la surface de l’eau une fois de plus, et la plupart d’entre eux ont leur corion enlevé. Il y en a quelques-uns qui tourbillonnent à l’extérieur qui ne le font pas.

S’il y a encore quelque chose dans son corion, alors le fait de les pipeter de cette manière les fera sortir, puis libérera les embryons afin qu’ils ne touchent jamais la surface de l’eau. Il est important de manipuler les embryons enrobés à l’aide d’une pipette polie au feu pour lisser les bords. Transférez délicatement les embryons fragiles enrobés de déc dans l’auge de la boîte d’injection à l’aide d’une pipette en verre poli au feu de large calibre.

Ensuite, nous chargeons un seul fichier dans ce creux. Les embryons sont maintenant prêts à être injectés avec un marqueur de lignée à l’aide d’un feu calibré avec précision, d’une pipette d’injection en verre tiré et d’un appareil d’injection sous pression. Nous allons utiliser un plat rempli de milieu embryonnaire pour casser l’aiguille et un plat rempli d’huile pour calibrer l’aiguille.

Il s’agit simplement d’une huile minérale standard de qualité laboratoire. Nous prenons une paire de pinces d’horloger aiguisées, puis tout en regardant à travers les oculaires pour déterminer quelle serait la bonne taille, nous plaçons la pince de chaque côté de l’aiguille, puis nous cassons doucement l’éclat, ce que je ne peux pas faire sans chercher à déterminer le volume de colorant ou de ribonucléotide délivré. Avant de commencer.

Mesurez la taille du bolus dans un plat d’huile minérale. L’aiguille doit être cassée de manière à ce qu’un bolus d’un nanolitre soit délivré avec une ou deux impulsions du micro-injecteur. Le volume du bolus peut être calculé à partir de son diamètre mesuré par un micromètre oculaire.

Injectez un nanolitre d’une solution à 3 % de dextran fluorescent directement dans l’enveloppe des embryons enrobés entre les stades une et quatre cellules. Ce que je vais faire, c’est positionner l’embryon juste sous l’aiguille. Je vais enfoncer doucement l’aiguille au centre du jaune et appuyer sur la pédale.

Une fois l’injection effectuée, il est important d’injecter dans les flux jaunes afin que le colorant soit transporté dans les cellules. Cette injection sera suffisante pour suivre les cellules d’embryons chimériques pendant plusieurs jours de développement. Idéalement, nous le faisons avant que les cellules n’atteignent le stade de quatre cellules, élevez les embryons injectés à faible densité dans une boîte de Pétri enrobée remplie d’embryon de streptocoque de stylo frais. Douleur moyenne.

Notez que les embryons injectés ont tendance à avoir un taux de développement légèrement ralenti, incubez les embryons à différentes températures, 25, 28 et 31 degrés Celsius pour échelonner leur développement et maximiser la fenêtre de temps pendant laquelle les greffes peuvent être effectuées. L’appareil utilisé pour la transplantation cellulaire dans la blastula de poisson zèbre se compose d’une seringue Hamilton commandée par un entraînement fixée par un robinet d’arrêt à trois voies à un réservoir d’huile minérale et à un porte-micro-pipette à travers une longueur de tube flexible. Éliminez toutes les bulles d’air du système car elles ruineront votre capacité à contrôler l’aspiration et la pression.

Utilisez un stéréomicroscope doté d’une optique de haute qualité d’au moins un grossissement DX. Pour contrôler le positionnement du porte-micro-pipette et de l’aiguille, nous suggérons un micro-manipulateur manuel NARA shige. Assurez-vous qu’il est fixé au banc à l’aide d’une base magnétique pour éviter que les vibrations ne se transmettent à la greffe.

Les aiguilles de transplantation d’aiguilles sont fabriquées à partir de pipettes capillaires en verre qui sont dessinées jusqu’à un cône doux sur une électrode polaire. Voir le protocole JoVE du laboratoire de Miriam Goodman pour plus de détails sur le tirage des pipettes sous un microscope à dissection, cassez la pointe de l’aiguille retirée. Pour les greffes au stade de blastula, le diamètre extérieur de l’aiguille doit mesurer environ 50 à 60 microns ou 30 à 40 microns pour un transfert au stade gastro.

Pour un transfert au stade gastro afin d’améliorer la pénétration, il faut d’abord tirer une barbe pointue sur l’extrémité de l’aiguille à l’aide d’un micro-fourrage, lisser la pointe de l’aiguille en l’approchant du filament de la micro-forge. Tournez ensuite l’aiguille de manière à ce que le bord d’attaque du biseau puisse entrer en contact avec le filament. Une fois que le bord d’attaque de l’aiguille entre en contact avec le filament, retirez-le rapidement pour créer une barbe.

Pour éviter d’endommager les cellules, l’ardillon doit être droit et la pointe de l’aiguille ne doit pas se courber Avec le rig et les aiguilles de transplantation préparés, vous êtes prêt à fabriquer des embryons chimériques. Les greffes de Blastule sont utilisées pour transplanter des cellules entre des embryons lorsque des informations précises sur la carte du destin ne sont pas nécessaires. À l’exception des cellules germinales primordiales, la plupart des cellules ne sont généralement pas vouées à un destin à ce stade.

La carte du destin de la blastula est telle que nous pouvons faire la distinction entre les cellules qui vont donner naissance à l’ectoderme et les cellules qui vont donner naissance au mésoderme. Le mésodermique et l’endodermique se trouvent près de la marge de l’embryon au stade de blastula, tandis que les progéniteurs dermiques, qui vont donner naissance au système nerveux et au derme de surface, se trouvent plus loin de la marge de l’embryon. Ainsi, lorsque nous transplantons des cellules dans des embryons au stade de blastula, nous pouvons cibler ces cellules sur le mésoderme présomptif ou sur l’ectoderme présomptif.

Mais nous ne pouvons pas cibler les cellules d’une région particulière de l’ectoderme ou du mésoderme parce que nous ne le savons pas. Au stade de la blastula où se trouve la face dorsale de l’embryon, préparez des boîtes d’injection à l’avance en faisant flotter un moule en plastique avec des rangées appariées de protubérances en forme de coin dans une boîte de Pétri, à moitié remplie de 1,2 % d’aros fondus dans un milieu embryonnaire. Une fois que l’aros s’est solidifié, retirez le gabarit en laissant des rangées de puits de forme triangulaire, chacun juste assez grand pour contenir un embryon.

Remplissez le moule de transplantation avec un milieu d’embryon de streptocoque et chargez les embryons au stade de blastula individuellement dans chaque puits avec une pipette en verre poli au feu. Maintenant, transférez les embryons dans les puits de transplantation et laissez-les d’abord s’allonger sur le côté. Disposez les embryons de manière à ce que les embryons du donneur soient placés dans une colonne et que les embryons hôtes soient placés dans la colonne adjacente.

Positionnez la boîte sur la scène de manière à ce que, lorsque l’aiguille de transplantation pénètre dans un embryon, l’aiguille pousse l’embryon contre la paroi arrière de son puits. À l’aide du micromanipulateur, abaissez l’aiguille de transplantation dans la boîte à un angle assez raide. Idéalement, l’aiguille de transplantation devrait pénétrer dans l’embryon à un angle d’environ 45 degrés.

Une fois que la pointe de l’aiguille se trouve sous la surface du milieu embryonnaire, aspirez une petite quantité de milieu embryonnaire dans l’aiguille en tournant le micromètre contrôlant la seringue Hamilton. Pour un contrôle plus précis, l’interface entre l’huile minérale et le milieu embryonnaire doit rester dans la partie mince et effilée de l’aiguille, pas trop près de l’extrémité. Positionnez doucement l’embryon du donneur à l’aide de l’aiguille, puis tirez l’aiguille vers l’arrière et entrez dans le chapeau de blastula de l’embryon à la position souhaitée.

Un coup rapide et fort pénétrera l’embryon sans le faire rouler. Prélevez lentement et soigneusement les cellules du donneur dans l’aiguille pour éviter de cisailler les cellules. Évitez de prendre le jaune dans l’aiguille après avoir pris le nombre souhaité de cellules.

Inversez légèrement la pression pour arrêter l’aspiration et retirez l’aiguille de l’embryon hôte en position. En déplaçant la boîte de transplantation, de petits ajustements à la position de l’embryon hôte peuvent être effectués en le tournant doucement à l’aide de l’aiguille de transplantation à condition de ne pas toucher le jaune. Lors de l’expulsion des cellules du donneur dans l’embryon hôte, évitez de prendre de l’ylk dans l’embryon car cela endommagerait et tuerait les cellules du donneur d’un seul donneur L’embryon peut être transplanté à plusieurs hôtes une fois les transferts de cellules terminés.

Transférez les paires d’hôtes donneurs dans les puits recouverts d’une plaque de 24 puits pour continuer le développement. La seule exception à la règle selon laquelle les cellules ne sont pas soumises à des destins particuliers au stade de blastula est les cellules germinales primordiales. Les cellules germinales primordiales sont spécifiées très tôt dans le développement et sont engagées dans leur destin de cellule germinale primordiale.

À un stade très précoce, les cellules germinales primordiales se trouvent près de la marge d’une blastula et d’un embryon au stade gast. Donc, si le but de l’expérience de transplantation est de transplanter des cellules germinales primordiales, alors il est très important d’où viennent les cellules dans l’embryon du donneur et pas important où elles vont dans l’embryon hôte. La règle est donc que pour les cellules somatiques, il est important de savoir où elles vont dans l’embryon hôte qui déterminera leur destin.

Dans le cas des cellules germinales primordiales, il est important de savoir d’où elles viennent dans l’embryon du donneur, car leur destin est déjà déterminé. Si l’objectif est de transplanter des cellules germinales primordiales, alors les cellules doivent être prélevées à la marge de l’espoir de l’embryon donneur, et elles sont situées juste près de la marge de l’embryon en quatre petits groupes de chacune des trois ou quatre cellules de cette feuille, ce stade de lance ou stade élevé de développement. Et vous devez les ramasser très prudemment pour ne pas commencer accidentellement à aspirer le jaune.

D’accord, et c’est donc ce que j’ai fait là-bas, et maintenant je passe à un embryon hôte. Maintenant, les cellules germinales primordiales vont se concentrer sur la région de la crête génitale de l’embryon dans lequel elles se trouvent. Il n’est donc pas nécessaire de transplanter ces cellules germinales primordiales dans la marge qu’elles y parviendront elles-mêmes.

Donc, je ne fais que les transplanter, les remettre à n’importe quel endroit dans le post-embryon. La clé pour les greffes de cellules germinales, qui est tout le contraire de tout autre type de greffe, est qu’il est important d’où proviennent les cellules du donneur. La transplantation de cellules dans un hôte au stade gastro permet à l’expérimentateur de tirer parti de la carte du destin du poisson-zèbre zèbre qui émerge lorsque le bouclier embryonnaire devient visible.

Il devient possible de distinguer différents types de tissus ainsi que les domaines du système nerveux central présumé. Lors du transfert de cellules entre embryons au stade de la liste gastro, il existe quelques variations dans le protocole, mais la procédure générale est similaire au travail avec des blastos pour monter des gastros. Étalez d’abord une bande verticale de méthylcellulose dans la dépression d’une lame de verre, puis inondez avec une quantité généreuse de support d’embryon de streptocoque à l’aide d’un transfert de pipette poli au feu.

Un donneur et trois étapes de bouclier hôtes à la diapositive de dépression. Choisissez des embryons de donneurs légèrement plus jeunes que les hôtes. Un nouvel outil est nécessaire pour manipuler la colle gastros, les extrémités d’une courte longueur de ligne de pêche d’essai de deux livres dans l’extrémité d’un tube capillaire.

Faisant ainsi une petite boucle. Utilisez la boucle pour enrouler doucement les embryons du donneur et de l’hôte sur le dessus de la bande de méthylcellulose et les enfoncer dans la méthylcellulose jusqu’à ce qu’ils soient bien fixés. Roulez-les en position de manière à ce que la région ciblée soit en haut.

En effet, lors de la transplantation, l’aiguille entrera tangentiellement dans l’embryon pour délivrer les cellules du donneur sans endommager l’ylk. Les greffes au stade gastro sont mieux réalisées sur un microscope composé à platine fixe. Utilisez les commandes du micromanipulateur pour mettre au point la pointe de l’aiguille de transplantation.

Positionnez le porte-micro-pipette et l’aiguille à un angle assez faible afin que l’aiguille soit aussi proche de l’horizontale que le permet le bord de la dépression sur la lame. Ensuite, percez l’embryon du donneur. S’il est correctement monté, il ne roulera pas lorsque l’aiguille de transplantation entrera, à moins que l’embryon ne soit trop vieux pour permettre à l’aiguille de pénétrer facilement.

Pour éviter de percer l’œyl, l’aiguille doit pénétrer dans l’embryon à un plan focal légèrement plus profond que celui de l’EDL. Une fois percées, un grand nombre de cellules peuvent être retirées du donneur pour un maximum de trois injections de cellules hôtes. Lors de l’aspiration des cellules, évitez d’aspirer le jaune en déplaçant l’aiguille pendant que les cellules sont absorbées si vous le souhaitez.

Des embryons supplémentaires peuvent être récoltés pour plus de cellules à l’aide de la même aiguille avant d’éjecter les cellules dans l’hôte, lors de l’éjection cellulaire dans l’embryon hôte, expulser les cellules pendant que l’aiguille est tirée à travers la zone ciblée au lieu de déposer les cellules en un seul amas. Cela augmentera la probabilité que les cellules du donneur contribuent au tissu souhaité. Une fois les transferts cellulaires terminés, placez la lame entière dans une boîte de Pétri et inondez-la soigneusement d’embryon de streptocoque. Douleur moyenne.

Au cours des prochaines heures, la méthylcellulose se dissoudra, libérant les embryons. Le nombre de cellules transférées dépend de l’objectif spécifique de l’expérience. Les cellules d’un seul donneur peuvent être transplantées dans trois ou quatre hôtes le matin suivant la transplantation.

Les hôtes peuvent être examinés pour déterminer si le ciblage des cellules du donneur a réussi. La transplantation réussie de cellules germinales primordiales de l’âge de la blastula permet d’obtenir des cellules marquées par fluorescence, positionnées ventralement près de la jonction entre l’extension de l’ylk et de l’ylk. Nous venons donc de vous montrer comment faire des greffes de gastrula et de blastula.

Lorsque vous utilisez cette technique, il est important de choisir le bon type de méthode de transplantation pour le tissu cible que vous espérez cibler avec vos cellules. Ainsi, la greffe au stade de blastula est suffisante pour déterminer si les cellules vont vers le derme par rapport à l’ectoderme. Et vous pouvez également utiliser cette technique pour cibler les cellules germinales primordiales.

Si vous souhaitez faire une cartographie plus fine, il est préférable d’utiliser une greffe d’âge gastros où la face dorsale a déjà été déterminée. Ainsi, avec cette technique, vous pouvez cibler les cellules de diverses parties du système nerveux, en particulier le cerveau antérieur, le mésencéphale, le cerveau postérieur et la moelle épinière. Donc c’est tout.

Merci beaucoup d’avoir regardé et bonne chance pour toutes vos expériences.