Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

Bonjour, je m’appelle Bruce Draper de l’Université de Californie à Davis, département de biologie moléculaire et cellulaire, et je m’appelle Cecilia Moans de la Division des sciences fondamentales du Fred Hutchinson Cancer Research Center à Seattle. Aujourd’hui, Cecilia et moi allons faire la démonstration du protocole de préservation du sperme du poisson-zèbre, qui est une modification du protocole original de Brian Harvey. Nous allons vous montrer qu’en travaillant en équipe de deux, il est possible de cryoconserver les spermatozoïdes de 100 hommes individuels en moins de deux heures.

Bien qu’il y ait une large gamme de fertilité lors de la décongélation, en moyenne, nous recevons 25 % de fertilité, et cela provient d’une bibliothèque cryoconservée depuis plus de sept ans. Alors commençons. Avant d’effectuer cette procédure, préparez d’abord les solutions de congélation de sperme.

La solution de baguage de poisson Ginsburg est fraîche tous les trois jours, et le fluide de congélation est frais tous les jours avec et sans méthanol. La composition de ces solutions se trouve dans les informations complémentaires en ligne accompagnant ce protocole. Les matériaux utilisés dans cette procédure peuvent affecter le taux de congélation et de décongélation, ce qui peut à son tour affecter la fertilité des spermatozoïdes congelés.

Pour cette raison, une liste de matériaux recommandés est également fournie à titre d’information supplémentaire en ligne. Il est préférable de congeler le sperme sur de la glace sèche finement broyée plutôt que sur des granules de glace carbonique. Une façon simple de broyer de la glace sèche est de l’envelopper dans une serviette et de la pulvériser avec un marteau.

Une méthode plus efficace consiste à utiliser un broyeur de glace carbonique tel qu’un broyeur à griffes et un modèle RE deux pour congeler le sperme du poisson-zèbre. Marquez d’abord des tubes capillaires de 10 microlitres avec un stylo de laboratoire au niveau de 3,33 microlitres ou environ 16,7 millimètres du fond pour anesthésier les mâles, placez deux à quatre mâles dans un bécher contenant du trica dilué et de l’eau de poisson. La recette se trouve dans le livre du poisson zèbre.

Une fois anesthésié, retirez le poisson de l’anesthésique à l’aide d’une cuillère en plastique et séchez-le doucement sur une serviette en papier. Portez une attention particulière à dessiner la face ventrale. L’eau active les spermatozoïdes, il est donc essentiel de bien sécher autour de l’ika.

Positionnez le poisson sur le porte-éponge côté ventral vers le haut. Si la région autour des nageoires pelviennes est encore humide, séchez-la doucement avec une lingette Kim. Placez le tube capillaire marqué dans un adaptateur de pipette à bouche en caoutchouc fourni avec les tubes capillaires.

L’adaptateur est un tuyau en caoutchouc doté d’un embout buccal à une extrémité et d’un support capillaire à l’autre. Alternativement, le tube capillaire peut être connecté à une seringue Hamilton de 50 microlitres. À l’aide d’un petit morceau de tube tigon du diamètre approprié, placez le mâle sous la lunette et exposez l’ouverture urogénitale en écartant soigneusement les nageoires pelviennes.

À l’aide de l’extrémité du tube capillaire, exprimez le sperme en caressant doucement les côtés du poisson avec une pince lisse ou en pressant doucement les côtés du poisson avec un index et un pouce, recueillez le sperme dans un tube capillaire pendant qu’il est expulsé à l’aide d’une aspiration douce. Évitez les matières fécales qui peuvent être expulsées avec les spermatozoïdes. Le volume cible de spermatozoïdes est de 3,3 microlitres.

La quantité minimale de spermatozoïdes acceptable varie en fonction de la qualité du sperme. Les bons spermatozoïdes sont blancs et opaques tandis que les spermatozoïdes des pores ont l’air aqueux. En général, la quantité minimale acceptable de spermatozoïdes est d’un microlitre de bons spermatozoïdes ou d’un tiers de la cible, et de deux microlitres de spermatozoïdes ou des deux tiers de la cible.

Si le volume des spermatozoïdes n’atteint pas le volume cible de 3,3 microlitres, il est nécessaire de normaliser le volume à la marque du stylo à l’aide d’un produit de congélation sans méthanol. Si le volume de spermatozoïdes atteint ou dépasse déjà la marque du stylo sur le tube capillaire, passez à l’étape suivante. Ajoutez maintenant le cryoprotecteur au sperme.

Aspirez le fluide de congélation avec du méthanol jusqu’au repère orange. Le volume total approximatif est maintenant de 20 microlitres. Expulsez le mélange de spermatozoïdes et de cryoprotecteur sur une zone propre d’un verre de montre mélangé doucement en pipetant de haut en bas environ quatre fois et évitez d’introduire des bulles.

Aliquote les spermatozoïdes dans deux flacons cryogéniques en pipetant 10 microlitres de la solution cryoprotectrice pour spermatozoïdes au fond de chaque flacon marqué. En se déplaçant rapidement, bouchez les flacons et déposez chaque flacon cryogénique dans un tube faucon séparé de 15 millilitres. À température ambiante, bouchez les tubes de faucon et insérez-les dans de la neige carbonique finement réduite en poudre.

Les tubes doivent être insérés suffisamment profondément pour que seuls les capuchons soient visibles pour garder une trace des tubes de faucon. Numérotez-les et notez le temps pendant lequel chaque tube passe dans la glace sèche. Laissez les spermatozoïdes geler dans la glace sèche pendant 20 minutes.

Une fois le sperme congelé, transférez les deux flacons cryogéniques dans une fiole contenant de l’azote liquide. Pour le stockage temporaire. Placez la boîte de congélation dans un bain d’azote liquide afin que les échantillons ne chauffent pas.

Utilisez de longues pinces métalliques pour récupérer les flacons de la fiole et manipulez-les avec des gants cryogéniques. Alternativement, les flacons cryogéniques peuvent être transférés directement de la glace carbonique dans le congélateur. Si la boîte de congélation est conservée immergée dans de l’azote liquide dans un récipient en polystyrène pour un stockage à long terme, placez les flacons cryogéniques dans un congélateur cryogénique à l’azote liquide.

Pour maintenir la viabilité des spermatozoïdes, il est crucial que les flacons soient stockés immergés dans des flacons d’azote liquide Les flacons stockés en phase vapeur peuvent perdre de leur viabilité avec le temps. La vitesse est également essentielle au maintien de la viabilité des spermatozoïdes. Le temps entre l’ajout du cryoprotecteur et la mise en place des flacons de spermatozoïdes sur de la glace carbonique ne doit pas dépasser 30 secondes pour la fécondation in vitro.

L’utilisation de sperme cryoconservé fonctionne mieux avec deux personnes. Une personne presse les ovules des femelles tandis que l’autre personne dégèle le sperme. Réglez un bain-marie à 33 degrés Celsius.

Retirez un flacon cryogénique du congélateur à l’azote liquide et transférez-le dans un flacon ou un flacon contenant de l’azote liquide jusqu’à ce qu’il soit prêt à décongeler. Pressez les œufs de femelles anesthésiées dans une boîte de Pétri en plastique de 35 millimètres. Ceci est décrit en détail dans le protocole JoVE intitulé Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, qui fournit une description détaillée du poisson-zèbre.

Fécondation in vitro, une bonne couvée contient plus de 150 ovules uniformes et jaunâtres. Tout débris blanc est un signe de dégradation. Si possible, essayez d’obtenir trois couvées d’œufs et de les combiner dans un seul plat.

Si trois bons embrayages ne sont pas obtenus dans la minute qui suit le premier embrayage, passez à l’étape suivante. Gardez la parabole couverte pendant que le sperme est décongelé. Pendant ce temps, retirez le flacon de l’azote liquide et retirez le bouchon.

Plongez rapidement le flacon à mi-cuisson dans un bain-marie à 33 degrés pendant huit à 10 secondes. Ajoutez rapidement 70 microlitres de solution saline tamponnée à température ambiante Hank dans le flacon et mélangez en pipetant de haut en bas, ajoutez-le immédiatement aux œufs dans la boîte de Pétri et mélangez doucement avec la pointe de la pipette. Ensuite, activez immédiatement le sperme et les ovules en ajoutant 750 microlitres d’eau de poisson à mélanger et à incuber pendant cinq minutes à température ambiante.

Après cinq minutes, remplissez le plat de poisson, d’eau et incubez à 28 degrés Celsius. Après deux à trois heures, comptez et transférez les embryons viables dans des boîtes de 100 millimètres à raison de 50 embryons par boîte. Comptez également sur des ovules fécondés pour déterminer la fertilité de l’échantillon de sperme.

La fertilité des spermatozoïdes est le rapport entre les embryons viables et le nombre total d’ovules utilisés pour la fécondation in vitro. Les ovules peuvent être triés à tout moment de deux à six heures après la fécondation in vitro. Lorsque les ovules infertiles sont facilement distingués des embryons viables, les ovules infertiles sont clairs et non divisés.

Lorsqu’elle est observée avec une illumination trans sur un stéréomicroscope, la fertilité moyenne des spermatozoïdes cryoconservés varie considérablement. Cependant, il devrait être possible d’obtenir une fécondité moyenne de 25 % qui soit stable pendant plusieurs années. Ce graphique montre le pourcentage moyen de fertilité des spermatozoïdes congelés entre 2001 et 2003 et considérés aussi récemment qu’en 2008.

Nous venons de faire la démonstration d’une méthode à haut débit pour préserver le sperme de poisson. Dans le cadre de ce protocole, il est important d’utiliser tous les vêtements et équipements en plastique recommandés ainsi que d’utiliser de la glace sèche pilée pulvérisée plutôt que des granules de glace carbonique. Il est essentiel d’utiliser des spermatozoïdes et des ovules de très haute qualité, et dans le cas des ovules, lors de la fécondation in vitro, lors de la hachurage des spermatozoïdes, il est important d’utiliser le plus grand nombre possible d’ovules pour améliorer le nombre d’embryons fertiles que vous obtenez à l’autre extrémité, ce qui pourrait prendre trois à quatre femelles, Droite?

Un autre élément clé du protocole est la vitesse. Il ne devrait jamais falloir plus d’une minute pour passer de l’expression du sperme de l’homme à sa mise dans la glace sèche. Eh bien, je pense que c’est tout.

Bonne chance dans vos expériences.