Name: Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Apprenez une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de Danio rerio et la fécondation in vitro. Ce protocole permet de conserver 100 mâles en moins de deux heures avec un taux de fertilité moyen de 25% sur plus de sept ans.

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Ce travail a été soutenu par le NIH R01 HG002995 &quot;labourer le génome de zebrafish: une approche de génétique inverse&quot; à CBM.

Partie A: Solutions congélation du sperme 1. Ringers poisson Ginsberg (Faire frais tous les 3 jours; Ginsburg, 1963) REMARQUE: l&#39;ordre d&#39;ajout est important de prévenir PRÉCIPITATION Dans 450 ml stériles ddH2O dissoudre: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Puis ajouter: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Amener le volume final à 500 ml avec ddH2O stériles et conserver à 4 ° C. 2. Milieu de congélation (Faire frais du jour) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> Sans méthanol <ul><li> Poissons Ginsburg Ringers 10 ml (température ambiante). </li><li> Lait écrémé en poudre 1,5 g </li></ul></li><li> Avec du méthanol REMARQUE: l&#39;ordre d&#39;ajout est important de prévenir PRÉCIPITATION <ul><li> Poissons Ginsburg Ringer 9 ml (température ambiante). </li><li> 1 ml de méthanol </li><li> Lait écrémé en poudre 1,5 g </li></ul> Après le montage des médias de congélation, bien mélanger pendant 20 min. sur agitateur orbital ou de bascule. Avant d&#39;utiliser, dans la partie aliquote 1 ml tubes Eppendorf, en évitant les bulles de surface. </li></ol> Partie B: Matériel nécessaire pour la congélation du sperme Matériel nécessaire pour la congélation du sperme <ol><li> 10 ul pipettes jetables (chat Fisherbrand # 22-358697) </li><li> Béchers de 250ml d&#39;eau contenant des poissons MESAB / tricaïne </li><li> verres de montre (chat Pyrex # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (ou équivalent) et des conseils </li><li> Détenteur de poissons éponge (pour tenir hommes tout en serrant) </li><li> Dissection microscope avec éclairage de la scène ci-dessus </li><li> Pince plate (type Millipore, par exemple) </li><li> 2.0ml flacons cryogéniques (Cat # 430488 Corning) </li><li> 10X10 cryoboîtes (Nalgene cat # 03-337-7AA) </li><li> Styromousse récipient rempli de ~ 15 cm de ICE1 sèche finement broyées </li><li> 15 ml conique tubes (Falcon # 352099) </li><li> Vase Dewar contenant de l&#39;azote liquide </li><li> Pince à long terme (par exemple CMS Fisher chat Soins de santé # 10-316B) </li><li> Cryogloves </li><li> Réservoir de récupération pour les hommes </li><li> Un tube Eppendorf remplis avec les médias de congélation sans méthanol </li><li> Un tube Eppendorf remplis avec les médias de congélation avec du méthanol </li><li> Cryofreezer (par exemple, Taylor-Warton série K) </li></ol> 1 Une méthode simple pour faire de la glace finement broyées à sec est de l&#39;envelopper dans une serviette et pulvériser avec un marteau. Une méthode plus efficace est d&#39;utiliser un broyeur de glace carbonique, par exemple Clawson modèle RE-2. Partie C: méthode de congélation de sperme <ol><li> MARK TUBES CAPILLAIRES: Avant de commencer, marquer les tubes capillaires 10 ul avec un stylo de laboratoire au niveau de 3,33 ul (c&#39;est à dire 16,7 mm du bas, voir Figure 1.1.). </li><li> Anesthésier MALE: masculin Lieu (x) dans le bécher contenant MESAB / tricaïne dilué dans l&#39;eau les poissons (recette dans «Le Livre de poisson zèbre») </li><li> Poisson séché: Une fois anesthésié, ascenseur poisson hors de l&#39;anesthésie à l&#39;aide d&#39;une cuillère en plastique et éponger délicatement les poissons à sec sur une serviette en papier, en accordant une attention particulière au séchage de la face ventrale. L&#39;eau actionne le sperme il est donc important de sécher complètement autour du cloaque. Position sur les poissons porte-éponge, jusqu&#39;à la face ventrale (Fig. 1.2). Si la région autour de la nageoire anale est encore humide, doucement à sec avec un Kimwipe. Prenez soin de ne pas presser le sperme prématurément! </li><li> Placez marqués tube capillaire dans un adaptateur en caoutchouc pipeter à la bouche qui est inclus avec les tubes capillaires. L&#39;adaptateur est un tuyau en caoutchouc qui a une embouchure sur une extrémité et un porte-capillaire sur l&#39;autre. Alternativement, le tube capillaire peut être reliée à une seringue Hamilton 50 pl via un petit bout de tube Tygon de diamètre approprié. </li><li> Placer sous le mâle de la portée et d&#39;exposer l&#39;ouverture urogénitale par attentivement la propagation des nageoires pelviennes en dehors en utilisant l&#39;extrémité du tube capillaire. </li><li> Recueil de sperme: Expulser spermatozoïdes par caresser doucement les côtés du poisson avec des pinces lisses (par exemple, Millipore), ou en pressant doucement les côtés du poisson entre votre index et le pouce. Recueillir le sperme dans le tube capillaire comme il est expulsé en utilisant une aspiration douce (Fig. 1.2). Evitez les matières fécales qui peuvent être expulsés avec le sperme. </li><li> Normaliser le volume de sperme à 3,3 ul: Si le volume de sperme atteint ou dépasse la marque stylo sur tube capillaire (soit 16,7 mm ou plus), puis passez à l&#39;étape 8. Si le volume de sperme n&#39;atteint pas le volume cible, puis de normaliser le volume de marquer stylo en utilisant le milieu geler sans méthanol (figure 1.3). Montant minimum du sperme qui est acceptable varie avec la qualité du sperme. Bonne spermatozoïde est blanche et opaque. Pauvre de sperme ressemble larmoyants. En général, nous acceptons que des minimums: 1 spermatozoïde ul bon (ou 1 / 3 cible) et 2 ul de sperme pauvre (ou 2 / 3 cible). Le volume est maintenant normalisée à 3,3 pi. </li><li> AJOUTER cryoprotecteur aux spermatozoïdes: Aspirez moyen de congélation avec Ml&#39;éthanol pour la marque orange (approx. volume total est maintenant de 20 ul;. Fig 1.4). Expulser le mélange de sperme et cryoprotecteur sur zone propre d&#39;un verre de montre, en accordant une attention particulière à ne pas introduire de bulles. Mélanger doucement par aspiration et refoulement ~ 4 fois (éviter l&#39;introduction de bulles). </li><li> LIEU 10 ul sperme dans chacune des 2 cryotubes: pipette 10 ul de sperme: solution cryoprotectrice dans le fond de deux cryotubes distincts qui ont été étiquetés avec des informations pertinentes (Fig. 1.5). Déplacement rapide, flacons capuchon et déposez-les dans le bas de la température ambiante 15 ml tubes Falcon-un cryovial / tube. Cap Falcon tube et insérer la paire de tubes Falcon cryovial contenant en glace sèche écrasée. </li><li> Congeler du sperme pendant 20 min. Sur glace sèche: La glace sèche doit être sous forme de poudre fine, pas de pastilles. Les tubes doivent être insérées dans la glace sèche assez profonde que seuls leurs bouchons montrent (fig. 1.6). Afin de garder une trace de tubes dans la glace sèche, donner à chaque paire de tubes Falcon un numéro de 1-20 (écrit sur les bouchons) et enregistrer le temps ils vont dans la glace sèche. </li><li> Cryotubes placer dans l&#39;azote liquide:. Après le sperme a été congelé sur glace sèche pendant 20 minutes, les transférer sur un contenant de l&#39;azote liquide vase Dewar. Le sperme est stocké ici jusqu&#39;à ce que le temps de placer au congélateur azote liquide. Lorsque vous placez dans les boîtes de congélation, coffre congélateur placer dans un bain d&#39;azote liquide afin que les échantillons ne chauffent pas. Utiliser des pinces métalliques longs à récupérer les flacons de vase Dewar et manipuler avec cryogloves. Alternativement, cryotubes peuvent être transférées directement à partir de la glace sèche dans la boîte congélateur si la boîte du congélateur est maintenue immergée dans l&#39;azote liquide dans un récipient en polystyrène expansé. </li><li> Cryotubes magasin à long terme dans un congélateur à azote liquide cryogénique. Afin de maintenir la viabilité des spermatozoïdes, il est important que les flacons sont conservés immergés dans l&#39;azote liquide. Dans notre expérience, flacons stockés dans la phase vapeur perdent leur viabilité dans le temps. La vitesse est importante! Le temps entre l&#39;ajout du cryoprotecteur et en plaçant les flacons de sperme dans la glace sèche (ie les étapes 6-10) ne devrait pas être plus de 30 sec. </li></ol> Partie D: Méthode de fécondation in vitro avec le sperme cryoconservés Nous constatons que cela fonctionne mieux avec deux personnes. Une personne serre les œufs des femelles tandis que l&#39;autre personne dégèle le sperme. <ol><li> Définissez un bain d&#39;eau à 33 ° C. </li><li> Retirer du congélateur cryovial azote liquide et le transfert de l&#39;azote liquide contenant vase Dewar jusqu&#39;au moment de dégel. </li><li> Presser les oeufs des femelles dans les boîtes de Pétri 35mm en plastique. Si possible, essayez d&#39;obtenir trois couvées d&#39;œufs et de combiner en un seul plat. Si vous ne pouvez pas obtenir trois embrayages bonne au sein de 1 min de votre premier embrayage, puis passez à l&#39;étape 4 (un embrayage bonne est suffisant). Définition de l&#39;embrayage bonne:&gt; 150 oeufs à la recherche de manière uniforme belle (jaunâtre-dire, sans aucun débris blancs indique une dégradation). Gardez plat couvert pendant que le sperme est décongelé. </li><li> Retirez le flacon de l&#39;azote liquide et enlever le capuchon. Flacon rapidement plonger ~ 1 / 2 chemin dans 33 ° C bain d&#39;eau pendant 8-10 sec. </li><li> Ajouter rapidement 70 ul température ambiante Hanks au flacon et mélanger par pipetage de haut en bas. Immédiatement ajouter les oeufs et mélanger délicatement avec la pointe de pipette. </li><li> Sans plus tarder, activer le sperme et les oeufs en ajoutant 750 poissons d&#39;eau ul. Faire tourbillonner pour mélanger. Incuber 5 min à température ambiante. </li><li> Après 5 min, remplissez-vaisselle avec l&#39;eau du poisson et un plat incuber à 28 ° C. Après 2-3 heures, le comte et le transfert d&#39;embryons fertiles à des plats 100mm (50/dish). Comptez oeufs stériles de telle sorte que la fréquence de fertilisation peut être déterminée. </li><li> Prenez bien soin des larves! Pour les 5 premiers jours, changer l&#39;eau tous les jours et retirer les embryons morts. Mettez les larves qui ont seuls la vessie natatoire en pépinière sur 5 jours. </li></ol> Partie E: Résultats Représentant Nous avons utilisé cette méthodologie crypreservation de faire une bibliothèque de 8600 échantillons de sperme congelé pour labourer entre les années 2001 et 2003. Nous avons décongelés 106 de ces échantillons et déterminé leur fertilité. La fertilité est le ratio des embryons viables produites dans une fécondation in vitro, divisé par le nombre total d&#39;oeufs qui ont été fécondés avec le sperme congelé. Frais (non cryporeserved) spermatozoïde a généralement la fertilité&gt; 95%; de sperme cryoconservés a fécondité beaucoup plus faible: une moyenne de 29% (n = 106 flacons). La variabilité flacon à flacon de fécondité est élevé, allant de moins de 1% à aussi haut que 62%. Cette variabilité est représentée par les barres d&#39;erreur importante représentant l&#39;écart type dans la Fig. 2. Cependant, dans 106 échantillons de sperme décongelé à jour, nous avons seulement une fois expérimenté la fertilité 0% dans deux échantillons de sperme et a échoué à récupérer la mutation TILLING correspondant. Par le dégel des flacons de sperme provenant de notre bibliothèque au cours de plusieurs années (2001-2008), nous avons constaté que la fécondité moyenne des échantillons de sperme congelé par cette méthode restestables au fil du temps (Fig. 2). La fécondité moyenne des échantillons de sperme congelé dégelé en 2001 était de 23,5% (basé sur 11 échantillons de sperme) et en 2008 était de 25% (basé sur 21 échantillons de sperme). Un certain nombre d&#39;autres chercheurs sont maintenant en utilisant ce protocole de congélation de sperme dans leurs laboratoires. Certains ont rapporté de bons résultats avec des taux de fécondité et de l&#39;échantillon à l&#39;échantillon une variabilité similaire à ce que nous avons observés. D&#39;autres auraient échoué à faire de ce protocole de travail dans leurs mains. Nous croyons que des sources probables de problèmes sont les suivants: <ol><li> Ne pas utiliser les cryotubes exacte ou tubes coniques, nous avons suggéré dans le protocole, conduisant à un taux différent de refroidissement lorsque dans la glace sèche; </li><li> La non utilisation de poudre de glace sèche, conduisant à une vitesse de refroidissement sous-optimale; </li><li> En utilisant les poissons mâles à la fertilité médiocre: vous devriez obtenir au moins 1 ul de sperme à partir d&#39;un seul mâle. Vous pouvez également tester la fertilité masculine en faisant une fécondation in vitro avec le sperme frais, mais cela peut être trompeur, car il prend très peu de sperme frais de s&#39;approcher de la fertilité de 100%. </li><li> En utilisant des oeufs de qualité inférieure aux normes dans la fécondation in vitro. Utiliser tout sauf embrayages parfaite conduit toujours à proximité de la fertilité de 0%, même à partir d&#39;échantillons de sperme qui ont réellement une bonne fertilité (basé sur la fertilité de la fiole en double). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma de la méthodologie de la congélation du sperme. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Fertilité des spermatozoïdes cryoconservés reste stable au fil du temps. La fertilité pour cent est le nombre d&#39;embryons viables produites dans une fécondation in vitro, divisé par le nombre total d&#39;oeufs qui ont été fécondés avec le sperme congelé. &quot;N&quot; désigne le nombre de flacons de sperme cryoconservés dont la fertilité a été testé dans l&#39;année correspondante. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart-type. Comme chaque flacon de sperme est d&#39;un mâle différent, flacon à flacon variabilité est observée.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

Un certain nombre d&#39;autres chercheurs sont maintenant en utilisant ce protocole de congélation de sperme dans leurs laboratoires. Certains ont signalé la fertilité similaires et le même échantillon à l&#39;échantillon que nous avons la variabilité observée. D&#39;autres auraient échoué à faire de ce protocole de travail dans leurs mains. Nous croyons que des sources probables de problèmes sont les suivants: <ol><li> Ne pas utiliser les cryotubes exacte ou tubes coniques, nous avons suggéré dans le protocole, conduisant à un taux différent de refroidissement lorsque dans la glace sèche; </li><li> La non utilisation de poudre de glace sèche, conduisant à une vitesse de refroidissement sous-optimale; </li><li> En utilisant les poissons mâles à la fertilité médiocre: vous devriez obtenir au moins 1 ul de sperme à partir d&#39;un seul mâle. Vous pouvez également tester la fertilité masculine en faisant une fécondation in vitro avec le sperme frais, mais cela peut être trompeur, car il prend très peu de sperme frais de s&#39;approcher de la fertilité de 100%. Plus grand, plus robuste mâles colorés donnent généralement le sperme de qualité plus élevés. </li><li> En utilisant des oeufs de qualité inférieure aux normes dans la fécondation in vitro. Utiliser tout sauf embrayages parfaite conduit toujours à proximité de la fertilité de 0%, même à partir d&#39;échantillons de sperme qui ont réellement une bonne fertilité (basé sur la fertilité de la fiole en double). </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Plaquettes pipettes jetables de 10 &amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>Verres de montre</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>Plaquettes vials cryogéniques de 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Plaquettes cryoboxes de 10 x 10</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>Plaquettes tubes coniques de 15 ml</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur cryogénique</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>Par exemple</td></tr></tbody></table>

une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de in vitro la fertilisation

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

C&#39;est une méthode pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre qui est une adaptation de la méthode Harvey (Harvey et al., 1982). Nous avons introduit deux modifications au protocole original que les deux rationaliser la procédure et l&#39;uniformité de l&#39;échantillon augmente. Premièrement, nous normalisons tous les volumes de sperme à l&#39;aide des médias de congélation qui ne contient pas l&#39;cryoprotecteur. Deuxièmement, les spermatozoïdes cryopréservés sont stockés dans des cryotubes au lieu de tubes capillaires. Le taux de spermatozoïdes gel et de dégel (δ ° C / heure) sont probablement les deux variables les plus critiques à contrôler dans cette procédure. Pour cette raison, ne pas remplacer les tubes différents de ceux spécifiés. Travaillant en équipes de 2, il est possible de congeler le sperme de 100 hommes par équipe dans ~ 2 heures. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% (mesurée par le nombre d&#39;embryons viables généré en une fécondation in vitro, divisé par le nombre total d&#39;œufs fécondés) et cette fertilité pour cent est stable depuis de nombreuses années.

Ceci est un protocole de haut débit de cryoconservation des spermatozoïdes de poisson zèbre. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% de fécondation in vitro ultérieure et est stable depuis de nombreuses années.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

Ceci est une méthode de cryoconservation du sperme de poisson-zèbre qui est une adaptation de la méthode de Harvey (Harvey et al., 1982). Nous avons introduit deux modifications à...

Bonjour, je suis Bruce Draper de l'Université de Californie à Davis, département de biologie moléculaire et cellulaire, et voici Cecilia Moans de la Division des sciences fondamentales du Centre de recherche sur le cancer Fred Hutchinson à Seattle. Aujourd'hui, Cecilia et moi allons démontrer le protocole de cryoconservation du sperme de poisson zèbre, une adaptation du protocole original de Brian Harvey. Nous allons vous montrer qu'en travaillant par équipes de deux, il est possible de cryoconserver le sperme de 100 mâles individuels en moins de deux heures.Bien qu'il existe une grande variété de fertilité après décongélation, en moyenne, nous obtenons une fertilité de 25 %, et cela provient d'une banque cryopréservée depuis plus de sept ans. Commençons donc. Avant d'effectuer cette procédure, préparez tout d'abord les solutions de congélation des spermatozoïdes.La solution de Ringer pour poisson Ginsburg est préparée fraîche tous les trois jours, et le milieu de congélation est préparé quotidiennement, avec ou sans méthanol. La composition de ces solutions est disponible dans les informations supplémentaires en ligne accompagnant ce protocole. Les matériaux utilisés dans cette procédure peuvent influencer la vitesse de congélation et de décongélation, ce qui peut à son tour affecter la fertilité du sperme congelé.Pour cette raison, une liste de matériel recommandé est également fournie en tant qu'information complémentaire en ligne. Il est préférable de congeler le sperme sur de la glace sèche finement broyée plutôt que sur des pastilles de glace sèche. Une méthode simple pour broyer la glace sèche consiste à l'envelopper dans une serviette et à la pulvériser à l'aide d'un marteau.Une méthode plus efficace consiste à utiliser un broyeur à glace sèche, tel qu'un modèle RE à griffes, pour congeler le sperme de poisson zèbre. Commencez par marquer des tubes capillaires de 10 microlitres avec un stylo de laboratoire au niveau de 3,33 microlitres, soit environ 16,7 millimètres à partir du fond. Pour anesthésier les mâles, placez deux à quatre mâles dans un bécher contenant une solution de trica diluée dans de l'eau pour poissons. La recette peut être trouvée dans le livre sur le poisson zèbre.Une fois anesthésiés, sortez les poissons de l'anesthésique à l'aide d'une cuillère en plastique et séchez-les délicatement avec une serviette en papier. Veillez particulièrement à bien sécher la face ventrale. L'eau active les spermatozoïdes, il est donc essentiel de bien assécher la zone autour de l'ika.Placer le poisson sur le support en éponge, côté ventral vers le haut. Si la région autour des nageoires pelviennes est encore humide, la sécher délicatement avec un essuietout Kim. Placer le tube capillaire marqué dans un embout en caoutchouc pour pipette, fourni avec les tubes capillaires.L'adaptateur est un tuyau en caoutchouc doté d'une embout buccal à une extrémité et d'un support de capillaire à l'autre. Alternativement, le tube capillaire peut être relié à une seringue Hamilton de 50 microlitres. À l'aide d'un court morceau de tube en tigon de diamètre approprié, placez l'individu mâle sous le microscope et exposez l'ouverture urogénitale en écartant délicatement les nageoires pelviennes.À l’aide de l’extrémité du tube capillaire, exprimer le sperme en caressant doucement les flancs du poisson avec une pince lisse ou en comprimant délicatement les flancs du poisson entre l’index et le pouce, et recueillir le sperme dans un tube capillaire au fur et à mesure de son expulsion en appliquant une aspiration légère. Éviter les matières fécales qui pourraient être expulsées avec le sperme. Le volume cible de sperme est de 3,3 microlitres.La quantité minimale de sperme acceptable varie selon la qualité du sperme. Un bon sperme est blanc et opaque, tandis qu’un sperme pauvre a une apparence aqueuse. En général, la quantité minimale acceptable de sperme est d’un microlitre de sperme de bonne qualité ou d’un tiers de la cible, et de deux microlitres de sperme pauvre ou des deux tiers de la cible.Si le volume de sperme n'atteint pas le volume cible de 3,3 microlitres, il est nécessaire de normaliser le volume jusqu'au trait de repère à l'aide de milieu de congélation sans méthanol. Si le volume de sperme atteint déjà ou dépasse le trait de repère sur le tube capillaire, passez à l'étape suivante. Ajoutez maintenant le cryoprotecteur au sperme.Aspirez le milieu de congélation avec du méthanol jusqu'au trait orange. Le volume total approximatif est maintenant de 20 microlitres. Expulsez délicatement le mélange de sperme et de cryoprotecteur sur une zone propre d'une lame de montre, puis mélangez en pipetant doucement de haut en bas environ quatre fois, en évitant d'introduire des bulles.Prélevez une aliquote du sperme dans deux fioles de cryoconservation en pipettant 10 microlitres de la solution de cryoprotecteur pour sperme au fond de chaque fiole étiquetée. Fermez rapidement les fioles et déposez chaque fiole de cryoconservation dans un tube Falcon distinct de 15 millilitres. À température ambiante, fermez les tubes Falcon et insérez-les dans de la glace sèche finement pulvérisée.Les tubes doivent être insérés suffisamment profondément pour que seuls les bouchons soient visibles, afin de repérer facilement les tubes Falcon. Numérotez-les et notez l'heure à laquelle chaque tube est placé dans la glace sèche. Laissez les spermatozoïdes congeler dans la glace sèche pendant 20 minutes.Une fois que le sperme est congelé, transférez les deux cryotubes dans un flacon Dewar contenant de l'azote liquide, pour une conservation temporaire. Placez la boîte de congélation dans un bain d'azote liquide afin que les échantillons ne chauffent pas.Utilisez des pinces métalliques longues pour récupérer les flacons du flacon donneur et manipulez-les avec des gants cryogéniques. Alternativement, les flacons cryogéniques peuvent être transférés directement depuis la glace sèche vers le congélateur. Si la boîte de congélation est conservée immergée dans l'azote liquide dans un récipient en polystyrène pour une conservation à long terme, placez les flacons cryogéniques dans un congélateur cryogénique à azote liquide.Pour maintenir la viabilité des spermatozoïdes, il est essentiel que les flacons soient stockés immergés dans l'azote liquide ; les flacons stockés dans la phase vapeur peuvent perdre leur viabilité au fil du temps. La rapidité est également cruciale pour préserver la viabilité des spermatozoïdes. Le délai entre l'ajout du cryoprotecteur et la mise des flacons de spermatozoïdes sur de la glace sèche ne doit pas dépasser 30 secondes Fécondation in vitro.L'utilisation de sperme cryoconservé donne les meilleurs résultats avec deux personnes. Une personne extrait les œufs des femelles tandis que l'autre décongèle le sperme. Régler un bain-marie à 33 degrés Celsius.Retirer un cryotube de l'azote liquide et le transférer vers un flacon D ou un flacon contenant de l'azote liquide jusqu'à ce qu'il soit prêt à être décongelé. Extraire les œufs des femelles anesthésiées dans une boîte de Pétri en plastique de 35 millimètres. Cette procédure est décrite en détail dans le protocole JoVE intitulé « Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure », qui fournit une description approfondie du poisson-zèbre.Pour la fécondation in vitro, une bonne ponte contient plus de 150 œufs uniformes et jaunâtres. Tout débris blanc indique une dégradation. Si possible, essayez d'obtenir trois pontes d'œufs et de les combiner dans un seul plat.Si trois bonnes pontes ne sont pas obtenues dans l'minute suivant la première ponte, passez à l'étape suivante. Gardez la boîte couverte pendant que le sperme dégèle. Pendant ce temps, retirez le flacon de l'azote liquide et enlevez le bouchon.Immergez rapidement le tube à essai à moitié dans un bain d'eau à 33 degrés pendant huit à dix secondes. Ajoutez rapidement 70 microlitres de solution saline tamponnée de Hank à température ambiante au tube à essai et mélangez en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas, puis ajoutez immédiatement aux œufs dans la boîte de Pétri et mélangez délicatement avec la pointe de la pipette. Ensuite, activez immédiatement les spermatozoïdes et les œufs en ajoutant 750 microlitres d'eau pour poisson, tourbillonnez pour mélanger et incubez pendant cinq minutes à température ambiante.Après cinq minutes, remplir la boîte avec les poissons, de l'eau, et incuber à 28 degrés Celsius. Après deux à trois heures, compter et transférer les embryons viables dans des boîtes de 100 millimètres, avec 50 embryons par boîte. Compter également les œufs fécondés afin de déterminer la fécondité de l'échantillon de sperme.La fertilité des spermatozoïdes correspond au rapport entre le nombre d'embryons viables et le nombre total d'ovules utilisés pour la fécondation in vitro. Les ovules peuvent être triés entre deux et six heures après la fécondation in vitro. Lorsque les ovules non fécondés sont facilement distinguables des embryons viables, ces derniers apparaissent clairs et non divisés.Lorsqu'on les observe en transillumination au microscope stéréo, la fertilité moyenne des spermatozoïdes cryoconservés varie fortement. Toutefois, il devrait être possible d'obtenir une fertilité moyenne de 25 %, stable sur plusieurs années. Ce graphique montre le pourcentage moyen de fertilité des spermatozoïdes congelés entre 2001 et 2003 et testés aussi récemment qu'en 2008.Nous venons de démontrer une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zéro. Lors de la réalisation de ce protocole, il est important d'utiliser tous les équipements et plastiques recommandés, ainsi que de la glace sèche broyée pulvérisée plutôt que des pastilles de glace sèche. Il est essentiel d'utiliser un sperme et des œufs de très haute qualité, et dans le cas des œufs, lors de la fécondation in vitro, immédiatement après avoir activé le sperme, il est important d'utiliser un nombre aussi élevé que possible d'œufs afin d'augmenter le nombre d'embryons fécondés obtenus à la fin, ce qui pourrait nécessiter trois à quatre femelles, n'est-ce pas ?Un autre élément clé du protocole est la rapidité. Il ne devrait jamais s'écouler plus d'une minute entre l'expression du sperme du mâle et son dépôt sur de la glace sèche. Eh bien, je crois que c'est tout.Bonne chance avec vos expériences.

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Biologie

Le poisson-zèbre est un système modèle puissant pour la biologie du développement et la recherche sur les maladies humaines en raison de sa similitude génétique avec les vertébrés supérieurs. Ce protocole décrit une méthodologie permettant de créer des embryons de poisson-zèbre haploïde qui peuvent être utilisés pour des stratégies de dépistage avancé afin d’identifier les mutations récessives dans les gènes essentiels à l’embryogenèse précoce.

Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par<em&gt; In Vitro</em&gt; Engrais

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Un protocole modifié pour la manipulation ploïdie utilise un choc thermique pour induire un décrochage d'un cycle cytokinèse dans l'embryon précoce. Ce protocole est mise en évidence chez le poisson zèbre, mais il peut être applicable à d'autres espèces.

Manipulation Ploïdie de Zebrafish Embryons avec Heat Shock Treatment 2

L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. En outre, la répétabilité de la méthode dans cinq souches différentes de poisson-zèbre a été testée.

Cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide

Développement de cils est vitale pour l’organogenèse appropriée. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour étiqueter et de visualiser les cellules ciliées du poisson-zèbre.

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

Poisson zèbre servaient récemment un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de réplication ADN au cours du développement. Voici détaillées les protocoles d’utilisation des embryons de poisson-zèbre à synchronisation de réplication de profil. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier la synchronisation de la réplication en mutants, types de cellules individuelles, les modèles de maladies et d’autres espèces.

Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

Ce protocole démontre l'immunofluorescence séquentielle et l'immunohistochimie sur des cryosections des embryons de poisson zèbre de stade précoce permettant des analyses précises de colocalisation dans des populations cellulaires spécifiques.

Immunofluorescence séquentielle et immunohistochimie sur les embryons de poissons zèbres cryosectionnés

Présenté ici est un protocole pour l’analyse in situ entière d’hybridation d’ARN in situ dans le poisson zèbre et l’essai de formation de tube dans les cellules endothéliales pluripotentes induites par le patient pour étudier le rôle de l’endoglin dans la formation vasculaire.

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Ici, nous présentons un protocole pour la détection fluorescente des protéines par anticorps dans des préparations entières d'embryons et de larves de poissons zèbres.

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Ce protocole décrit comment obtenir des images en combinant l’hybridation in situ et l’immunohistochimie de coupes embryonnaires de poisson-zèbre. L’hybridation in situ a été réalisée avant la cryosection, suivie d’une coloration des anticorps. Il est utile de détecter les schémas d’expression de deux gènes chez le poisson zèbre s’il y a une pénurie d’anticorps.

In situ Hybridation combinée à l’immunohistochimie dans des embryons de poisson-zèbre cryosectionnés

Ce protocole décrit une méthode de microscopie optique peu coûteuse pour évaluer la morphologie et la fonction cardiaques chez les embryons de poisson-zèbre, permettant une évaluation reproductible de la cardiotoxicité pour le développement sans avoir besoin de systèmes d’imagerie avancés.

Imagerie cardiaque fonctionnelle chez les embryons de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie standard et de l’analyse vidéo : applications dans la recherche environnementale et biomédicale

Apprenez une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de Danio rerio et la fécondation in vitro. Ce protocole permet de conserver 100 mâles en moins de deux heures avec un taux de fertilité moyen de 25% sur plus de sept ans.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

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