Faire Zebrafish diploïdes gynogénétiques par Pression Early

Bonjour, je suis Charlene Walker du laboratoire de Charles Kimmel à l'Université de l'Oregon, Institut des neurosciences. Et je suis Gregory Walsh. Je travaille dans le laboratoire de Cecilia Moens au sein de la Division des sciences fondamentales du Centre de recherche sur le cancer Fred Hutchinson.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'obtenir des zebrafish diploïdes tic par la méthode de pression précoce. Cette méthode utilise une pression hydrostatique pour dépolymériser les microtubules dans un œuf fécondé avec des spermatozoïdes irradiés aux UV. Effectuée avec un timing approprié.

Cela empêche l'expulsion du deuxième globule polaire, produisant un embryon diplo dont les chromosomes homologues sont les deux produits de la méiose.One. Cette technique a été mise au point au début des années 1970 lorsque je travaillais dans le laboratoire de George Reisinger à l'Université de l'Oregon. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette procédure dans deux criblages génétiques de génération quatre.

Les gamètes de poissons mutagénisés F1 peuvent être analysés directement afin de détecter des mutations récessives responsables de phénotypes développementaux chez les descendants gynogénétiques diploïdes homozygotes. Étant donné que le poisson zèbre présente une forte interférence génétique, nous utilisons également cette méthode pour cartographier les mutations sur les chromosomes et pour estimer la distance séparant ces mutations du centromère. Commençons donc. En fin d'après-midi, la veille de l'expérience, préparez-vous à la collecte de sperme en séparant les mâles et les femelles destinés à être pressés ; des mâles âgés peuvent être utilisés puisqu'ils ne contribueront à aucun matériel génétique.

Les femelles doivent présenter un ventre large et dodu, tandis que les mâles doivent paraître jaunes et alertes. Garder les mâles et les femelles séparément toute la nuit dans des réservoirs d'attente facilement accessibles le matin. Le matin de l'expérience, préparer la solution de Hank et ajouter du bicarbonate de sodium.

Apportez au laboratoire de maintenance des poissons dans un seau à glace. La solution de Hank permet de déclencher un minuteur et des tubes pour la collecte du sperme. Enfin, une fois dans le laboratoire de poissons, diluez la trica dans de l'eau pour poissons.

Cela sera utilisé pour anesthésier les poissons à l'étape suivante. Pour commencer la collecte du sperme, préparez un flacon transparent contenant de la solution de Hank refroidie sur glace. Prévoyez suffisamment de solution de Hank, environ 50 microlitres par mâle à presser, et anesthésiez un ou deux mâles à la fois.

Par immersion et trica, ils peuvent être retirés de l'anesthésique à l'aide d'une cuillère en plastique. Rincez les mâles et l'eau des poissons, puis essuyez-les légèrement avec une serviette en papier. Cette étape est très critique car l'eau active les spermatozoïdes.

Une fois qu'ils sont secs, monter les poissons dans un support en mousse sous un microscope stéréo à faible grossissement avec une illumination épiscopique. Séparer les nageoires pelviennes à l’aide de pinces et positionner une microcapillaire à l’ouverture de la cloaque pour commencer la collecte du sperme. Stimuler doucement mais fermement les flancs du poisson avec des pinces à mine lisse, et au fur et à mesure que le sperme laiteux sort par l’orifice génital, l’aspirer dans la microcapillaire à l’aide d’une aspiration douce ; recueillir le sperme de plusieurs mâles sur de la glace.

Sémen frais dans du sérum physiologique froid. Le sperme de cinq à dix mâles est suffisant pour féconder les œufs de 20 à 30 femelles. Le sperme conservé au froid dans du Hanks conserve une efficacité de fécondation élevée pendant plusieurs heures.

Recueillir suffisamment de spermatozoïdes pour obtenir une suspension trouble afin d'inactiver les spermatozoïdes par UV. Commencez par remplir le fond d'une boîte de Pétri en verre avec de la glace. Placez une coupelle en verre sur la glace à l'intérieur de la boîte.

Ensuite, utilisez la pipette pour transférer les spermatozoïdes du tube à essai sur la lame d'horloge. Veillez à prélever autant que possible les spermatozoïdes dans la pipette sans aspirer de bulles d'air. Il est essentiel d'éviter de faire entrer des bulles dans les spermatozoïdes ; expulsez-les en une couche mince et uniforme sur la lame d'horloge, puis jetez la pipette.

Une fois le sperme transféré, placez la boîte de Pétri dans un appareil de réticulation UV. Activez l'appareil de réticulation réglé sur une énergie de 900 JUULs. Après la réticulation, utilisez une pipette propre pour retirer le sperme de la coupelle en verre et transférez-le dans un tube fendor marqué « sperme UV » puis placez-le sur de la glace.

Pour commencer la collecte d'œufs, anesthésiez deux femelles à la fois. Dans le Trica, il est essentiel de ne pas laisser les poissons trop longtemps dans le Trica, car une anesthésie prolongée peut tuer les poissons. Ensuite, rincez les poissons dans de l'eau pour poissons et séchez-les légèrement avec une serviette en papier.

Ceci est essentiel car l'excès d'eau fait gonfler les œufs et empêche la fécondation. Placer la femelle dans une boîte de Petri en plastique de 35 millimètres avec les doigts humides mais non mouillés. Appuyer doucement mais fermement sur le ventre.

Si elle est prête à pondre, les œufs sortiront facilement ; récupérez-les à l’aide d’une spatule et remettez la femelle dans l’eau. Les bons œufs présentent une couleur jaunâtre et translucide, tandis que ceux qui sont restés trop longtemps dans la femelle sont blancs et aqueux. Pour s’assurer d’obtenir de bons œufs, collectez-les durant les deux premières heures suivant l’allumage des lumières dans l’installation piscicole, et maintenez les œufs recouverts afin d’éviter qu’ils ne s’assèchent.

Après avoir collecté les œufs, ajoutez 30 à 50 microlitres de la suspension de spermatozoïdes UV aux œufs et mélangez délicatement à l’aide d’une pointe de pipette. Ajoutez immédiatement environ un millilitre d’eau pour poisson et déclenchez le chronomètre. Les œufs laissés à se développer à ce stade seront haploïdes.

Les étapes suivantes doivent être réalisées dans les 90 secondes suivant la fécondation. Déclenchez le chronomètre au moment où les œufs sont activés par l'ajout d'eau.

Le moment exact de la métaphase de la première division de la méiose dépend de la température. Le moment d'application et de suppression de la pression est optimisé à 28,5 degrés Celsius. Après avoir démarré le chronomètre, attendez quelques instants, puis ajoutez davantage d'eau et faites glisser les œufs vers le centre de la boîte.

À l’aide d’une pipette Pasteur coupée et polie, transférez les œufs fécondés dans les fioles de pression si nécessaire, ajoutez davantage d’eau pour œufs dans la fiole jusqu’à ce qu’elle soit presque pleine, en laissant une goutte d’eau au niveau de l’anneau des fioles. Ensuite, placez un bouchon en caoutchouc par-dessus la goutte d’eau et fixez le couvercle en plastique par-dessus le caoutchouc.

Placer les vials à l’envers dans le cylindre de pression, en ajoutant de l’eau d’œufs. Pour remplir à nouveau le cylindre, fixer solidement le couvercle sur le cylindre. Une fois fermé, placer le cylindre dans la presse avec le piston vers le haut et appliquer une pression de 8 000 livres par pouce carré.

Laisser le cylindre dans la presse jusqu'à six minutes après le moment de l'activation, pour une durée totale de 4,5 minutes sous pression. Six minutes après l'activation, retirer le cylindre de la presse. Retirer les flacons du cylindre et les sécher soigneusement afin d'éviter le refroidissement des embryons.

Réinitialisez le cylindre et remplissez-le à nouveau d’eau pour œufs. Préparez les prochaines fioles en les remplissant partiellement d’eau pour œufs selon les besoins. Répétez ces étapes pour tous les lots d’œufs.

Le cylindre peut contenir jusqu'à deux flacons à la fois, vous pouvez donc souhaiter retarder la fécondation des œufs d'une à deux minutes afin de vérifier si d'autres femelles déjà présentes dans la trica pondent des œufs. Cela permettra d'accélérer le processus en traitant plusieurs lots simultanément. De plus, si vous pressez les poissons pendant que la presse est utilisée, les œufs pourraient devenir trop secs pour être viables d'ici la prochaine utilisation de la presse. Vingt-quatre heures après la fécondation, un embryon haploïde de zebrafish présentera un corps court et trapu, une queue courte et un cerveau moins bien formé.

Pourtant, ils auront tous les mêmes parties du corps, comme les somites, la corde dorsale, les yeux et les oreilles. En tant que diploïdes, les haploïdes et les diploïdes présentent tous des mouvements de flexion non inhibés vers 24 heures après la fécondation. Les frères et sœurs diploïdes EP ont une longue queue, un cerveau bien formé et devraient avoir une viabilité d’environ 60 à 70 %.

Ces embryons ressemblent beaucoup aux contrôles déployés non traités. Généralement, un lot d'embryons haplo présentera un mélange d'embryons en bon état, d'embryons morts et de tous les intermédiaires. La proportion d'embryons en bon état par rapport aux embryons défectueux reflète les gènes délétères présents dans le génome femelle.

Les mutations sont relativement faciles à identifier, même avec ce fond génétique, car plusieurs individus, jusqu'à 50 %, présenteront le même phénotype caractéristique. Il est important de s'assurer que les embryons produits par cette méthode sont de véritables tic OIDs, en utilisant comme témoins une ponte d'œufs normalement développés obtenus en mettant de côté un peu de sperme non inactivé par les UV, et une ponte d'embryons haploïdes obtenus en mettant de côté une ponte d'œufs fécondés avec du sperme UV sans passer par la procédure EP ; les haploïdes ne sont pas viables au-delà de deux à trois jours. Les embryons EP développés doivent présenter un aspect normal, comparable à celui des diploïdes.

Bien qu'une certaine proportion de monstres EP irréguliers puisse apparaître, les pontes de diploïdes EP devraient être en grande partie viables, aux alentours de 70 à 90 %. La présence de haploïdes dans la ponte issue du processus EP indique un échec de ce dernier, par exemple, une pression insuffisante maintenue par la presse. La présence de diploïdes dans la ponte d'haploïdes suggère une inactivation incomplète du sperme, par exemple, un échec du réactif réticulant.

Nous venons de vous montrer à quel point il est facile de réaliser une fécondation in vitro avec des zebrafish et de produire des embryons de zebrafish diploïdes d'origine gynogénétique en inhibant la deuxième division méiotique. Lors de cette procédure, il est essentiel de se rappeler que le moment de la pression précoce est précis et que la presse maintient une pression constante de 8 000 livres par pouce carré tout au long du traitement. Veillez à ce que votre presse soit bien étalonnée.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.