Name: Visualiser le cœur battant Drosophile /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-28T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Découvrez les techniques de visualisation du cœur battant chez Drosophila aux stades larvaire et adulte. Ces protocoles de dissection et d'immobilisation permettent d'étudier la physiologie cardiaque in vivo.

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KO est soutenu par une subvention de l&#39;American Heart Association.

Avant de commencer Coeurs adultes <ol><li> Fraîchement préparer hémolymphe artificielle (AH) solution contenant 108mm Na +, 5 mM de K +, 2 mM de Ca 2 +, 8mm MgCl2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, saccharose 10 mM, tréhalose 5mM, HEPES 5mm (pH 7,1, tous les réactifs de Sigma Chemicals). Le saccharose et le tréhalose devrait être ajouté à l&#39;AH à partir de solutions mères réfrigéré juste avant l&#39;utilisation afin de prévenir la contamination bactérienne. </li><li> Apportez AH à la température ambiante et oxygéner la solution par air-bullage pendant au moins 15 min. </li><li> Tirez plusieurs fins capillaires (par exemple capillaires de verre, 100 ul, VWR) requis pour l&#39;élimination des graisses. </li></ol> Cœur des larves <ol><li> Sylgard enduit de lamelles: en utilisant un cure-dent, le transfert d&#39;environ 50-70μl de solution Sylgard sur une lamelle 22x22mm. Laissez durcir le Sylgard à 65 ° C pendant la nuit. </li><li> Préparer le Broadie et le tampon de Bate (135mm NaCl, KCl 5 mM, MgCl 2 4 mM, 2 mM CaCl 2, 5 mM TES, saccharose 36mm;. PH 7,15 Voir Broadie et Bate, 1993). </li><li> Préparer les outils nécessaires pour appliquer la colle Histoacryl. Tout d&#39;abord, tirez plusieurs fins capillaires (par exemple sciences Produits GB100T8P). Connecter une extrémité de la pipette 1,5 ml avec un tuyau en plastique de petite taille (Tygon, 1 / 32 &quot;) en insérant l&#39;extrémité la plus petite dans le tube. Insérez un capillaire avec sa large ouverture à l&#39;autre extrémité. Chargez le capillaire avec de la colle Histoacryl en plongeant le capillaire dans une goutte de colle et une aspiration douce dans l&#39;embout en plastique. Lorsque vous travaillez avec de la colle on devrait avoir un deuxième verre capillaire à la main pour enlever la colle excessive de la pointe de la colle capillaire. La colle est liquide jusqu&#39;à ce qu&#39;il entre en contact avec une solution saline tamponnée où il va durcir en quelques secondes. Cependant, il reste généralement en plastique assez longtemps pour être retiré de la pointe de la colle capillaire ou à tout en l&#39;appliquant à l&#39;échantillon. </li></ol> Semi-Cœur intacte drosophile de la mouche adulte <ol><li> Adulte mouches drosophiles sont anesthésiés avec Nap Fly (Caroline biologique Supply Co.) pendant 2-5 minutes. Des précautions doivent être prises pour ne pas laisser les mouches dans le Nap Fly pour de plus longues expositions. L&#39;exposition à court terme au froid peut également être utilisé pour anesthésier les mouches mais le CO 2 n&#39;est pas recommandée car elle a des effets plus durables sur le rythme cardiaque et de la rythmicité. </li><li> Mouches anesthésiés sont placés, face dorsale vers le bas, dans une boîte de Petri recouverte d&#39;une fine couche de gelée de pétrole. La cuticule hydrophobe dans les ailes et le corps de manière réversible «coller» à la gelée, mais la mouche peut être repositionné si nécessaire. Cela devient particulièrement important lors des manipulations ultérieures. </li><li> Une première coupe est faite en utilisant une paire de ciseaux courbes printemps (Roboz # 5611). Les lames des ciseaux sont placés sous les pattes et inclinées vers le bas vers la surface dorsale du thorax près du cou. La tête, le cordon nerveux ventral, et les jambes sont enlevés avec une seule coupe. La préparation est ensuite immergé dans une oxygénée, hémolymphe artificielle (AH) solution. </li><li> Avec des ciseaux à ressort de la pointe postérieure de l&#39;abdomen (composé de segments abdominaux 7 et 8) est enlevé avec une seule coupe. Cela fournit un accès pour faire des coupes latérales le long des deux bords de l&#39;abdomen et sert à couper les liens entre l&#39;intestin postérieur et la cuticule abdominale. Le volet libéré de la cuticule abdominale ventrale est ensuite retiré. </li><li> Dans les étapes 3 et 4, les liaisons antérieures et postérieures de l&#39;intestin sont coupés de sorte les organes abdominaux sont désormais tenus en place que par tracheols. L&#39;intestin et d&#39;autres organes abdominaux peuvent habituellement être enlevé comme une masse unique à l&#39;aide des pinces de bijoutier (Roboz, # 55) et doux tiraillement. Retrait des organes internes révèle le tube coeur battant encore attaché à la cuticule dorsale entourée de corps gras. </li><li> Les corps gras sont assez opaques au microscope optique, par conséquent, il est souvent nécessaire d&#39;enlever une partie de cette graisse, afin de voir le tube cardiaque clairement. Ceci est accompli en utilisant une technique de liposuccion finement dessinés capillaires en verre. Les capillaires sont faites en utilisant une norme pipette extracteur (Ex. Sutter P-97 Extracteur pipette) et sont ensuite insérées dans un tube en plastique (Tygon, 1 / 16 &quot;) attaché à une source de vide. Ce système est utilisé à l&#39;aspiration hors excès de graisse autour du tube cardiaque. Force d&#39;aspiration est proportionnelle au diamètre pointe afin Pipettes avec pointes de plus de 40 microns de diamètre ne doit pas être utilisé. Un soin extrême doit être pris pour éviter de toucher le cœur lui-même et parce que la partie postérieure du cœur est très fragile de cette région devrait être évitée. </li><li> Le tube cardiaque adulte drosophile est maintenant exposée et devrait être battu. Si nécessaire, le coeur cuticule et attachés peuvent être repositionnées en soulevant doucement la cuticule de la gelée de pétrole et soigneusement bourrage vers le bas, encore une fois en évitant tout contact avec le tissu cardiaque. A tson point la solution de bain de la préparation doit être remplacé par AHL frais. Cette préparation devrait être autorisé à s&#39;équilibrer pendant 20-30 minutes avec l&#39;oxygénation avant toute manipulation. Si la préparation doit être maintenu pendant plus de 60 minutes, il devrait être perfusé avec AHL frais. </li></ol> Immobilisation larves de drosophile pour l&#39;enregistrement optique <ol><li> Déposer une goutte de colle Histoacryl près de chaque coin du Sylgard lamelles. Ajouter 50 pl de B &amp; B tampon pour les gouttes de colle qui durcit instantanément. Remplir l&#39;espace entre les taches collées avec B &amp; B - la colle va garder le tampon sur la diapositive. </li><li> Prenez une larve L3 errance et le placer sur un morceau de papier tissu humide sur la glace pendant 2 min. Cela va ralentir son mouvement. Puis transfert de la larve dans le tampon et l&#39;orienter à la face dorsale vers le haut (c&#39;est le côté de la larve qui n&#39;a pas la ceinture de denticules). Appliquez rapidement un peu de colle entre la région de la tête et le Sylgard. La colle durcit très rapidement et d&#39;empêcher la tête de la larve de se déplacer. </li><li> En utilisant des pinces attentivement attraper l&#39;animal par les stigmates postérieurs et doucement l&#39;étirer. Fixer la larve dans cette position par l&#39;application de la colle le long des deux côtés de la larve à la moitié postérieure. Afin de réduire poursuite du mouvement de la cuticule par des muscles de la paroi du corps, ajouter plus de colle sur les flancs de l&#39;animal. La larve est maintenant fixé dans cette position. La lamelle peut être placé dans une petite boîte de Petri remplie de AHL ou PBS. Battements du cœur peuvent désormais être enregistrées sans interférence de mouvements paroi du corps. </li></ol> Les résultats représentatifs: Le semi-intactes pour adultes Drosophila coeur battra rythmiquement pendant des heures suivantes de dissection lors maintenu en eau douce, AH oxygénée (voir données supplémentaires, Ocorr, et al., 2007). Un exemple représentatif est montré dans le film 1. Coeurs de 3 ème stade larvaire et les mouches jeunes (1 - 3 semaines après l&#39;éclosion) présentent généralement un rythme cardiaque régulier à des taux entre 1 - 3 Hz. Les mouches plus de 3 semaines sont généralement plus arythmique, néanmoins, ces coeurs sont encore en mesure de battre spontanément pendant des heures dans l&#39;AHL oxygénée. Coeurs perdus en mouches adultes qui sont endommagés à la suite de la procédure de dissection montrent typiquement des régions localisées de la constriction extrêmes qui sont incapables de se détendre. Heartbeat taux inférieure à 1 Hz sont rarement observés chez les mouches plus jeunes que 3 semaines d&#39;âge, par conséquent de telles préparations sont considérés comme étant endommagés et sont éliminés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1425/MOVIE1.avi">Cliquez ici pour télécharger la vidéo 1.</a> - Une volée un semaine anciennes de type sauvage adulte (souche de laboratoire w 1118) montrant le tube cardiaque exposés abdominale (antérieure à la gauche). Remarque réguliers, des contractions rythmiques. Zones opaques dans le coin supérieur droit sont les autres corps gras abdominaux; cellules rondes de chaque côté du cœur sont les cellules péricardiques.

<ol><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 13, 144-166 (1993).</li>
</ol>

Le modèle de drosophile s&#39;est avérée être un puissant outil génétique qui a été utilisée pour traiter une variété de questions scientifiques allant du développement embryologique de l&#39;apprentissage et la mémoire. Récemment cet organisme modèle polyvalent a été utilisé pour étudier la génétique de la fonction cardiaque chez la mouche. Un certain nombre de tentatives pour quantifier la physiologie cardiaque chez les adultes de drosophile sont appuyés sur les observations faites chez des mouches intacte à travers l...

<table><tbody><tr><td>Ciseaux de dissection microchirurgicaux à ressort (courbés)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5611</td><td>Convient pour les coupes grossières (Étape 3)</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection microchirurgicaux à ressort (droits)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont n°55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont n°5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre, 100 µl</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre, fins</td><td>Science Products</td><td>GB100T8P</td><td></td></tr><tr><td>Tire-lames pour pipettes</td><td>Sutter Equipment</td><td>P-97</td><td>Les tire-lames horizontaux et verticaux conviennent tous deux</td></tr><tr><td>Tuyau en plastique</td><td>Tygon</td><td>1/16&amp;#8221; de diamètre intérieur</td><td>pour capillaires de 100&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>Tuyau en plastique</td><td>Tygon</td><td>1/32&amp;#8221; de diamètre intérieur</td><td>pour petits capillaires</td></tr><tr><td>Adhésif tissulaire Histoacryl&amp;#174;</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualiser le cœur battant drosophile</em

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Coeur a récemment émergé comme un système bon modèle pour étudier les mécanismes génétiques, cellulaires et moléculaires sous-jacents de fonction dans les coeurs myogéniques. Une étape clé dans l&#39;examen de la fonction cardiaque chez la mouche est de trouver un moyen d&#39;accéder au cœur d&#39;une manière qui préserve sa fonction myogénique tout en permettant toujours l&#39;organe cœur battant pour être observées et enregistrées. Deux méthodes différentes pour observer et enregistrer le cœur battant à la fois dans la larve et l&#39;adulte<em&gt; Drosophile</em&gt; Sont décrites ici. Notre semi-intactes préparation en utilisant les mouches adultes permet une visualisation claire du cœur abdominale sans ingérence de la cuticule recouvrant pigmentées et corps gras. Pour enregistrer le cœur bat des larves, il est nécessaire d&#39;immobiliser la larve, ce qui minimise les mouvements paroi du corps réduisant ainsi les mouvements du cœur qui ne sont pas associés avec des contractions du myocarde. Nos méthodologies de produire adulte stable et préparations coeur des larves qui peut battre pendant des heures à des taux de Hz 1-3.

Technique requise pour visualiser le cœur battant dans la larve et l&#39;adulte<em&gt; Drosophile</em&gt; Sont présentés. Chaque étape de la vie nécessite une méthodologie différente.

Visualiser le cœur battant Drosophile</em

Le cœur de Drosophila s'est récemment imposé comme un bon système modèle pour examiner les mécanismes génétiques, cellulaires et moléculaires sous-jacents à la fonction de...

Deux techniques seront présentées ici pour la visualisation d'un cœur battant chez Drosophila afin de disséquer le cœur de l'adulte. Premièrement, la tête et le thorax sont retirés par une seule incision le long de la ligne indiquée. Ensuite, les organes génitaux sont enlevés et la cavité abdominale est ouverte à l’aide de pinces ; on retire l’intestin, et dans le cas d’une femelle, les ovaires.Le corps adipeux abdominal des segments abdominaux trois et quatre est soigneusement aspiré afin d'exposer le cœur adulte pour l'immobilisation du cœur larvaire. Une larve unique placée dans une solution tampon est fixée en appliquant d'abord de la colle histologique acrylique autour de la région céphalique de la larve. La larve est délicatement étirée et de la colle supplémentaire est appliquée à l'extrémité postérieure, puis sur les flancs de la paroi corporelle de la larve.Bonjour, je suis GI Fler. Bonjour, je suis Karen er. Nous faisons tous deux partie du programme Développement et Vieillissement à l'Institut Burnham pour la recherche médicale.Aujourd'hui, nous allons vous montrer les procédures que nous avons mises au point pour visualiser le cœur battant de drosophiles Laval et adultes. Nous utilisons ces deux préparations afin de visualiser, examiner et quantifier les paramètres des battements cardiaques chez la drosophile. Avant de commencer, nous préparons d'abord une solution artificielle d'hémolymphe.Cette solution contient l'entrée de saccharose, helo, qui doit être ajoutée à l'hémolymphe artificiel à partir de solutions mères réfrigérées juste avant utilisation. Afin d'éviter toute contamination bactérienne, porter l'hémolymphe artificiel à température ambiante et oxygéner la solution par bullage d'air pendant au moins 15 minutes. Ensuite, tirer plusieurs capillaires fins à l'aide d'un tireur de pipettes standard, qui seront nécessaires pour le retrait des corps gras chez la drosophile.Une fois que tout a été préparé, les mouches adultes doivent être anesthésiées. Cela peut être réalisé par une brève exposition à du fly nap pendant deux à cinq minutes, mais attention à ne pas laisser les mouches plus de cinq minutes dans le fly nap. Une exposition à court terme au froid peut également être utilisée pour anesthésier les mouches, mais le dioxyde de carbone n'est pas recommandé car il exerce des effets plus durables sur la fréquence cardiaque et l'ity.Ensuite, les mouches anesthésiées sont placées en position dorsale vers le bas dans une boîte de Pétri recouverte d'une fine couche de vaseline. La cuticule hydrophobe des ailes et du corps doit adhérer de façon réversible à la vaseline, mais la mouche peut être repositionnée si nécessaire. Une incision initiale est effectuée à l'aide de ciseaux courbes à ressort.Cela se fait en plaçant les lames des ciseaux sous les pattes de la drosophile et en les inclinant vers le bas, en direction de la surface dorsale près du cou. Le cordon nerveux ventral de la tête et les pattes sont retirés d’un seul coup de ciseaux. Le prélèvement est ensuite immergé dans une solution artificielle d’hémolymphe oxygénée à l’aide de ciseaux à ressort.L'extrémité postérieure de l'abdomen, composée des segments abdominaux sept et huit, est retirée d'un seul coup de ciseau. Cela permet d'effectuer des incisions latérales le long des deux bords de l'abdomen et de sectionner la connexion entre l'intestin postérieur et la cuticule abdominale. Insérez les lames des ciseaux dans la petite ouverture située à l'extrémité de l'abdomen et découpez la cuticule latéralement.Cela libère un bord de la cuticule ventrale. Saisir le lambeau avec une pince et effectuer une incision similaire le long du bord latéral opposé de l'abdomen. Le lambeau libéré de la cuticule abdominale ventrale peut désormais être retiré.Les organes abdominaux, notamment l'intestin, peuvent généralement être retirés en un seul bloc à l'aide de pinces de bijoutier et en tirant doucement. L'ablation des organes internes met au jour le tube cardiaque en battement, qui reste attaché à la cuticule dorsale par de petits muscles artériels et est entouré de corps gras. Les capillaires extraits sont insérés dans un tube en plastique d'un seizième de pouce de diamètre, relié à une source de vide.La force d'aspiration est proportionnelle au diamètre de la pointe, donc les pipettes dont les pointes ont un diamètre supérieur à 40 microns ne doivent pas être utilisées une fois le dispositif mis en place. Ce système d'aspiration permet de retirer l'excès de graisse autour du tube cardiaque. Il peut également servir à éliminer les bulles d'air qui s'accumulent autour de la cuticule ainsi que tous les débris.Il faut faire preuve d'une extrême prudence pour éviter de toucher le cœur lui-même, et comme la partie postérieure du cœur est très fragile, cette région doit également être évitée. Le tube cardiaque de drosophile adulte est désormais exposé et devrait battre si nécessaire. La cuticule et le cœur qui y est attaché peuvent être repositionnés en soulevant délicatement la cuticule hors de la vaseline et en l'aplatissant soigneusement à nouveau.Évitez tout contact avec le tissu cardiaque. À ce stade, la solution baignant le prélèvement doit être remplacée par de l'hémolymphe artificielle fraîche. Ce prélèvement doit être laissé équilibrer pendant 20 à 30 minutes avec oxygénation avant toute manipulation.Si la préparation doit être maintenue pendant plus de 60 minutes, elle doit être repréfusée avec un hémolymphe artificiel frais. Cette préparation est désormais prête à être utilisée pour l’enregistrement optique et peut également servir pour l’enregistrement électrophysiologique ou pour des manipulations histologiques. Une technique différente est nécessaire pour visualiser le cœur battant à l’intérieur des larves.Tout d'abord, préparez les lamelles la veille de la procédure. Pour ce faire, utilisez un cure-dent pour transférer environ 50 à 70 microlitres de solution Sard sur une lamelle de 22 sur 22 millimètres. Laissez le Sylgard durcir à 65 degrés Celsius toute la nuit.Ensuite, préparez le tampon de Brody et Bates ; une fois préparé, des aliquotes peuvent être conservées à moins 20 degrés Celsius et décongelées au besoin. Enfin, préparez les outils nécessaires pour appliquer la colle histo acrale. Commencez par tirer plusieurs capillaires fins.Ensuite, reliez une pipette de 1,5 millilitre à une petite tubulure en plastique d'environ un trente-deuxième de pouce de diamètre. En insérant l'extrémité la plus fine dans le tube, placez un capillaire dont l'ouverture large est dirigée vers l'autre extrémité. Une fois le montage effectué, chargez le capillaire avec de la colle histologique en plongeant l'extrémité du capillaire dans une goutte de colle et en exerçant une aspiration douce via l'embout en plastique.Lorsque l'on travaille avec la colle, il est conseillé de disposer d'une deuxième micropipette en verre pour retirer l'excès de colle à l'extrémité de la micropipette de colle. La colle est liquide jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec la solution saline tamponnée, où elle durcit en quelques secondes. Toutefois, elle reste généralement malléable suffisamment longtemps pour être retirée de l'extrémité de la micropipette ou pendant son application sur l'échantillon.Maintenant, pour commencer l'immobilisation des larves, déposez une goutte de colle histo acral près de chaque coin du syl guard. Ajoutez des lamelles et 50 microlitres de tampon B et B sur les gouttes de colle, qui durcissent instantanément ; remplissez l'espace entre les points collés avec du B et B. La colle maintiendra le tampon sur la lame.Prenez trois larves au stade L3 errantes et placez-les sur un morceau de papier absorbant humide posé sur de la glace pendant deux minutes. Cela ralentira leurs mouvements. Ensuite, transférez les larves dans le tampon et positionnez-les avec la face dorsale vers le haut.C'est le côté des larves qui ne possède pas les ceintures identiques. Appliquez rapidement un peu de colle entre la région de la tête et le pare-battant. La colle durcira très vite et empêchera la tête des larves de bouger.À l'aide de pinces, saisissez délicatement l'animal par les reflets postérieurs et étirez-le doucement. Fixez les larves dans cette position en appliquant la colle sur les deux côtés des larves dans la moitié postérieure. Pour réduire davantage les mouvements de l'exosquelette provoqués par les muscles de la paroi corporelle, ajoutez plus de colle sur les flancs de l'animal.La larve est désormais fixée dans cette position. La lame couvre peut être placée dans une petite boîte de Pétri remplie d'hémolymphe artificiel ou de PBS, et les battements cardiaques peuvent maintenant être enregistrés sans interférence des mouvements de la paroi corporelle. Le cœur de drosophile semi-intact battra de manière rythmique pendant plusieurs heures après la dissection, à condition d'être maintenu dans un hémolymphe artificiel frais et oxygéné.Un exemple représentatif est montré ici ainsi que dans le film supplémentaire un, cœurs de larves de troisième stade en étoile présentés ici, et mouches jeunes, âgées d'une à trois semaines après l'éclosion, qui présentent généralement un rythme cardiaque régulier à des fréquences comprises entre un et trois hertz. Les mouches âgées de plus de trois semaines sont généralement plus arythmiques. Néanmoins, ces cœurs sont encore capables de battre spontanément pendant des heures dans un hémolymphe artificiel oxygéné. Les cœurs et les mouches adultes endommagés en raison de la procédure de dissection présentent typiquement des régions localisées de constriction extrême, incapables de se relâcher et souvent incontrôlables. Des fréquences cardiaques inférieures à un hertz sont rarement observées chez les mouches âgées de moins de trois semaines.Par conséquent, ces préparations sont considérées comme endommagées et sont écartées. Nous venons de démontrer comment préparer des cœurs de drosophiles adultes pour l'imagerie optique. N'oubliez pas, lors de la réalisation de la préparation semi-intacte, de ne jamais toucher directement le cœur.Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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