Visualiser le cœur battant Drosophile

Deux techniques seront présentées ici pour la visualisation d’un cœur battant chez la drosophile pour la dissection du cœur adulte. Tout d’abord, la tête et le thorax sont enlevés par une seule coupe le long de la ligne indiquée. Ensuite, les organes génitaux sont enlevés et la cavité abdominale du corps est ouverte à l’aide de pinces dans l’intestin, et dans le cas d’une mouche femelle, les ovaires sont retirés.

Le corps de graisse abdominale dans les segments abdominaux trois et quatre est soigneusement aspiré pour exposer le cœur adulte à l’immobilisation du cœur larvaire. Une seule larve placée dans une solution tampon est fixée en appliquant d’abord de la colle histo acral autour de la région de la tête de la larve. Les larves sont doucement étirées et plus de colle est appliquée à l’extrémité postérieure, puis sur les flancs de la paroi du corps de la larve.

Bonjour, je suis GI Fler. Bonjour, je m’appelle Karen. Nous sommes tous les deux membres du programme Développement et vieillissement de l’Institut Burnham pour la recherche médicale.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer les procédures que nous avons développées pour visualiser le cœur battant de la drosophile de Laval et de la drosophile adulte. Nous utilisons ces deux préparations comme moyen de visualiser, d’examiner et de quantifier les paramètres du rythme cardiaque chez la mouche des fruits. Drosophile. Avant de commencer, nous préparons d’abord une solution d’hémolymphe artificielle.

Cette solution contient de l’entrée de saccharose, helo, qui doit être ajouté à l’hémolymphe artificielle à partir de solutions mères réfrigérées juste avant l’utilisation. Afin d’éviter la contamination bactérienne, amenez l’hémolymphe artificielle à température ambiante et oxygénez la solution par ébullition d’air pendant au moins 15 minutes. Ensuite, tirez plusieurs capillaires fins à l’aide d’un extracteur de pipette standard, qui sera nécessaire pour l’élimination des corps adipeux dans la mouche.

Une fois que tout a été préparé, les mouches adultes doivent être anesthésiées. Cela peut être fait en utilisant une brève exposition pour faire la sieste pendant deux à cinq minutes, mais veillez à ne pas laisser les mouches dans la sieste plus de cinq minutes. Une exposition à court terme au froid peut également être utilisée pour anesthésier les mouches, mais le dioxyde de carbone n’est pas recommandé car il a des effets plus durables sur la fréquence cardiaque et la fréquence.

Ensuite, les mouches anesthésiées sont placées côté dorsal vers le bas dans une boîte de Pétri recouverte d’une fine couche de vaseline. La cuticule hydrophobe dans les ailes et le corps doit coller de manière réversible à la gelée, mais la mouche peut être repositionnée si nécessaire. Une première coupe est effectuée à l’aide d’une paire de ciseaux à ressort incurvés.

Cela se fait en plaçant les lames de ciseaux sous les pattes de la mouche et inclinées vers la surface dorsale près du cou. La tête, le nerf ventral et les pattes sont retirés d’une seule coupure une fois coupés. La préparation est ensuite immergée dans la solution d’hémolymphe artificielle oxygénée à l’aide de ciseaux à ressort.

L’extrémité postérieure de l’abdomen, qui est composée des segments abdominaux sept et huit, est enlevée d’une seule coupure. Cela permet de faire des coupes latérales le long des deux bords de l’abdomen et sert à couper la connexion entre l’intestin postérieur et la cuticule abdominale. Insérez les lames des ciseaux dans la petite ouverture à l’extrémité de l’abdomen et coupez la cuticule latéralement.

Cela libère un bord de la cuticule ventrale. Saisissez le rabat avec une pince et faites une coupe similaire le long du bord latéral opposé de l’abdomen. Le lambeau libéré de la cuticule abdominale ventrale peut maintenant être retiré.

L’intestin et les autres organes abdominaux peuvent généralement être retirés en une seule masse à l’aide d’une pince de bijoutier et d’une légère traction. L’ablation des organes internes révèle le tube cardiaque battant, qui est toujours attaché à la cuticule dorsale par de petits muscles aériens et est entouré de corps adipeux. Les capillaires tirés sont insérés dans du plastique, un tube de 16e pouce étant attaché à une source de vide.

La force d’aspiration est proportionnelle au diamètre de la pointe, de sorte que les pipettes avec des pointes de plus de 40 microns de diamètre ne doivent pas être utilisées une fois installées. Ce système d’aspiration est utilisé pour aspirer l’excès de graisse autour du tube cardiaque. Il peut également être utilisé pour éliminer les bulles d’air qui s’accumulent autour de la cuticule et tous les débris.

Il faut prendre des précautions extrêmes pour éviter de toucher le cœur lui-même, et parce que la partie postérieure du cœur est très fragile, cette région doit être évitée ensemble. Le tube cardiaque de la drosophile adulte est maintenant exposé et doit battre si nécessaire. La cuticule et le cœur attaché peuvent être repositionnés en soulevant doucement la cuticule de la vaseline et en la repoussant soigneusement.

Éviter tout contact avec le tissu cardiaque. À ce stade, la solution baignant la préparation doit être remplacée par de l’hémolymphe artificielle fraîche. Cette préparation doit être laissée s’équilibrer pendant 20 à 30 minutes avec une oxygénation avant toute manipulation.

Si la préparation doit être maintenue pendant plus de 60 minutes, elle doit être reperfusée avec de l’hémolymphe artificielle fraîche. Cette préparation est maintenant prête à être utilisée pour l’enregistrement optique et peut également être utilisée pour l’enregistrement électrophysiologique ou pour des manipulations histologiques. Une technique différente est nécessaire pour visualiser le cœur battant à l’intérieur des larves.

Tout d’abord, préparez les bordereaux de protection la veille de l’intervention. Pour ce faire, à l’aide d’un cure-dent, transférez environ 50 à 70 microlitres de solution de Sard sur une lamelle de 22 x 22 millimètres. Laissez le syl guard durcir à 65 degrés Celsius pendant la nuit.

Ensuite, faites le tampon Brody et Bates une fois préparés, les aliquotes peuvent être stockées à moins 20 degrés Celsius et décongelées au besoin. Enfin, préparez les outils nécessaires à l’application de la colle histo acral. Tout d’abord, tirez sur plusieurs capillaires fins.

Ensuite, connectez une pointe de pipette de 1,5 millilitre à un petit tube en plastique d’environ un 32e pouce de diamètre. En insérant la plus petite extrémité dans le tube, insérez un capillaire avec sa large ouverture à l’autre extrémité. Une fois installé, chargez le capillaire avec de la colle histo en trempant le capillaire dans une goutte de colle et en l’aspirant doucement dans l’embout en plastique.

Lorsque vous travaillez avec la colle, vous devez avoir un deuxième capillaire en verre à portée de main pour enlever l’excès de colle de l’extrémité du capillaire de colle. La colle est liquide jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec une solution saline tamponnée où elle durcira en quelques secondes. Cependant, il reste généralement en plastique suffisamment longtemps pour être retiré de la pointe capillaire de la colle ou lors de son application sur l’échantillon.

Maintenant, pour commencer l’immobilisation des larves, placez une goutte de colle histo acral près de chaque coin de la garde sylique. Les lamelles de recouvrement ajoutent 50 microlitres de tampon B et B aux gouttes de colle, qui durciront instantanément et rempliront l’espace entre les points collés avec b et b. La colle maintiendra le tampon sur la diapositive.

Prenez une larve L trois errante et placez-la sur un morceau de papier de soie humide sur de la glace pendant deux minutes. Cela ralentira son mouvement. Ensuite, transférez les larves dans le tampon et orientez-le avec le côté dorsal vers le haut.

C’est le côté de la larve qui n’a pas les ceintures identiques. Appliquez rapidement un peu de colle entre la région de la tête et le protège-seuil. La colle va durcir très rapidement et empêcher la tête des larves de bouger.

À l’aide d’une pince, saisissez soigneusement l’animal par les étincelles postérieures et étirez-le doucement. Fixez les larves dans cette position en appliquant la colle le long des deux côtés des larves au niveau de la moitié postérieure. Pour réduire le mouvement supplémentaire de la cuticule par les muscles de la paroi corporelle, ajoutez plus de colle sur les flancs de l’animal.

La larve est maintenant fixée dans cette position. La lamelle peut être placée dans une petite boîte de Pétri remplie d’hémolymphe artificielle ou les battements cardiaques PBS peuvent désormais être enregistrés sans interférence des mouvements de la paroi corporelle. Le cœur de la drosophile adulte semi-intact battra rythmiquement pendant des heures après la dissection lorsqu’il est maintenu dans une hémolymphe artificielle fraîche et oxygénée.

Un exemple représentatif est montré ici et dans le film supplémentaire, les cœurs à partir du troisième dans les larves d’étoiles montrées ici, et les jeunes mouches une à trois semaines après elo présentent généralement un rythme cardiaque régulier à des taux compris entre un à trois hertz les mouches de plus de trois semaines sont généralement plus arythmiques. Néanmoins, ces cœurs sont encore capables de battre spontanément pendant des heures dans les cœurs d’hémolymphe artificielle oxygénés et les mouches adultes qui sont endommagées à la suite de la procédure de dissection présentent généralement des régions localisées de constriction extrême qui sont incapables de se détendre et sont souvent incontrôlables. Des taux de battements cardiaques inférieurs à un Hertz sont rarement observés chez les mouches de moins de trois semaines.

Par conséquent, ces préparations sont considérées comme endommagées et sont jetées. Nous venons de montrer comment préparer des cœurs de mouches à fruits de niveau et adultes pour l’imagerie optique. N’oubliez pas que lors de la préparation semi-intacte, ne touchez jamais le cœur lui-même.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.