Name: Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-22T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Apprenez à maintenir des cellules souches embryonnaires humaines indifférenciées en utilisant des techniques de culture, d'alimentation quotidienne et de retrait manuel des zones différenciées. Ce protocole détaillé garantit la viabilité cellulaire.

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1. Entretien: Cultures observant au microscope <ol><li> Enlever une plaque de cellules hES de l&#39;incubateur à 37 ° C et porter à la loupe. </li><li> Observez les colonies à faible puissance, en utilisant un grossissement de 2X ou 5X, pour évaluer la qualité globale de la culture. Notez les points suivants: la couleur du milieu normal, absence de toute contamination visible, taille de la colonie d&#39;ensemble, la qualité et la densité, et d&#39;autres observations. </li><li> Observer les changements de couleur moyenne. En raison du changement de pH et de l&#39;épuisement des nutriments dans le milieu après une nuit d&#39;incubation avec les cellules hES, le milieu va changer à partir d&#39;une teinte rouge à un &quot;paille&quot; de couleur. Si le support semble violet, un changement de pH basique est survenue. Si le milieu apparaît extrêmement jaune, le milieu a acidifié. Milieu très jaune peut être le résultat de colonies extrêmement surpeuplées dans le puits ou la contamination. Le milieu doit être limpide en tout temps. Bien qu&#39;un certain niveau de débris cellulaires dans le milieu est normal, il ne doit jamais apparaître nuageux. Si un niveau élevé de débris cellulaires sont observées, la culture n&#39;est pas sain et peut être contaminée. </li><li> Si les cultures ne nécessitent pas d&#39;entretien ou de repiquage, elles peuvent être prises à l&#39;enceinte de sécurité biologique d&#39;être nourri (voir section 2). </li><li> Si les cultures contiennent plus de 10% environ différencier les colonies, les cellules doivent être «nettoyé» en supprimant manuellement les zones différenciées (voir section 3). </li><li> Si les cultures contiennent de grandes colonies ou dense, ou la couche nourricière MEF est de plus de 12 jours, les cellules doivent être repiquées (voir section 4). </li></ol> 2. Nourrir cellules hES <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, retirez le couvercle de la boîte de culture et d&#39;aspirer le milieu épuisé. Ne laissez pas la pointe de la pipette pour toucher toute partie de la plaque autre que directement à l&#39;intérieur du puits. S&#39;il n&#39;y a aucun souci de la contamination, le changement vers une nouvelle pipette stérile. </li><li> En utilisant une pipette en verre stérile, ajouter la quantité appropriée de milieu de culture hES réchauffé cellules dans chaque puits. Pour les cultures dans une plaque de 6 puits, ajouter 2,5 ml de milieu par puits. </li><li> Retour à la plaque de l&#39;incubateur de rester à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Retrait de différenciation de cultures de cellules hES <ol><li> Transformez 9 pouces en verre Pipettes Pasteur en instruments de ramassage par moulage des conseils sur la flamme d&#39;un brûleur contrôlé alcool. Soyez sûr que la pointe de la pipette est scellé pour empêcher la contamination et arrondi pour éviter de rayer le plastique de la boîte de culture. Stériliser les instruments de ramassage avant de l&#39;utiliser en utilisant la source de lumière UV dans l&#39;enceinte de sécurité biologique ou la cueillette enclos. </li><li> Retirez les zones différenciées. Différenciation se produit souvent dans une partie seulement d&#39;une colonie de cellules hES, généralement le long des bords ou comme des points isolés dans le centre. Si seulement une section d&#39;une colonie est différenciant, seule la zone différenciée doit être retiré. Différenciation peut souvent soulever la plaque dans un &quot;collant&quot; feuille, et il est utile de commencer par séparer les cellules différenciées du reste de la colonie en traçant une ligne à travers la colonie avec la fin de l&#39;outil de cueillette. </li><li> Une fois les pièces de la colonie sont séparées, glissent doucement l&#39;outil de cueillette le long de la plaque pour détacher les cellules indésirables. Prenez soin de ne pas gratter trop de la couche nourricière MEF entre les colonies dans ce processus. </li><li> Lorsque toutes les cellules différenciées sont retirés de la plaque (et flottant dans le milieu), retour à la culture à l&#39;enceinte de sécurité biologique. Aspirer le milieu contenant des cellules différenciées et de remplacer à moyen hES culture fraîche de cellules. </li></ol></ol> 4. Le repiquage cellules hES Incubation enzymatique <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, retirez le couvercle de la boîte de culture de 6 puits et aspirer le milieu épuisé par les puits pour être repiquées. Ne laissez pas la pointe de la pipette pour toucher toute partie de la plaque autre que directement à l&#39;intérieur du puits. </li><li> En utilisant une pipette en verre stérile, ajouter 1 ml de collagénase IV réchauffé à chaque puits pour être repiquées. </li><li> Retour de la plaque à l&#39;étuve à 37 ° C pendant 5 minutes. </li></ol> Grattage et mise en commun des cellules hES <ol start="4"><li> Après incubation des cellules avec de la collagénase, observer les colonies sous le microscope. L&#39;enzyme devrait entraîner un changement subtil mais observables dans les bords colonie. </li><li> Dans le cabinet de sécurité biologique, doucement aspirer l&#39;enzyme de chaque puits et la remplacer par 2,0 mL hES milieu de culture cellulaire. </li><li> Astuce de la plaque de culture légèrement vers vous et prendre la moyenne 2,0 ml dans le premier puits avec une pipette de verre de 5 ml. Tenir la pipette perpendiculairement au fond de la plaque, glissent doucement l&#39;embout de la pipette sur le bien tout en libérant lentement du milieu. </li&gt; <li> Répétez le raclage et le pipetage fois le mouvement jusqu&#39;à ce que toutes 3-4 des colonies ont été retirés du puits. Pipet délicatement pour éviter de casser les colonies dans trop peu de pièces. &nbsp; Lorsque les cellules ont été retirés du premier puits, laisser le contenu dans le puits et commencer à gratter les cellules hors de la suivante aussi. </li><li> Quand tous les puits d&#39;être repiquées ont été grattées, piscine au milieu contenant les morceaux colonie de chaque puits dans un tube de 15 ml stériles conique. </li><li> Rincer les puits gratté en ajoutant 1 mL de milieu de culture cellulaire hES à chaque puits. Recueillir ce rinçage et le transfert au tube conique. </li><li> Pipet les cellules doucement dans le tube pour briser les morceaux colonie jusqu&#39;à la taille désirée. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 200 x g. </li></ol> Placage des cellules de cellules hES <ol start="12"><li> Alors que les cellules hES sont dans la centrifugeuse, préparez une nouvelle plaque de 6 puits d&#39;alimentation du MEF. Étiquette de la plaque avec les informations hES cellule appropriée: lignée cellulaire, le numéro de nouveau passage, et la date de passage. Aspirer le MEF moyennes des puits et ajoutez 1,0 ml de PBS dans chaque puits. Remuer doucement le tampon autour des puits et aspirer le lavage PBS. Ajouter 1,5 mL hES milieu de culture cellulaire dans chaque puits et mis la plaque de côté. </li><li> Lorsque les cellules hES sont finis centrifugation, amener le tube de retour à l&#39;enceinte de sécurité biologique. Aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas perturber le lâche-emballés culot cellulaire. </li><li> Resuspendre les cellules dans le culot avec support suffisant pour 1 ml hES milieu de culture cellulaire par puits d&#39;être plaqué. Lorsque se diviser en six nouveaux puits, resuspendre le culot dans 6 mL de milieu. </li><li> Doucement et uniformément ajouter 1 mL de la suspension cellulaire préparée à chaque puits de la plaque d&#39;alimentation du MEF. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;incubateur à 37 ° C et glissez soigneusement la plaque d&#39;avant en arrière, et latéralement afin de répartir uniformément les cellules à travers le puits. </li><li> Laisser les cellules d&#39;attacher à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Cellules hES indifférenciées sont petits, serrés, et se composent généralement de propagation plus grandes, plus les cellules. La différenciation peut se produire dans une colonie (figure 1A) ou entre les colonies (figure 3B). Morhopologies différents peuvent être vus sous un faible grossissement au microscope. Une bonne morphologie cellulaire, comme on le voit à la figure 2A, contient de petites cellules serrées qui poussent en monocouche. Les cellules doivent avoir propre, bords définis, avec peu ou pas de différenciation. Les cellules montré dans la figure 2B sont prêts pour repiquage, et les cellules montré dans la figure 2C sont surpeuplées. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Différenciation dans les cultures hES. (A) la différenciation d&#39;une colonie (B) la différenciation entre les colonies. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Morphologies vu dans les cultures hES. (A) la morphologie cellulaire bonne (B) des cellules hES qui sont prêts pour repiquage (C) des cellules surpeuplées.

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique</a>. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).</li>
</ol>

Stérilité doit être maintenue en tout temps lorsque vous travaillez avec des cellules hES. Nettoyer et stériliser l&#39;enceinte de sécurité biologique et de tous les équipements avant l&#39;utilisation. Tous les réactifs doivent être filtrés en utilisant un filtre de 0,22 um taille des pores avant l&#39;utilisation. L&#39;utilisation de antiboiotics en culture de cellules hES n&#39;est pas nécessaire et devrait être évitée. Un environnement distinct devrait être mis en place comme une station de cueillette désigné. L&#39;enceinte stérile pour la station peut être une enceinte statique (comme un poste de travail PCR) avec une source de lumière UV, une hotte à flux laminaire, ou une enceinte de sécurité biologique. Un microscope à dissection à l&#39;intérieur du poste de cueillette est nécessaire pour observer les colonies comme des zones différenciées sont supprimés. Le panneau de verre avant d&#39;une enceinte statique ou une enceinte de sécurité biologique doit être modifié pour permettre les oculaires du microscope à s&#39;étendre à travers le panneau, sans compromettre une bonne ventilation et la stérilité. Pour entretenir la santé des cultures de cellules hES, les cellules doivent être passées au moment optimal, généralement tous les 4-7 jours. A cette époque les colonies ont atteint leur taille maximale et peut être commencent à fusionner. Fusionné colonies peuvent augmenter le taux de différenciation dans la culture. Ratios de Split tombent généralement 1:03-1:05, selon le nombre de colonies en plaqué, le taux d&#39;expansion, et les conditions de culture. Overplated colonies (rapport de division trop faible) sera probablement fusionner prématurément et ont besoin d&#39;être repiquées avant qu&#39;ils atteignent leur taille maximale. Cultures sur une couche nourricière MEF qui est plus de 2 semaines doit être passée à nouveau FAE qui soutiendront la croissance et la prolifération indifférenciée. Depuis une différenciation se produit naturellement dans les cultures de cellules hES, une petite quantité est attendue. Différentiation fréquente ou excessive peut se produire si les cultures ne reçoivent pas les soins appropriés. Les cellules doivent être nourris tous les jours, la prolifération entre les passages doivent être évités. Toujours utiliser des réactifs frais. Tous les médias, les FAE et les réactifs doivent être utilisés dans les 14 jours afin d&#39;éviter la croissance de cellules hES indifférenciées. Les nouveaux lots de réactifs, comme le remplacement Knockout Sérum, FBS et FAE, devraient être examinés avant toute utilisation. N&#39;oubliez pas que toute les cellules différenciées pas enlevé avant repiquage sera transférée aux nouvelles cultures. Aussi, essayez de maintenir les cellules à 37 ° C dès que possible. Minimisez le temps passé à l&#39;extérieur des cellules de l&#39;incubateur (par exemple sur la platine du microscope ou dans l&#39;enceinte de sécurité biologique.) Une platine de microscope chauffée peut être très bénéfique si les cellules seront de l&#39;incubateur pour de longues périodes de temps. En observant les cultures de cellules hES sous le microscope, d&#39;abord évaluer la qualité globale et la taille des colonies vue en utilisant une faible puissance (2x ou 5x) objectif. Si les cellules potentiellement différenciés sont observés à faible puissance, de confirmer la morphologie différenciée en utilisant un objectif plus fort grossissement (10x). Immédiatement après avoir enlevé la différenciation, les bords des colonies peuvent apparaître dentelées ou endommagés. Incuber les colonies pendant la nuit dans un milieu frais pour permettre aux cellules indifférenciées qui restent à recouvrer. Sans l&#39;influence de la différenciation dans la culture, ces colonies restantes continueront à proliférer normalement. Si possible, commencer des expériences utilisant faible passage de cellules hES. Caryotype des cellules avant et après toutes les expériences majeures.

<table><tbody><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Pour le milieu de MEF</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS), certifié</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>Inactivé par la chaleur&lt;br/&gt;Pour le milieu de MEF</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Substitut sérique Knockout&amp;#8482;</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Pré-cribler pour assurer le soutien des cellules hES</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>Utiliser à une concentration finale de [4 ng/mL]</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100X)&lt;br/&gt; Utiliser à une concentration finale de [1X]</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Sans Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; ni Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Préparer une solution fraîche à 1 mg/mL dans du D-MEM/F-12</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Type A, porcine</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS), défini</td><td>Hyclone</td><td>SH300.70.01</td><td>Pour le milieu de congélation</td></tr><tr><td>Plaques 6-puits</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140675</td><td>Pour la culture générale</td></tr><tr><td>Plaques 4-puits</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td>Pour le décongélation</td></tr><tr><td>Pipettes en verre de 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27E</td><td>Emballées individuellement</td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>En polypropylène</td></tr><tr><td>Pipettes de Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>Verre, 9&amp;#8221;</td></tr></tbody></table>

culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Souches embryonnaires humaines (hES) les cellules doivent être surveillés et soignés afin de maintenir en bonne santé, cultures indifférenciées. Au minimum, les cultures doivent être nourris chaque jour en effectuant un changement de milieu complet à reconstituer les éléments nutritifs perdus et de maintenir les cultures libres de facteurs de différenciation indésirable. Même si une petite quantité de différenciation est normal et prévu dans les cultures de cellules souches, la culture doit être systématiquement nettoyé en supprimant manuellement, ou «cueillette» des zones différenciées. Identifier et éliminer l&#39;excès de différenciation de cultures de cellules hES sont des techniques essentielles dans le maintien d&#39;une population saine de cellules.

Ce protocole démontre comment maintenir en bonne santé, indifférencié souches embryonnaires humaines (ES) cellules.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Les cellules souches embryonnaires humaines (hES) doivent être surveillées et entretenues afin de maintenir des cultures saines et non différenciées. Au minimum, les cultures doivent être...

Bonjour, je suis Leah Kent de STEM Gent. Aujourd'hui, nous allons vous montrer les procédures pour nourrir, éliminer la différenciation et conditionner les cellules souches embryonnaires humaines. Nous utilisons ces techniques dans notre laboratoire pour la culture et l'entretien courants des cellules HES.Commençons. La qualité globale de la culture est évaluée en observant les colonies à faible grossissement, en utilisant un objectif deux x ou cinq x. En examinant les cellules au microscope, notez les éléments suivants : la couleur normale du milieu, l'absence de toute contamination visible, la taille et la densité des colonies, ainsi que la qualité globale des cellules.Le milieu de culture frais pour cellules souches humaines présente normalement une couleur orange ou paille après une incubation nocturne. Le milieu de culture devient souvent plus jaune en raison d'un changement de pH et de l'épuisement des nutriments dans le milieu. Si le milieu apparaît violet comme illustré dans cet exemple, un décalage basique du pH s'est produit.Si le milieu apparaît très jaune, cela signifie qu'il s'est acidifié, ce qui peut résulter d'une surpopulation extrême des colonies ou d'une contamination. Le milieu doit toujours rester limpide. Si la culture ne contient pas de colonies larges ou denses, les cellules n'ont pas besoin d'être passagées mais doivent être nourries quotidiennement.Transportez les cellules vers la hotte de sécurité biologique. Retirez le couvercle de la boîte de culture et aspirez le milieu usagé. Veillez à ce que la pointe de la pipette ne touche aucune partie de la plaque autre que l'intérieur direct des puits.À l’aide d’une pipette en verre stérile, ajouter la quantité appropriée de milieu de culture chaud pour cellules souches embryonnaires humaines dans chaque puits d’une plaque à six puits, soit 2,5 millilitres de milieu par puits après l’alimentation des cellules, puis replacer la plaque dans l’incubateur. La différenciation se produit fréquemment aux bords des colonies de cellules souches embryonnaires humaines. À l’aide d’un microscope et d’un outil de prélèvement stérile, les cellules différenciées peuvent être délicatement retirées du bord de la colonie, laissant les cellules non différenciées en place.Pour un maintien en culture prolongé, la même procédure peut être utilisée lors de l'élimination des cellules différenciées situées au centre d'une colonie, en laissant un anneau de cellules souches embryonnaires humaines non différenciées autour de la zone de cellules retirées. Si la culture contient plus d'environ 10 % de colonies en cours de différenciation, les cellules doivent être purifiées par élimination manuelle des zones différenciées. Pour ce faire, transformez d'abord des pipettes en verre de neuf pouces en outils de prélèvement.En façonnant les extrémités à l’aide de la flamme contrôlée d’un bec à alcool, veillez à bien sceller l’embout de la pipette afin d’éviter toute contamination et à lui donner une forme arrondie. Pour éviter d’abîmer le plastique de la boîte de culture avant d’utiliser les outils de prélèvement, stérilisez-les au moyen de la source de lumière UV dans l’enceinte de sécurité biologique pendant 15 à 20 minutes. Pour éliminer les cellules différenciées, commencez par les séparer du reste de la colonie en traçant une ligne à travers la colonie avec l’extrémité de l’outil de prélèvement.Une fois les morceaux de la colonie séparés, faites glisser délicatement l'outil de prélèvement sur la boîte pour détacher les cellules indésirables. Veillez à ne pas racler trop de la couche d'alimentation méthylique située entre les colonies au cours de cette étape. Lorsque toutes les cellules différenciées ont été retirées de la boîte et flottent dans le milieu, transférez la culture dans l'enceinte de sécurité biologique.Aspirez le milieu contenant les cellules différenciées et remplacez-le par du nouveau milieu de culture pour cellules souches embryonnaires humaines. Milieu destiné au passage. Cellules ES humaines.Les colonies sont délicatement prélevées à la surface de la boîte de culture à l’aide d’une pipette serologique, après une courte incubation enzymatique, lorsque toutes les puits doivent être repiqués. Les fragments de colonies sont recueillis dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugés afin d’obtenir un culot cellulaire lâche. Le surnageant est ensuite éliminé et le culot cellulaire est resuspendu dans un volume approprié pour obtenir des cellules de taille adéquate.Agglomérer à l’aide d’une pipette dans un milieu ESL humain frais. Après avoir rincé une nouvelle plaque de culture contenant une couche de cellules nourricières MEF fraîchement irradiée, les cellules souches embryonnaires humaines sont réparties uniformément dans les puits de la nouvelle plaque et laissées s’attacher toute la nuit. Si la culture contient des colonies grandes ou denses, ou si la couche de cellules nourricières MEF a plus de 12 jours, les cellules doivent être repiquées dans une hotte de sécurité biologique stérile.Retirer le couvercle de la boîte de culture à six puits et aspirer le milieu usé des puits à repiquer. À l’aide d’une pipette en verre stérile, ajouter un millilitre de collagénase quatre préchauffée dans chaque puits à repiquer. Remettre la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Après cinq minutes, observer les colonies au microscope. L'enzyme devrait provoquer un changement subtil mais observable au niveau des bords des colonies. Celles-ci deviennent plus définies et un léger halo peut apparaître autour d'elles.Dans la hotte de sécurité biologique, aspirez délicatement l'enzyme de chaque puits et remplacez-la par deux millilitres de milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines. Inclinez légèrement la plaque de culture vers vous et prélevez les deux millilitres de milieu. Dans le premier puits, à l’aide d’une pipette en verre de cinq millilitres, tenez la pipette perpendiculairement au fond de la plaque et faites glisser délicatement la pointe de la pipette à travers le puits.Tout en relâchant lentement le milieu. Répétez ce mouvement de raclage et de pipetage trois à quatre fois jusqu'à ce que toutes les colonies aient été retirées du puits. Une fois que les cellules ont été retirées du premier puits, laissez le contenu dans le puits et commencez à racler les cellules du puits suivant.Lorsque toutes les puits à repiquer ont été raclés, rassemblez le milieu contenant les fragments de colonies provenant de chaque puits dans un tube conique stérile de 15 millilitres et pipetez délicatement pour éviter de briser les colonies en morceaux trop petits. Rincez légèrement les puits raclés en ajoutant un millilitre de milieu de culture ESL humain à chacun.Recueillez soigneusement ce rinçage et transférez-le dans le tube conique. Agitez doucement le tube pour fragmenter les morceaux de colonies à la taille souhaitée. Centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 200 G pendant que les cellules souches embryonnaires humaines sont centrifugées. Préparez une nouvelle plaque de culture à six puits avec des fibroblastes nourriciers inactivés par le méthylcéllulose.Étiquetez la plaque avec les informations appropriées sur la lignée cellulaire de cellules souches embryonnaires humaines, le nouveau numéro de passage et la date du passage. Aspirez le milieu de méthanol des puits et ajoutez un millilitre de PVS dans chacun. Faites doucement tourner le tampon dans les puits, puis aspirez le lavage au PBS.Ajoutez 1,5 millilitre de milieu de culture d'ESL humaines dans chaque puits et mettez la plaque de côté. Une fois les cellules ES humaines centrifugées, ramenez le tube dans la cabine de sécurité biologique.Aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire peu compact. Resuspendez les cellules du culot dans un volume suffisant de milieu pour une culture humaine ESL d'un millilitre par nouveau puits à ensemencer.Par exemple, lors d'un fractionnement en six nouveaux puits, après resuspension, suspendre le culot dans six millilitres de milieu. Prélever délicatement les colonies à l'aide d'une pipette afin de fragmenter les morceaux à la taille appropriée et de disperser uniformément les fragments de colonies. Ajouter un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits préparé de la plaque de cellules nourricières MEF.Placer la plaque dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et faire glisser délicatement la plaque de l'avant vers l'arrière, puis latéralement, afin de répartir uniformément les cellules dans tout le puits. Laisser les cellules s'attacher à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit. Les cellules ES humaines différenciées peuvent présenter une variété de morphologies, mais consistent généralement en des cellules plus grandes et plus étalées.La différenciation peut survenir au sein d'une colonie ou entre des colonies. Ce sont les différentes morphologies des cultures de cellules souches humaines que l'on peut observer en faible grossissement au microscope. Une bonne morphologie des cellules et des colonies se présente ainsi.Les cellules sont très petites, étroitement compactées et se développent en une monocouche. Les colonies doivent présenter des bords nets et bien définis, avec peu ou pas de différenciation. Pour maintenir des cultures saines de cellules souches embryonnaires humaines, les cellules doivent être repiquées au moment optimal.Les colonies prêtes à être passagées ont presque atteint leur taille maximale, mais n'ont pas encore commencé à se fusionner ou à se différencier. N'attendez pas que les colonies soient en surcroissance pour les repiquer. Nous venons de vous montrer comment maintenir des cultures saines de cellules HES en suivant ces procédures.Veillez à maintenir une bonne technique stérile et conservez toujours une sauvegarde. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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