Dosage pour Pathogen-Associated Molecular Motif (PAMP)-Triggered Immunité (PTI) chez les plantes

Bonjour, je suis Suma TI du laboratoire de Greg Martin à l'Institut de recherche sur les plantes Voice Thompson. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour un test fondé sur la mort cellulaire afin d'évaluer l'immunité induite par les molécules de pathogènes associées aux micro-organismes, ou PAMP-triggered immunity (PTI). Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'implication d'un gène dans la PTI.

Commençons donc. Commencez la procédure en cultivant des Nicotiana ANA jusqu'à ce qu'elles aient environ sept semaines. Quatre à cinq jours avant le début.

Le test d'immunité induite par les molécules associées aux pathogènes ou assay PTI. Élaguez les plantes pour éliminer toutes les branches axillaires et les fleurs. Essayez d'enlever les branches axillaires peu après leur apparition afin de faciliter la gestion des plantes.

Après avoir préparé les plantes, passez à la culture des bactéries. Cette procédure utilise des bactéries non pathogènes afin d'induire l'immunité des plantes avant une seconde inoculation avec des bactéries de défi ; démarrez la croissance de toutes les bactéries utilisées dans le test. En même temps, utilisez des stocks glycérolés congelés des bactéries pseudomonas pour chaque souche bactérienne de pseudomonas.

Étaler une petite quantité de bactéries au centre d'une plaque KBM contenant l'antibiotique approprié et incuber la plaque à 30 degrés Celsius pendant environ 18 à 24 heures. Pour l'agrobactérie, utiliser une plaque fraîche préparée au préalable afin de démarrer une culture liquide dans deux millilitres de lb. Faire croître toute la nuit à 30 degrés Celsius sous agitation le jour suivant.

Ajouter de 150 à 200 microlitres de milieu KBM liquide sur les plaques contenant les bactéries pseudomonas. Étaler les bactéries sur toute la surface de la plaque à l’aide d’un greter stérile.

Remettre les boîtes au four pendant encore 20 à 24 heures. Quatre agrobactéries. Commencer une culture secondaire dans environ cinq à 10 millilitres de LB contenant 20 micromoles d'acétone.

Faire croître la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius sous agitation. Après avoir préparé les bactéries, procéder à la préparation des plantes pour le test le jour précédant la réalisation du test d'immunité innée (PTI). Après la préparation des bactéries, transférer les plantes dans une pièce à 22 à 24 degrés Celsius avec une humidité relative d'environ 35 à 40 % et une lumière constante.

Ensuite, utilisez un marqueur noir épais pour tracer des cercles sur les feuilles. Choisissez des feuilles bien développées et évitez les feuilles âgées ou celles qui sont dures ou épaisses au toucher. Évitez de marquer les parties inférieures de la feuille.

Les cercles ont un diamètre d'au moins 1,5 centimètre, et deux à quatre cercles peuvent être marqués par feuille. Les cercles doivent être bien espacés et, de préférence, ne pas traverser une grosse veine. Commencez le test PTI en récoltant les bactéries utilisées pour l'induction de la PTI.

L'espèce de pseudomonas utilisée aurait dû former une pelouse bactérienne indiquant une bonne croissance. Récoltez-les à partir de la boîte en grattant avec un bâtonnet en bois stérile et long, puis resuspendez-les dans environ 20 à 25 millilitres de solution de chlorure de magnésium à 10 millimolaire pour la centrifugation de l'agrobacterium.

La culture permet de collecter les cellules et de les resuspendre dans environ 20 à 25 millilitres de chlorure de magnésium 10 millimolaire plus 10 millimolaire de MES, pH 5,6. Répéter la centrifugation, puis resuspendre à nouveau dans environ 20 à 25 millilitres de la solution de chlorure de magnésium plus MES. À présent, les bactéries inductrices de Pseudomonas et d'Agrobacterium sont resuspendues.

Mesurez la densité optique des trois cultures à une longueur d'onde de 600 nanomètres. Ajustez les ODS en diluant les cellules avec du chlorure de magnésium pour les pseudomonas et du MES additionné de chlorure de magnésium pour les agrobacterium. Les valeurs finales d'OD requises sont indiquées dans le protocole écrit accompagnant.

Un volume total de 25 millilitres de culture bactérienne suffit pour ensemencer environ 40 à 50 points. Commencez maintenant le test en infiltrant les inducteurs de la réponse PTI dans les cercles préalablement marqués sur les feuilles à l’aide d’une seringue de un millilitre sans aiguille. Notez l’ordre dans lequel les plantes ont été infiltrées ainsi que l’heure exacte à laquelle l’infiltration a commencé, après l’induction.

Procédez à l'inoculation de défi plusieurs heures après l'inoculation inductrice. Récoltez les souches bactériennes nécessaires pour l'inoculation de défi comme indiqué précédemment pour les souches de pseudomonas inductrices. Mesurez à nouveau la DO et ajustez la concentration des cultures conformément au protocole GR accompagnant.

Commencez l'inoculation de défi sept heures après l'infiltration de l'inducteur. Utilisez les combinaisons inducteur-défi suivantes. Choisissez un point sur la périphérie du premier cercle d'inoculation comme centre du second cercle d'inoculation.

Réalisez l'infiltration de challenge dans le même ordre de plantes que celui de l'induction. S'il y a plusieurs points sur une feuille, veillez à ce que les infiltrations ne se chevauchent pas. Enfin, étalez par dilutions sériées toutes les cultures utilisées dans le test sur des géloses KBM ou LB contenant les antibiotiques appropriés.

Deux jours après l'inoculation de défi, on peut commencer à évaluer la réponse d'immunité innée (PTI). Deux jours après les inoculations d'induction et de défi, rechercher l'apparition d'une mort cellulaire due à l'immunité induite par les effecteurs (ETI) dans les zones ayant reçu une infiltration avec PST DC 3000. La présence de mort cellulaire dans la zone de recouvrement des infiltrations indique une rupture de la PTI et doit être notée comme un phénotype positif. Quatre à cinq jours après les inoculations d'induction et de défi, rechercher l'apparition d'une mort cellulaire due à la maladie dans les zones ayant reçu une infiltration avec la souche mutante DC 3000 hopQ1 ou PS back high again. Observer une rupture de la PTI, indiquée par une mort cellulaire due à la maladie dans la zone de recouvrement des infiltrations. Continuer d'observer les plantes jusqu'à ce que celles qui ne présentent pas de déficience en PTI commencent à montrer une mort cellulaire dans la zone de recouvrement des infiltrations.

Les plantes dans lesquelles FLS2 est inhibé présentent une réponse immunitaire innée (PTI) altérée deux jours après inoculation avec le mélange PFDC. Une mort cellulaire est observée dans la zone de chevauchement, indiquant une perte de contrôle de la PTI. Les plantes témoins non inhibées pour aucun gène ont également été inoculées avec le mélange PFDC et examinées deux jours après la réalisation du test ; la mort cellulaire induite par le défi est visible à l'extérieur, mais pas à l'intérieur, de la zone de chevauchement, en raison d'une réponse PTI normale.

Nous venons de vous montrer comment réaliser un test fondé sur la mort cellulaire pour l'immunité induite par les PAMP ou IIP, tout en effectuant cette procédure. Il est important de garder à l'esprit de maintenir les plantes dans les conditions environnementales que nous recommandons. Des niveaux d'humidité plus élevés nuiraient aux plantes et accéléreraient le déroulement du test.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.