Dosage pour Pathogen-Associated Molecular Motif (PAMP)-Triggered Immunité (PTI) chez les plantes

Bonjour, je suis Suma TI du laboratoire de Greg Martin à l’Institut Voice Thompson pour la recherche sur les plantes. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour un test basé sur la mort cellulaire pour l’immunité déclenchée par la PAM ou PTI. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour rechercher l’implication d’un gène dans le PTI.

Alors commençons. Commencez la procédure en cultivant Nicotiana ANA jusqu’à ce qu’ils aient environ sept semaines. Quatre à cinq jours avant de commencer.

Le test d’immunité déclenchée PAM ou PTI. Taillez les plantes pour enlever toutes les branches axillaires et les fleurs. Essayez d’enlever les branches axillaires peu de temps après leur émergence pour rendre les plantes plus faciles à gérer.

Après la préparation des plantes, procédez à la croissance des bactéries. Cette procédure utilise des bactéries non pathogènes pour l’induction de l’immunité des plantes avant une deuxième inoculation avec des bactéries de provocation, initier la croissance de toutes les bactéries utilisées dans l’essai. Dans le même temps, utilisez des tiges de glycérol congelées de la bactérie Pseudomonas pour chaque tige bactérienne Pseudomonas.

Étalez une petite quantité de bactéries au centre d’une plaque KBM contenant l’antibiotique approprié et incubez la plaque à 30 degrés Celsius pendant environ 18 à 24 heures. Pour l’agrobactérie, utilisez une assiette fraîche préalablement préparée pour commencer une culture liquide dans deux millilitres de lb. Cultivez pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec secousses le lendemain.

Ajoutez 150 à 200 microlitres de KBM liquide dans les plaques de la bactérie pseudomonas. Répartissez les bactéries sur toute l’assiette. À l’aide d’un greter stérile.

Remettez les plaques dans l’incubateur pendant encore 20 à 24 heures. Quatre agrobactéries. Commencer une culture secondaire dans environ cinq à 10 millilitres de LB contenant 20 micromolaires d’acétone.

Cultivez la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius en secouant. Après avoir préparé les bactéries, préparez les plantes pour l’essai la veille de l’essai PTI. Après avoir préparé les bactéries, déplacez les plantes dans une pièce de 22 à 24 degrés Celsius avec environ 35 à 40 % d’humidité relative et une lumière constante.

Ensuite, utilisez un marqueur noir épais pour marquer des cercles sur les feuilles. Choisissez des feuilles bien déployées et évitez les feuilles plus anciennes ou les feuilles dures ou épaisses au toucher. Évitez de marquer les parties inférieures de la feuille.

Les cercles ont un diamètre d’au moins 1,5 centimètre et deux à quatre cercles peuvent être marqués par feuille. Les cercles doivent être bien espacés et de préférence ne pas croiser une grosse veine. Commencer le test PTI en récoltant les bactéries utilisées dans l’induction du PTI.

Les espèces de pseudomonas utilisées doivent avoir formé une pelouse bactérienne indiquant une bonne croissance. Récoltez-les de l’assiette en les grattant avec un long bâtonnet en bois stérile et remettez-les en suspension dans environ 20 à 25 millilitres de 10 millimolaires. Solution de chlorure de magnésium pour centrifugeuse d’agrobacterium.

La culture pour recueillir les cellules et les résanimer est suspendue dans environ 20 à 25 millilitres de chlorure de magnésium de 10 millimolaires plus 10 millimolaires. MES pH 5,6, répétez la centrifugation et à nouveau, suspendez dans environ 20 à 25 millilitres de la solution de chlorure de magnésium et de MES. Maintenant que les bactéries pseudomonas et agrobacterium inductrices sont remises en suspension.

Mesurez la densité optique des trois cultures à une longueur d’onde de 600 nanomètres. Ajustez l’ODS en diluant les cellules avec du chlorure de magnésium pour les pseudomonas et du MES plus du chlorure de magnésium pour l’agrobactérie. Les valeurs finales de DO requises se trouvent dans le protocole écrit qui l’accompagne.

Un volume total de 25 millilitres de culture bactérienne est suffisant pour inoculer environ 40 à 50 taches. Commencez maintenant le test en infiltrant les inducteurs PTI dans les cercles pré-marqués sur les feuilles à l’aide d’une seringue d’un millilitre sans aiguille. Notez l’ordre dans lequel les plantes ont été infiltrées et l’heure exacte à laquelle l’infiltration a commencé après l’induction.

Procéder à l’inoculation de provocation plusieurs heures après l’inoculation d’induction. Récoltez les souches bactériennes nécessaires à l’inoculation de provocation, comme il a été démontré précédemment pour les souches de pseudomonas inductrices. Encore une fois, mesurez la DO et ajustez la concentration des cultures selon le protocole GR qui l’accompagne.

Commencer l’inoculation de provocation sept heures après l’infiltration de l’inducteur. Utilisez les combinaisons suivantes d’inducteurs challengers. Choisissez un point à la périphérie du premier cercle d’inoculation comme centre du deuxième cercle d’inoculation.

Réaliser le challenge infiltration dans le même ordre des plantes que celui de l’induction. S’il y a plusieurs taches sur une feuille, assurez-vous que les infiltrations ne se chevauchent pas. Enfin, dilution en série sur plaque de toutes les cultures utilisées dans le dosage sur des plaques KBM ou LB contenant les antibiotiques appropriés.

Deux jours après l’inoculation de provocation, on peut commencer à évaluer la réponse PTI deux jours après l’induction et les inoculations de provocation : rechercher l’apparition de la mort cellulaire due à l’immunité déclenchée par l’effecteur ou ETI dans les endroits qui ont été défiés avec PST DC 3000 La mort cellulaire à l’intérieur de la zone de chevauchement de l’infiltration indique une rupture de PTI et doit être notée comme un phénotype positif quatre à cinq jours après l’induction et la provocation les inoculations recherchent l’apparition d’une mort cellulaire due à la maladie dans les endroits qui ont été défiés avec le mutant Q1 du saut DC 3000 ou le PS à nouveau élevé. Recherchez une rupture du PTI qui est indiquée par la mort cellulaire due à la maladie dans la zone d’infiltration qui se chevauche. Continuez à observer les plantes jusqu’à ce que celles qui ne sont pas compromises pour le PTI commencent à montrer la mort cellulaire dans la zone d’infiltration qui se chevauche.

Les plantes réduites au silence pour la FLS deux sont compromises pour l’ITFL deux jours après l’inoculation avec la combinaison PFDC. La mort cellulaire est observée dans la zone de chevauchement, indiquant la dégradation des plantes témoins du PTI qui n’ont été réduites au silence pour aucun gène. Ils ont également été inoculés avec la combinaison PFDC et examinés deux jours après la réalisation de l’essai, la mort cellulaire en raison du défi est observée à l’extérieur, mais pas à l’intérieur de la zone de chevauchement en raison d’une réponse PTI normale.

Nous venons de vous montrer comment effectuer un test basé sur la mort cellulaire pour l’immunité déclenchée par le pantalon ou PTI tout en effectuant cette procédure. Il est important de ne pas oublier de conserver les plantes dans les conditions environnementales que nous recommandons. Des niveaux d’humidité plus élevés affecteraient négativement les plantes et accéléreraient le test.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.