Name: Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Découvrez une méthode de phosphoprotéomique quantitative utilisant la cryolyse, la chromatographie HILIC et l'enrichissement IMAC pour analyser les peptides phosphorylés chez Saccharomyces cerevisiae. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de signalisation cellulaire par spectrométrie de masse.

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Nous tenons à remercier le Dr Rich Rogers pour l&#39;assistance technique avec des analyses par spectrométrie de masse et des discussions utiles, et les Drs. Rob-Moritz, Jeff Ranish, et Hamid Mirzai des discussions utiles. Ce travail a été financé par le NIH Centres d&#39;excellence.

La croissance cellulaire et les médias <ol><li> Une seule colonie de cellules BY4742Δarg4Δlys1 nuit dans 100 ml rich media à une DO 600 de 1,0, puis de graines en deux cultures de 1 litre d&#39;un milieu de levure minime (0,17% de base azotée de levure sans sulfate d&#39;ammonium ou des acides aminés, le sulfate d&#39;ammonium 0,5%) contenant un gamme complète d&#39;acides aminés, complétées par des 20mg / L de l&#39;arginine isotopiquement normale ou lourde (13 C 6 15 N 4; Isotec) et la lysine (13 C 6 15 N 2; Isotec). </li><li> Les cellules ont été cultivées pendant 18 heures, à une DO 600 de 1,8. Il est essentiel que les cellules passent par au moins 9 générations pour atteindre la pleine intégration des isotopes marqués. L&#39;échantillon a été la lumière granulés, lavé à l&#39;eau stérile, réensemencées dans un milieu contenant oléate (isotopiquement normale arginine et la lysine, oléate de 0,2% (Sigma Chemicals) et 0,5% de Tween 40 (Sigma Chemicals)) et stimulés pour un autre 85 minutes. Cela donne une isotopiquement léger, à l&#39;égard de l&#39;arginine et la lysine, oléate-stimulé l&#39;échantillon et un échantillon de référence isotopiquement lourds glucose-cultivés. </li></ol> Lyse cellulaire, l&#39;isolement et le fractionnement des peptides <ol start="3"><li> Peser bouteille de centrifugeuse. Récolte des échantillons par centrifugation pendant 3 minutes. Retirez le support et aspirer le liquide en excès. Peser granulés et bouteille (typiquement de rendement entre 1-2 grammes) de geler éclair, puis dans l&#39;azote liquide. Ajouter un volume équivalent au poids de granules de &quot;rectification&quot; tampon pour les boulettes congelées dans l&#39;azote liquide (tampon phosphate salin (PBS, Gibco), 10% de glycérol, inhibiteurs de protéase (comprimés SigmaFAST inhibiteur de protéase, Sigma) et d&#39;inhibiteurs de phosphatase HALT (Thermo Scientific )). </li><li> Gel du récipient de broyage dans l&#39;azote liquide. Attendez que l&#39;azote liquide cesse d&#39;ébullition. Transfert du culot à la cuve de broyage, avec roulements à billes gelées. </li><li> Grind à 600 rpm avec un cycle de 1 min 20 sec avec une inversion de sens pendant 3 minutes. Recongeler le récipient de broyage dans l&#39;azote liquide. Répétez 4 fois plus de 15 minutes au total du temps de broyage. </li><li> Recueillir les grindate congelé dans une glace 50ml Falcon placer le tube sec. Conserver à -80 ° C jusqu&#39;au moment de servir. </li><li> Faire une solution de 10ml de l&#39;urée 8M, bicarbonate d&#39;ammonium 0,1 M, Tris 0,1 M pH 8,6. Ajouter 3 volumes du tampon urée pour 1 volume de grindate congelés (pour 3mls exemple du tampon urée ajoutée à une boulette de 1 gramme par 1 ml de tampon PBS). Immédiatement soniquer le mélange avec un sonicateur pointe de la sonde (2 - 10 impulsions seconde). Garder la pointe près du fond du tube pour empêcher le moussage de la solution. Le grindate doit immédiatement passer en solution. </li><li> Effacer le lysat par centrifugation pendant 5 minutes à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant dans des tubes frais. </li><li> Faites une partie aliquote de 0,5 M tris [2-carboxyéthyl] phosphine (PTCE). Ajouter à l&#39;échantillon à 1:100 pour une concentration 5 mM finale. Incuber à 37 ° C pendant 1 h. </li><li> Alkylation des cystéines réduites. Laisser refroidir à température ambiante. Faites une partie aliquote de iodoacétamide 1M. Gardez à l&#39;obscurité (nous envelopper le tube dans une feuille). Ajouter à une concentration finale de 20 mM. Incuber dans l&#39;obscurité pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Étancher la iodoacétamide 20 mM avec la TNT à partir d&#39;un stock de 1M à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Quantifier les protéines avec un standard ou Bradford dosage BCA (non décrit). Prélevez un échantillon pour analyse par SDS-PAGE ci-dessous. </li><li> Pour valider l&#39;incorporation des isotopes lourds, utilisez de 100 ul de lysat réduite et alkylée. Diluer 1:4 avec dH 2 O, soniquer et ajouter la trypsine à 50:1 protéines à la trypsine. Digest pour un minimum de 4 heures, l&#39;échantillon sec dans une speed vac puis dessaler avec une colonne C18 Ultramicrospin (Le groupe Nest). <ol><li> Hydratez colonne avec 100 ul d&#39;acétonitrile </li><li> S&#39;équilibrer avec 200 ul 0,1% de TFA. </li><li> Resuspendre échantillon sec dans 200 ul 0,1% de TFA. Charge sur la colonne. Centrifuger à 200 xg ~ ou la vitesse minimale requise pour circuler à travers la colonne. </li><li> Laver deux fois avec 200 ul 0,1% de TFA. </li><li> Éluer avec deux fois avec 50 ul acétonitrile 60%, 0,1% de TFA. </li><li> L&#39;échantillon sec dans un speed vac. </li><li> Remettre en suspension dans l&#39;échantillon 20 ul d&#39;acide formique 0,1%. Run 2 pl sur un spectromètre de masse. Vérifiez l&#39;incorporation de l&#39;arginine et la lysine isotopiquement lourds par un décalage de 10 et 8 Dalton dans le respectifs m / z spectres. L&#39;incorporation de chaque acide aminé doit être entre 96 - 98%. </li></ol></li><li> Mélanger des quantités équivalentes (mg de protéines) des échantillons isotopiquement lourds et légers. </li><li> Diluer l&#39;échantillon avec du méthanol 01:04 20%. </li><li> Ajouter la trypsine à 1:200. Incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Vérifiez que la digestion est allé à son terme par SDS-PAGE. Run 2 et 4 pl de l&#39;échantillon prédigestion et 8 uneD 16 ul du produit de digestion après la trypsine. Visualisez par coloration au bleu de Coomassie que la digestion est terminée. Si elle n&#39;est pas complète, soniquer l&#39;échantillon avec une pointe de sonde brièvement sonicateur et digérer à nouveau à la trypsine. </li><li> Sécher l&#39;échantillon dans une vitesse ACC. Lorsque ajouter à sec 200 pl de filtrer dH 2 O et le vortex jusqu&#39;à la pastille passe en solution. L&#39;échantillon à sec dans une vitesse ACC. Resuspendre nouveau avec dH 2 O. Sec de l&#39;échantillon à nouveau. </li><li> Resuspendre le culot dans l&#39;acide trifluoroacétique à 0,1% (TFA; Sigma). Vérifier que le pH se situe autour de 3 utilisant des bandes de pH. Si nécessaire acidifier avec TFA 10%. </li><li> Pellet hors tout précipité. </li><li> Dessaler les échantillons sur un Waters Sep-Pak Vac 500 mg colonne C18. Ne surchargez pas ces colonnes. Le montant maximum est de 5 mg, mais il est préférable de charger un peu moins. Divisez l&#39;échantillon entre plusieurs colonnes si nécessaire. <ol><li> Hydrater la colonne avec 5 ml d&#39;acétonitrile 100%. Centrifuger à 200 xg ~ ou la vitesse minimale requise pour circuler à travers la colonne. </li><li> Equilibrer la colonne avec du TFA 0,1% 5ml. Charge de l&#39;échantillon. Recueillir des flux et charger à nouveau. </li><li> Laver avec 5 ml de TFA 0,1%. Répéter. </li><li> Éluer avec 2ml 60% d&#39;acétonitrile, 0,1% de TFA. </li><li> L&#39;échantillon à sec dans une vitesse ACC. </li></ol></li></ol> Fractionnement de peptides et d&#39;isolement de phosphopeptides <ol><li> Les peptides sont fractionnés sur une colonne HILIC. Nous utilisons un TOSOH TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm colonne analytique avec une colonne de garde. Prenez votre temps avec cette étape, exécutez la colonne pendant 2 heures à 90% A deux puis exécutez gradients vierge avant le chargement de votre échantillon. La charge maximale sur une colonne de cette taille est estimée à environ XX, nous typiquement ne chargez pas plus de 5 mg par courir. </li><li> Solvant A - 98% ACN/0.1% de TFA Solvant B - 2% ACN/0.1% de TFA Charge à 90% A plus de 20 &#39;, 90% A 85% A plus de 5&#39;, 85% A 60% A plus de 40 &#39;, 60% de A à 0% A plus de 5&#39;, 0% A% à 90 A sur 5 &#39;. </li><li> Le débit est 1mL/min et les fractions ont été collectées à intervalles minutes 2 à partir de 85% A% à 60 Un gradient. </li><li> Combinez les fractions de réduire le nombre de fractions à 10. Fractions accrue donnera probablement une plus grande couverture de l&#39;phosphoprotéome. </li></ol> Enrichissement de phosphopeptides <ol><li> Phosphopeptides sont enrichis en utilisant PHOS-Select gel d&#39;affinité de fer. Nous aliquote de notre résine IMAC pour éviter le gel répétées décongélation. Faire 50 ml d&#39;acide acétique 250 mM, solution à 30% la charge d&#39;ACN. Amener le pH à 2,7 avec HCl. Resuspendre granulés dans 500 pl de solution de charge. Vérifiez le pH, ajuster avec HCl ou NaOH nécessaire. </li><li> Prélavage 200 pi de perles IMAC dans une colonne appropriée. Nous utilisons des colonnes de centrifugation Molbiotec. Ajouter 15 ul d&#39;une suspension de 50% (gel de charger la solution) à chaque fraction, et incuber les échantillons pendant 30 &#39;avec la fin de rotation plus fin. Gardez le flux pour l&#39;analyse. </li><li> Lavez échantillons 3 fois avec une solution de chargement et une fois avec 500 pl filtrée dH 2 O. </li><li> Peptides Eluer avec 2 - 3 min avec 400 ul de 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) de mémoire tampon. Transférer dans un flacon en verre. </li><li> Acidifier à pH 3 avec 5 ul d&#39;acide formique à 100%, gel rapide dans l&#39;azote liquide, et l&#39;échantillon séché dans une vitesse ACC. </li><li> Phosphopeptides Remettre en suspension dans 200 pl de TFA à 0,1% et C18 nettoyage comme décrit ci-dessus. Sécher les échantillons élues dans un speed vac. </li><li> Resuspendre peptides dans 20 ul d&#39;acide formique 0,1%. Utilisez 2 ul par l&#39;analyse du spectromètre de masse ou au besoin. </li></ol> Remarques Pour une grande partie de ce protocole vous allez travailler «en aveugle». La lyse cellulaire peut être surveillé par Western Blot et des dosages de Bradford ou BCA, et la digestion par la trypsine peut également être facilement évaluée. La colonne HILIC sera donné une trace semblable à celui-ci, ou comme on le voit par d&#39;autres [1, 2] en fonction de la machine de chromatographie liquide qui est utilisé. Les échantillons sont contrôlés par spectrométrie de masse; tester vos échantillons sur des machines peu coûteuses telles que LCQs ou MALDIs avant d&#39;aller à l&#39;analyse coût élevé sur une haute précision de la masse, une machine à haute résolution. Enfin, si vous assèchement d&#39;un échantillon avec de l&#39;acide qu&#39;il contient, utiliser du verre.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

Cette méthode donnera un enrichissement de phosphopeptides qui peuvent être analysées quantitativement. Un certain nombre de paramètres peuvent être modifiés dans ce protocole, mais l&#39;aspect le plus important à retenir est de préserver votre phosphorylation. Préparation des cellules pour la quantification peut être réalisé dans un certain nombre de manières différentes, par exemple, si vous ne pouvez pas l&#39;étiquette de vos cellules in vivo, des étiquettes telles que l&#39;ICAT [3] ou ITRAC [4] peut être...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginine-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lysine-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 7,4 (10X) liquide</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés SigmaFAST d'inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d'inhibiteurs de phosphatase Pierce Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Moulin à billes Retsch PM100</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Jarre de broyage en acier inoxydable Retsch 125 ml</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Ultramicrospin C18</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>Colonne analytique TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>Il s'agit de la colonne chromatographique HILIC.</td></tr><tr><td>Colonne de garde 4,6 mm de diamètre interne x 1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>Nous recommandons cette colonne de garde pour prolonger la durée de vie de votre colonne HILIC.</td></tr><tr><td>Gel d'affinité au fer PHOS-Select&amp;#8482;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>Il s'agit de la résine IMAC. Fractionner et conserver.</td></tr></tbody></table>

phosphoprotéomique quantitatives en acide gras stimulé saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Ce protocole décrit la croissance et la stimulation, avec l&#39;oléate d&#39;acides gras, des isotopes lourds et légers cellules de S. cerevisiae. Les cellules sont broyées à l&#39;aide d&#39;une procédure cryolysis dans un moulin broyeur à boulets et les grindate résultant mis en solution par solubilisation d&#39;urée. Cette procédure permet la lyse des cellules dans un état métaboliquement inactives, la préservation de la phosphorylation et la prévention de la réorientation de l&#39;phosphoprotéome lors de la lyse cellulaire. Après la réduction, l&#39;alkylation, digestion par la trypsine des protéines, les échantillons sont dessalés sur des colonnes C18 et la complexité de l&#39;échantillon réduit de fractionnement par chromatographie d&#39;interaction hydrophile (HILIC). Colonnes HILIC retiennent préférentiellement des molécules hydrophiles qui est bien adapté pour phosphoprotéomique. Peptides phosphorylés ont tendance à éluer plus tard dans le profil chromatographique que leurs homologues non phosphorylées. Après fractionnement, phosphopeptides sont enrichis en utilisant la chromatographie en métal immobilisé, qui repose sur la charge basé sur des affinités pour l&#39;enrichissement phosphopeptide. A la fin de cette procédure, les échantillons sont prêtes à être analysées quantitativement par spectrométrie de masse.

Description d&#39;une procédure de phosphorylation quantitative à l&#39;aide cryolysis, solubilziation urée, de fractionnement et l&#39;enrichissement HILIC IMAC de peptides phosphorylés.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

Ce protocole décrit la croissance et la stimulation, avec l'acide gras oléate, de cellules de S. cerevisiae lourdes et légères isotopiquement. Les cellules sont broyées...

La phosphorylation est un mécanisme clé de signalisation cellulaire régulant des processus allant de la localisation des protéines à la transcription de l'ADN, et l'étude du phosphoprotéome seul par spectrométrie de masse constitue une avancée passionnante dans l'analyse de la signalisation et de la protéomique. Des cellules marquées de manière différentielle sont lysées dans un broyeur à billes, puis réduites, alkylées, mélangées et digérées. Les peptides obtenus sont fractionnés par chromatographie d'interaction hydrophile, et les peptides phosphorylés sont enrichis à partir des fractions par enrichissement iMac.Les fractions enrichies en peptides phospho sont ensuite identifiées par spectrométrie de masse. Mme. Hi, je suis Ramsey Celine du groupe E à l'Institut de biologie de la persistance. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour l'extraction de peptides marqués métaboliquement et phosphorylés.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier de manière quantitative le protéome de la fosse. Commençons donc. Cette procédure commence par la culture de cellules de levure isotopiquement légères et lourdes.Commencez par ensemencer 100 millilitres de milieu riche avec une colonie unique de cellules de levure. Faites croître cette culture toute la nuit jusqu'à une DO 600 de 1,0. Utilisez-la ensuite pour ensemencer deux cultures d'un litre de milieu minimal contenant un complément complet d'acides aminés et enrichi avec 20 milligrammes par litre d'isotopes.Des cultures de 1 litre contenant de l'arginine et de la lysine normales ou marquées par des isotopes lourds sont cultivées pendant 18 heures jusqu'à une DO 600 de 1,8. Il est essentiel que les cellules traversent au moins neuf générations afin d'assurer une incorporation complète des isotopes marqués. Une fois que les cellules ont intégré complètement les isotopes marqués, centrifuger les cellules cultivées dans le milieu contenant de l'arginine et de la lysine normales du point de vue isotopique.Pour obtenir un culot cellulaire, laver le culot avec de l'eau stérile et le resuspendre dans un milieu contenant de l'oléate et de l'arginine et de la lysine isotopiquement normales, puis stimuler pendant 85 minutes. Cela donne un échantillon stimulé à l'oléate isotopiquement léger. L'autre culture, cultivée dans un milieu contenant de l'arginine et de la lysine isotopiquement lourdes, n'est pas stimulée avec de l'oléate et servira d'échantillon de référence cultivé au glucose isotopiquement lourd.Pour recueillir un litre, la culture est répartie entre quatre tubes de centrifugation de 250 millilitres. Après la centrifugation, les cellules sont regroupées dans un seul tube en éliminant ou en conservant 100 millilitres du milieu, puis en resuspendant les cellules et en les transférant dans le tube suivant. À la fin, un gros culot est recueilli dans un seul tube et centrifugé pendant trois minutes à 4 000 tr/min.Après avoir retiré le milieu, le poids du flacon de centrifugation et du culot est comparé à celui d'un flacon vide. Après la centrifugation, retirez le milieu et aspirez le liquide excédentaire des flacons, pesez les culots ; un rendement typique se situe entre un et deux grammes. Ensuite, congeler rapidement les culots dans l'azote liquide, puis ajouter un tampon de broyage contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase aux culots.Le volume de tampon de broyage ajouté doit être équivalent au poids du culot. Congelez le récipient de broyage dans l'azote liquide. Lorsque l'azote liquide a cessé de bouillir.Utilisez une spatule pour détacher des morceaux du culot et transférez-les dans le récipient de broyage contenant des billes d'acier congelées. Broyez les culots à 600 tr/min selon un cycle de 1 minute et 22 secondes avec inversion du sens de rotation, pendant trois minutes. Recongelez le récipient de broyage dans l'azote liquide.Répétez le broyage quatre fois supplémentaires pour une durée totale de 15 minutes. Temps de broyage une fois le broyage terminé pour les deux échantillons. Recueillez la poudre congelée dans des tubes Falcon de 50 millilitres et conservez-la congelée soit dans de l'azote liquide, soit dans de la glace sèche.Conserver la date de broyage à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. L'isolement et la fractionnation des peptides commencent par leur alkylation. La première étape consiste à solubiliser votre échantillon dans la solution d'urée.Placer chaque date de broyage en solution en ajoutant trois volumes de tampon urée à un volume de date de broyage congelée. Par exemple, trois millilitres de tampon RIA sont ajoutés à un culot d'un gramme. Avec un millilitre de tampon PBS.Soniquez immédiatement une sonde. Utilisez la pointe de la sonde. Maintenez la pointe près du fond du tube afin d'éviter la formation d'écume dans la solution.La date de broyage doit immédiatement être mise en solution. Clarifier les lysats par centrifugation à 6 000 tr/min pendant cinq minutes. À quatre degrés Celsius, transférer le SUPINATE dans des tubes frais.Pour commencer la réaction de réduction, ajoutez à chaque échantillon du tris fraîchement préparé 0,5 molaire, du LITAL PHOSPHINE à deux groupes carboxyles ou du TCEP selon un dilution de un à 100. Pour obtenir une concentration finale de TCEP de cinq millimolaire, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation à 37 degrés Celsius, laissez les échantillons refroidir à la température ambiante.Ensuite, ajouter de l'iodoacétamide fraîchement préparé à une concentration finale de 20 millimolaire et incuber à l'abri de la lumière pendant une heure à température ambiante. Après l'incubation d'une heure, arrêter la réaction avec du DTT à 20 millimolaire. Laisser une heure à température ambiante.Les lysats réduits et alkylés sont désormais prêts pour la digestion par la trypsine. À ce stade, des échantillons des lysats peuvent être utilisés pour la quantification des protéines, une analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), afin de vérifier la lyse cellulaire, ainsi que pour une analyse par spectrométrie de masse afin de valider l'incorporation des isotopes lourds. Pour commencer la digestion par la trypsine, mélangez des quantités équivalentes des échantillons isotopiquement lourds et légers.Diluez l'échantillon au 1/4 avec du méthanol à 20 % et ajoutez de la trypsine à une dilution de 1/200. Incubez l'échantillon toute la nuit à 37 degrés Celsius le jour suivant. Après avoir vérifié la digestion complète par électrophorèse SDS-PAGE et coloration au Comassie, séchez l'échantillon dans un évaporateur sous vide (speed vac) une fois qu'il est sec.Ajouter 200 microlitres d'eau distillée filtrée et vortexer jusqu'à ce que le culot passe en solution. Sécher l'échantillon dans un évaporateur sous vide et le reprendre à nouveau avec de l'eau distillée. Après séchage de l'échantillon, reprendre une fois de plus le culot dans de l'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 %, et vérifier que le pH est d'environ trois à l'aide de bandelettes pH si nécessaire. Acidifier avec du TFA à 10 % et centrifuger pour éliminer tout précipité.L'échantillon digéré par la trypsine sera maintenant désaliné à l'aide d'une colonne VAC C18 de 500 milligrammes. Pour commencer, hydratez la colonne avec cinq millilitres d'acétonitrile à 100 %, puis centrifugez à environ 200 × g ou à la vitesse minimale nécessaire pour permettre le passage du liquide à travers la colonne. Ensuite, équilibrez la colonne avec cinq millilitres de TFA à 0,1 %, puis chargez l'échantillon.Veillez à ne pas surcharger la colonne et, si nécessaire, divisez l'échantillon entre plusieurs colonnes. Recueillez l'écoulement dans un récipient de déchets et rechargez la colonne si besoin, puis rincez avec cinq millilitres de TFA à 0,1 %. Répétez ce rinçage et élué avec deux millilitres d'acétonitrile à 60 % contenant 0,1 % de TFA. L'EEU doit être recueilli par centrifugation.Séchez l'échantillon dans un évaporateur sous vide et reconstituez l'échantillon sec dans 200 microlitres de solvant B. L'échantillon reconstitué est maintenant prêt pour la fractionnation des peptides. Fractionnez les peptides sur une colonne analytique TSK gel AMIDE 80 équipée d'une colonne de garde. Prenez votre temps lors de cette étape.Faites passer la colonne pendant deux heures à 90 % de solvant A, puis effectuez deux gradients témoins avant de charger votre échantillon. Nous chargeons généralement pas plus de cinq milligrammes par injection sur une colonne de cette taille, en chromatographie liquide moderne ou même moins moderne. Les appareils permettent une injection automatisée des échantillons, la collecte des fractions, la régulation du débit et la préparation automatique des gradients.Ces conditions sont définies au début de l'analyse, comme décrit. Charger avec 90 %A pendant 20 minutes, passer de 90 %A à 85 %A en cinq minutes, de 85 %A à 60 %A en 40 minutes, de 60 %A à 0 %A en cinq minutes, puis de 0 %A à 90 %A en cinq minutes. Régler le débit à un millilitre par minute et collecter les fractions par intervalles de deux minutes.En partant du gradient de 85 %A à 60 %A, combiner les fractions afin de réduire leur nombre à 10 ; des fractions augmentées permettront probablement d'obtenir une couverture plus étendue du phosphoprotéome. Les peptides phospho sont enrichis par chromatographie sur métal immobilisé. Nous utilisons le gel d'affinité phos select au fer comme résine iMac.Commencez par suspendre les pastilles dans 500 microlitres de solution de chargement. Ensuite, ajoutez 15 microlitres d'une suspension à 50 % à chaque fraction et incubez les échantillons pendant 30 minutes avec une rotation bout à bout. Conservez l'écoulement pour l'analyse.Lavez l'échantillon trois fois avec la solution de chargement, puis une fois avec 500 microlitres d'eau distillée filtrée ; après les lavages, éluerez les peptides pendant deux à trois minutes à l'aide de 400 microlitres de tampon phosphate de sodium à 50 millimolaire. Transférez les peptides élués dans un flacon en verre. Ajoutez cinq microlitres d'acide formique à 100 % aux peptides afin de les acidifier à un pH de trois, resuspendez les peptides phospho dans 200 microlitres de TFA à 0,1 % et désalez à nouveau à l'aide d'une colonne C18 comme décrit précédemment, puis séchez les échantillons obtenus dans un évaporateur sous vide rapide.Finalement, resuspendre les peptides phospho dans 20 microlitres d’acide formique à 0,1 %. Les échantillons sont désormais prêts à être analysés quantitativement par spectrométrie de masse. Un tracé chromatographique issu de la fractionnation des peptides cellulaires totaux par chromatographie H-I-L-I-C est présenté ici.On peut observer sur ce tracé que, bien que les peptides phospho soient présents tout au long du profil d'élution, la majeure partie des résidus phosphorylés est retenue jusqu'à la fin du profil d'élution. Nous venons de vous montrer comment broyer les cellules, digérer les protéines, fractionner les peptides et enrichir les peptides phospho par chromatographie d'affinité avec des métaux immobilisés. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à préserver la phosphorylation et de vérifier le pH des solutions de Beer.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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