Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l'épuisement Complément

L'épuisement du complément est une méthode rapide, efficace et peu coûteuse pour purifier des populations de cellules immunitaires. L'épuisement du complément commence lorsque des anticorps monoclonaux IgM ou IgG sont ajoutés à une population cellulaire, ciblant un type cellulaire spécifique. Dans cet exemple, nous allons cibler les cellules T pour épuisement.

Le système du complément est ensuite ajouté, déclenchant une cascade protéolytique qui entraîne la mort des cellules T. La population cellulaire est ensuite lavée par centrifugation et filtrée pour éliminer les cellules mortes et les débris. Cette méthode d'épuisement par le complément permet généralement d'éliminer de 95 à 100 % de la population cellulaire ciblée.

Bonjour, je suis Bonnie Dittle. Je suis chercheuse à l'Institut de recherche sur le sang du Blood Center of Wisconsin, situé à Milwaukee. Aujourd'hui, je vais vous montrer la technique d'épuisement par complément, une méthode rapide et peu coûteuse pour éliminer des populations cellulaires spécifiques.

Nous utilisons cette technique dans mon laboratoire pour enrichir fortement des populations de cellules immunitaires, que nous utilisons ensuite dans divers tests biologiques, notamment ceux impliquant l'activation cellulaire et l'analyse de l'expression protéique. Commençons donc. Avant de commencer l'expérience, préparez des aliquotes de 0,5 ou un millilitre de complément de lapin et conservez-les dans un congélateur à moins 20 ou moins 80 degrés.

Veillez à titrer le complément à une dilution optimale comprise entre 1/10 et 1/20. Une excellente source commerciale de complément que nous utilisons régulièrement provient de Pereze Biologicals. Pour cette procédure, les anticorps monoclonaux de souris et les anticorps monoclonaux anti-lapin sont généralement efficaces pour l'activation du complément, mais tous les anticorps ne conviennent pas. Les anticorps de type IgM sont généralement les plus efficaces pour la lyse cellulaire induite par le complément.

Les anticorps IgG sont les deuxièmes plus efficaces et sont généralement utilisés car la plupart des anticorps monoclonaux sont des IgG. Il convient de titrer chaque anticorps pour une utilisation optimale à une densité cellulaire de 10&sup7; cellules par millilitre, valeur déterminée empiriquement. La plupart des anticorps sont utilisés à des concentrations comprises entre 0,1 et 10 microgrammes par millilitre. Pour l'épuisement des lymphocytes T spléniques, nous utilisons un anticorps monoclonal spécifique de TH1.

Pour commencer l'épuisement du complément, diluez les cellules dans un milieu de culture contenant 5 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, de manière à obtenir une population cellulaire initiale de deux fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre. Par exemple, cinq fois 10 à la puissance sept cellules doivent être diluées dans 2,5 millilitres de milieu. Ce volume de cellules représente la moitié du volume final, et donc une concentration deux fois supérieure à celle utilisée lors de l'épuisement, qui sera de une fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre.

À ce stade, conserver jusqu'à un fois dix puissance six cellules afin que l'appauvrissement puisse être quantifié à la fin de l'expérience. En outre, décongeler la quantité nécessaire de complément à température ambiante. Nous avons constaté qu'une dilution de un à quinze est appropriée lorsqu'on utilise du complément de lapin Pereze Biologicals pour cinq fois dix puissance sept cellules ; 1,5 millilitre d'Eloqua congelé est suffisant.

Ajoutez maintenant la quantité appropriée d'anticorps à la suspension cellulaire et mélangez. Afin de stériliser le complément, utilisez un filtre à embout de seringue à faible liaison aux protéines. Remplissez la seringue avec un à deux millilitres de milieu.

Avant d'ajouter le complément pour cinq fois 10 à la puissance sept cellules, nous aurons besoin de 340 millilitres de complément pour une dilution de un à 15. Ensuite, filtrez directement le complément dans le tube contenant les cellules et l'anticorps. Ajustez maintenant le volume final dans le tube afin que les cellules soient à une concentration de un fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre.

Ensuite, laissez les cellules incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Pensez à mélanger les cellules toutes les 15 minutes par retournement doux. Après l'incubation, centrifugez les cellules à une vitesse qui n'affectera pas leur viabilité.

Ensuite, revenir sous la hotte et éliminer le surnageant. Puis, laver les cellules deux fois avec 10 millilitres de milieu. Remarquez comment les débris cellulaires s'accumulent, certains adhérant aux parois des tubes en polystyrène.

Après le dernier lavage, filtrer les cellules à l’aide d’un filtre stérile en nylon de 70 microns. Enfin, vérifier la pureté des cellules en comparant la population cellulaire d’intérêt avant et après l’écoulement de l’épuisement.

La cytométrie et l'immunohistochimie sont les méthodes privilégiées pour déterminer la pureté cellulaire avant l'expérimentation. Lorsqu'on utilise un anticorps monoclonal très efficace pour activer le complément, le premier cycle d'épuisement par complément élimine plus de 95 % des cellules. À titre d'exemple, en utilisant la cytométrie en flux pour mesurer le pourcentage de lymphocytes T alpha bêta dans une préparation de cellules péritonéales de souris, nous avons constaté qu'elles contenaient 32,2 % de lymphocytes T alpha bêta après épuisement par complément avec l'anticorps anti-CD51, qui est exprimé par tous les lymphocytes T, mais pas par les autres leucocytes. La population de cellules TCR bêta a été réduite de 95 %, atteignant une concentration finale de 1,56 %.

J'ai juste montré une méthode rapide et efficace pour épuiser des populations cellulaires spécifiques en utilisant des anticorps spécifiques de l'antigène dans un épuisement par complément. Lorsque vous effectuez cette procédure, n'oubliez pas de tester chaque anticorps pour son efficacité et de titrer votre complément dans une expérience pilote avant de commencer. C'est tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.