L'isolement des cellules de souris cavité péritonéale
28 janvier 2010
La cavité péritonéale chez les mammifères contient différentes populations de cellules immunitaires crucial pour les réponses immunitaires innées. Une méthode d'isolation efficace est nécessaire pour les analyses biochimiques et fonctionnelles de ces cellules. Ici nous fournissons une méthode globale pour l'isolement des cellules cavité péritonéale chez la souris.
L'isolement des cellules de la cavité péritonéale commence par la mise en place d'une souris euthanasiée sur le dos. La peau externe du péritoine est incisée puis délicatement rabattue pour exposer la peau interne. Du PBS contenant 3 % de FBS est injecté dans la cavité péritonéale, et le péritoine est massé doucement. Le liquide contenant les cellules péritonéales est recueilli et placé dans un tube de 15 millilitres sur de la glace.
Les cellules sont lavées une fois et comptées sur un hémocytomètre. Bonjour, je suis Oji du laboratoire du Dr. Bon à l'Institut de recherche sur le sang du Blood Center du Wisconsin. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'isoler des cellules de la cavité péritonéale d'une souris.
Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour obtenir des cellules destinées à divers dosages phénotypiques, biochimiques et immunologiques. Principalement, nous nous intéressons aux populations de lymphocytes B péritonéaux. Commençons donc.
Avant de commencer l'isolement des cellules immunitaires de la cavité péritonéale, préparez tous les matériaux nécessaires. Rassemblez d'abord un seau à glace, une seringue de cinq millilitres munie d'une aiguille de 27 gauge, une seringue de cinq millilitres munie d'une aiguille de 25 gauge, un bloc de polystyrène, ainsi que des épingles pour fixer la souris. Prévoyez également un plateau pour maintenir le bloc de fixation, des ciseaux, des pinces et des tubes de collecte avant la dissection.
Pré-refroidir le PBS contenant 3 % de sérum de veau fœtal. Garder ceux-ci ainsi que les tubes de collecte sur de la glace pendant toute l'expérience après l'administration de l'anesthésique et de l'euthanasie appropriée, vaporiser la souris avec de l'éthanol à 70 % et la fixer sur le dos sur un bloc de polystyrène ou un tapis de dissection. À l’aide de pinces et de ciseaux, inciser la peau externe du péritoine.
Replier doucement la peau pour exposer la peau interne qui tapisse la cavité péritonéale. En prenant soin de ne pas percer d'organes, insérer lentement une aiguille de 27 gauge dans le péritoine. Injecter cinq millilitres de PBS glacé dans la cavité péritonéale.
Massez maintenant doucement le péritoine pour favoriser le détachement des cellules de la paroi péritonéale et leur chute dans la solution de PBS. Ensuite, fixez une seringue de cinq millilitres équipée d'une aiguille de calibre 25, côté biseau vers le haut, à ce niveau, puis insérez l'aiguille dans le péritoine. Recueillez autant de liquide que possible afin d'augmenter le rendement cellulaire.
Pendant cette opération, déplacez doucement la pointe afin d'éviter que le tissu adipeux ou d'autres organes n'obstruent l'aiguille. Retirez l'aiguille et videz la suspension cellulaire dans des tubes de collecte en polypropylène. Recueillez le liquide restant dans la cavité en pratiquant une incision dans la peau interne du péritoine.
Utilisez une pince pour maintenir la peau écartée tout en utilisant une pipette postérieure en plastique pour recueillir tout liquide restant. Enfin, centrifugez la suspension cellulaire pendant huit minutes à 1500 tr/min, jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans cinq millilitres de PBS. Comptage des cellules au cytomètre sanguin.
L'utilisation de l'exclusion au bleu de tripan permettra la détermination du nombre de cellules. Typiquement, cinq à dix millions de cellules de la cavité péritonéale peuvent être isolées à partir d'une souris non manipulée. 50 à 60 % de la population cellulaire totale seront des cellules B.
Environ 40 % seront des macrophages et des sites granulaires, et cinq à 10 % seront des cellules T. Nous venons de vous montrer comment isoler les cellules de la cavité péritonéale d'une souris. Lors de l'utilisation de cette procédure, il est important de limiter la quantité de sang dans la population de cellules de la cavité péritonéale en euthanasiant soigneusement les souris et en évitant de percer des organes situés dans la cavité péritonéale.
Veillez à éliminer tout échantillon contaminé par le sang. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.
Aperçu
Cet article présente une méthode détaillée pour isoler les cellules de la cavité péritonéale chez la souris, ce qui est essentiel pour l'étude des réponses immunitaires. La procédure est conçue pour préserver l'intégrité des populations cellulaires en vue d'analyses ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Biochimie
Contexte
- La cavité péritonéale abrite divers types de cellules immunitaires.
- Ces cellules jouent un rôle essentiel dans les réponses immunitaires innées.
- Les méthodes d'isolement sont cruciales pour les études fonctionnelles et biochimiques.
- La compréhension de ces cellules peut contribuer à la recherche immunologique.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode fiable pour isoler les cellules de la cavité péritonéale.
- Faciliter l'étude des populations de cellules immunitaires chez la souris.
- Améliorer la précision des dosages immunologiques ultérieurs.
Méthodes utilisées
- Éuthanasier la souris et préparer la dissection.
- Injecter du PBS contenant 3 % de FBS dans la cavité péritonéale.
- Recueillir le liquide contenant les cellules péritonéales.
- Centrifuger et dénombrer les cellules isolées.
Résultats principaux
- Isolation réussie de 5 à 10 millions de cellules de la cavité péritonéale.
- Identification du fait que 50 à 60 % des cellules sont des lymphocytes B.
- Environ 40 % sont des macrophages et des granulocytes.
- 5 à 10 % des cellules sont des lymphocytes T.
Conclusions
- La méthode est efficace pour isoler les cellules immunitaires de la cavité péritonéale.
- Une euthanasie et une dissection soigneuses sont cruciales pour éviter toute contamination par le sang.
- Cette procédure peut être appliquée à diverses études immunologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'isolement des cellules immunitaires de la cavité péritonéale permet une validation précoce des cibles en donnant accès à des sous-populations de cellules B et de macrophages définies sur le plan phénotypique. Cette approche contribue à réduire les risques mécanistiques dans les filières de découverte en fournissant des cellules primaires reproductibles pour des tests fonctionnels. La méthode renforce la fiabilité prédictive de l'identification des candidats-médicaments grâce à la récupération standardisée de populations immunitaires pertinentes pour le criblage de molécules immunomodulatrices.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des sous-populations de cellules B1a et B1b pour tester des hypothèses thérapeutiques dans des modèles d'auto-immunité et d'infection.
- Valeur scientifique : Fournit des macrophages résidents naïfs pour clarifier les voies impliquées dans les études de réponse immunitaire innée.
- Valeur opérationnelle : Facilite la détection biologique des risques en assurant une isolation reproductible des populations de cellules immunitaires pour le criblage de l'engagement des cibles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour l'analyse phénotypique par cytométrie en flux et par tests biochimiques.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à un rendement cellulaire contrôlé (5 à 10 millions de cellules par souris).
- Valeur opérationnelle : Permet une évaluation fiable des composés par une récupération quantitative des lymphocytes B (50–60 %), des macrophages (40 %) et des lymphocytes T (5–10 %).
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la modélisation de systèmes pertinents pour les maladies en isolant les cellules B1 autoréactives et les sous-populations régulatrices productrices d'IL-10.
- Valeur opérationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs translationnels par l'isolement des cellules B1 sécrétant des IgM naturelles.
- Valeur opérationnelle : Assure une continuité préclinique en fournissant des cellules immunitaires primaires pour des analyses mécanistiques complémentaires dans les modèles de maladies.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce en fournissant des cellules immunitaires primaires pour la validation de cibles, le développement de tests et des études mécanistiques précliniques.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques par l'isolement de sous-populations définies de lymphocytes B et de macrophages.
- Triage : Assure la préparation des tests grâce à l'isolement standardisé et à la récupération de populations immunitaires viables.
- Analyse : Permet la comparaison quantitative de sous-populations cellulaires à l'aide du comptage au compteur hématimétrique et de méthodes d'exclusion de viabilité.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte à la validation préclinique par l'isolement de cellules B1 associées à l'immunité naturelle et à la régulation.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité réutilisable d'approvisionnement en cellules immunitaires pour divers programmes de découverte en immunologie et en oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à l'accès à des sous-ensembles immunitaires caractérisés sur le plan phénotypique.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité grâce à un rendement cellulaire et une répartition des sous-ensembles définis.
- Valeur stratégique : Décisions améliorées d'aller/arrêt en réduisant l'ambiguïté mécanistique lors du criblage d'immunomodulateurs.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque grâce à des entrées fiables de cellules primaires pour les panels de tests fonctionnels.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection murine et en technique aseptique afin de prévenir la perforation des organes et la contamination par le sang.
- Dépend d'instruments tels que des seringues, des aiguilles, une centrifugeuse et un hémocytomètre pour le traitement et le comptage des cellules.
- Exige une standardisation inter-équipes pour la préparation du PBS/FBS et la gestion de la chaîne du froid afin d'assurer la reproductibilité.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application à des modèles de maladies modifiant la cellularité de la cavité péritonéale.
- Est limitée par la nécessité d'une euthanasie et d'une dissection soigneuses afin d'éviter toute contamination sanguine, qui compromettrait l'intégrité de l'échantillon.
