Name: Lisolement des cellules de souris cavité péritonéale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-28T16:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Découvrez l'isolement des cellules de la cavité péritonéale chez la souris pour l'immunologie. Cette méthode permet d'obtenir 5 à 10 millions de cellules comprenant des lymphocytes B, macrophages et granulocytes.

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Ce travail a été soutenu en partie par NIH AI069358 et la Fondation de recherche BloodCenter.

<ol><li> Avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être recueillis et préparés à: <ul><li> Glace </li><li> Seringue de 5 ml avec aiguille 27G </li><li> Seringue de 5 ml avec aiguille 25g </li><li> Styrofoam blocs et des épingles pour le montage de la souris </li><li> Plateau sur lequel le bloc de montage peut être placé </li><li> Ciseaux et pinces </li><li> Tubes de prélèvement </li><li> 70% d&#39;éthanol </li><li> PBS avec 3% sérum de veau foetal (FCS) (pré refroidis et conservés sur glace) </li></ul></li><li> Euthanasier la souris, le vaporiser avec de l&#39;éthanol 70% et le monter sur le bloc de styromousse sur le dos. </li><li> En utilisant une paire de ciseaux et des pinces à couper la peau externe du péritoine et tirez en arrière pour exposer la peau intérieure tapissant la cavité péritonéale. </li><li> Injecter 5 ml de PBS glacé (avec 3% de FCS) dans la cavité péritonéale à l&#39;aide d&#39;une aiguille 27G. Poussez l&#39;aiguille lentement dans le péritoine en faisant attention à ne pas percer tous les organes. </li><li> Après l&#39;injection, masser doucement le péritoine pour déloger les cellules attachées dans la solution PBS. </li><li> Insérer une aiguille de 25 g, biseau vers le haut, attachée à une seringue de 5 ml dans le péritoine et recueillir le liquide tout en déplaçant la pointe de l&#39;aiguille doucement pour éviter le colmatage par le tissu adipeux ou d&#39;autres organes. Recueillir autant de liquide que possible et le dépôt de la suspension cellulaire recueilli dans des tubes conservés sur la glace après avoir retiré l&#39;aiguille de la seringue. En option: 4-6 Répétez l&#39;étape </li><li> Faire une incision dans la peau intérieure du péritoine et tout en maintenant la peau avec une pince utiliser une pipette Pasteur en plastique pour recueillir le liquide restant dans la cavité. </li><li> Si à l&#39;étape 6 ou 7 contamination du sang visible est détectée, alors l&#39;échantillon contaminé doit être jeté. </li><li> Faites tourner la suspension de cellules recueillies à 1500 RPM pendant 8 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans les médias souhaités ou PBS pour le comptage. </li></ol> Protocole alternatif pour obtenir thioglycolate suscité des macrophages: Cette méthode est utilisée pour obtenir un rendement plus élevé des macrophages. <ol><li> Injecter 5 ml de 3% (p / v) Brewer milieu au thioglycolate (7) dans la cavité péritonéale de chaque souris. </li><li> Attendre pendant 3-5 jours, et passez à l&#39;étape 1 ci-dessus pour la collecte des cellules. </li></ol> Comparativement à l&#39;approche nonelicited, environ 10 fois plus de macrophages peuvent être collectées. Le seul souci est que les macrophages obtenus par cette procédure diffèrent dans certaines de leurs propriétés physiologiques. Les résultats représentatifs: De une souris non manipulée, 5-10 millions de cellules cavité péritonéale peut être obtenue avec un protocole de bonne isolation. Parmi toutes les cellules vivantes, 50-60% sont des cellules B, macrophages ~ 30% et 5-10% sont des cellules T (figure 1). <img src="/files/ftp_upload/1488/1488fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Phénotype des cellules isolées de la cavité péritonéale. Isolement de cellules Après la cavité péritonéale, ils ont été colorés avec anti-souris-FITC TCRβ, B220-PE-rouge Texas, CD11b-Pacifique bleu, CD23-PE-Cy7 et CD5-APC. Parcelles de flux représentant cytométrie montrent des pourcentages de cellules B et T (a), les macrophages (b), B1 et B2 cellules (c) et les cellules B1a et B1b (d).

<ol><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2008).</li>
<li>Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+natural+immunoglobulin+M+in+immediate+defense+against+systemic+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection.</a> J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).</li>
<li>Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+by+anti-phosphocholine+antibodies+as+a+mechanism+of+protection+in+experimental+pneumococcal+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia.</a> J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).</li>
<li>Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B1+B+lymphocytes+play+a+critical+role+in+host+protection+against+lymphatic+filarial+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites.</a> J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).</li>
<li>Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+peritoneum+contains+a+large+population+of+Ly-1%2B+%28CD5%29+B+cells+that+recognize+phosphatidyl+choline%3A+relationship+to+cells+that+secrete+hemolytic+antibody+specific+for+autologous+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes.</a> J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).</li>
<li>O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly-1+B+%28B-1%29+cells+are+the+main+source+of+B+cell+derived+interleukin+10%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10.</a> Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).</li>
<li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica%3A+Defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).</li>
<li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+colony-stimulating+factor%2C+CSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).</li>
<li>Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+B-1+and+B-2+cells+in+immune+protection+from+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).</li>
<li>Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+and+B-2+cell-derived+immunoglobulin+M+antibodies+are+nonredundant+components+of+the+protective+response+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).</li>
<li>Berland, R., Wortis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+functions+of+B-1+cells+with+notes+on+the+role+of+CD5%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).</li>
</ol>

Isolement de cellules cavité péritonéale est une technique importante pour l&#39;étude des différentes cellules du système immunitaire, principalement les macrophages et les sous-ensembles spécifiques de cellules B. Bien que ce processus est simple, il ya quelques étapes essentielles impliquées. Présence de contamination du sang dans l&#39;échantillon prélevé doit être évitée afin d&#39;obtenir un pur population cellulaire péritonéale cavité. L&#39;euthanasie par dislocation cervicale doit être effectuée avec soin pour éviter toute contamination du sang dans la cavité péritonéale. Alternativement CO 2 peuvent être utilisés. En outre, pendant les soins procédure appropriée devrait être prise pour éviter la perforation de la vessie ou d&#39;autres organes dans la cavité péritonéale. Récupérer la plupart du liquide injecté est également important pour le rendement cellulaire. Cette procédure est largement utilisée pour étudier la biologie des macrophages, depuis un nombre modéré de résident, les macrophages non stimulés peuvent facilement être obtenus à partir de la cavité péritonéale, contrairement à la tâche laborieuse de différenciation des cellules progénitrices myéloïdes en macrophages matures in vitro, en utilisant le facteur de croissance macrophages (8 , 9). Le rendement des macrophages de la cavité péritonéale peut être améliorée en utilisant la méthode de l&#39;élicitation thioglycolate, bien que l&#39;utilisation thioglycolate pourraient altérer les propriétés physiologiques des macrophages (7). Les cellules B sont une partie importante de notre système immunitaire joue un rôle crucial dans les deux immunité innée et adaptative. Parmi les différentes sous-populations de cellules B, les cellules B1 comprend un sous-ensemble unique de cellules B impliquées dans l&#39;immunité innée, l&#39;auto-immunité et de la régulation immunitaire. Cellules B1 sont principalement situés dans la cavité péritonéale et sont la reconstitution de soi. Ils sont l&#39;un des principaux producteurs d&#39;IgM naturel qui assure la première ligne de protection contre un certain nombre de virus et de bactéries (10-12). Cellules B1 sont aussi une source importante d&#39;IL-10 (6), qui est une cytokine importante impliquée dans la régulation immunitaire. Bien que plusieurs études ont été menées avec les cellules B1, encore il ya place pour une évaluation plus poussée de leurs fonctions contrastées, spécialement leur rôle de régulation. Péritonéale méthode d&#39;isolement cavité cellulaire offre l&#39;opportunité unique d&#39;étudier les fonctions des cellules B1.

<table><tbody><tr><td>Milieu thioglycollate, modifié par Brewer</td><td>BD Biosciences</td><td>211716</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement des cellules de souris cavité péritonéale

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

La cavité péritonéale est une cavité membranaires et remplis de fluide abdominal de mammifères, qui contient le foie, la rate, la plupart du tractus gastro-intestinal et d&#39;autres viscères. Il abrite un certain nombre de cellules immunitaires, y compris les macrophages, les lymphocytes B et les lymphocytes T. La présence d&#39;un nombre élevé de macrophages naïfs dans la cavité péritonéale en fait un site privilégié pour la collecte des naïfs macrophages résidents du tissu (1). La cavité péritonéale est également important pour l&#39;étude des cellules B en raison de la présence d&#39;une cavité péritonéale unique de sous-résident de cellules B ou cellules B1, en plus de cellules B2 conventionnels. Cellules B1 sont subdivisées en cellules B1a et B1b, qui peut être distingué par l&#39;expression de surface de CD11b et CD5. Cellules B1 sont une source importante d&#39;IgM naturels offrant une protection précoce d&#39;une variété de pathogènes (2-4). Ces cellules sont autoréactifs dans la nature (5), mais comment ils sont contrôlés pour éviter l&#39;auto-immunité n&#39;est pas encore parfaitement compris. Au contraire, CD5<sup&gt; +</sup&gt; Cellules B1a possèdent certaines propriétés de régulation en vertu de leur capacité de l&#39;IL-10 produit (6). Par conséquent, les cellules B1 péritonéale cavité sont une population de cellules intéressantes à étudier en raison de leurs fonctions diverses et nombreuses questions sans réponse associés à leur développement et de régulation. L&#39;isolement de la cavité péritonéale des cellules immunitaires résidentes est délicat en raison du manque d&#39;une structure définie à l&#39;intérieur de la cavité péritonéale. Notre protocole se décrivent une procédure pour l&#39;obtention de cellules viables à l&#39;abri de la cavité péritonéale de souris, qui peuvent ensuite être utilisés pour l&#39;analyse phénotypique par cytométrie en flux et pour différents dosages biochimiques et immunologiques.

La cavité péritonéale chez les mammifères contient différentes populations de cellules immunitaires crucial pour les réponses immunitaires innées. Une méthode d&#39;isolation efficace est nécessaire pour les analyses biochimiques et fonctionnelles de ces cellules. Ici nous fournissons une méthode globale pour l&#39;isolement des cellules cavité péritonéale chez la souris.

L&#39;isolement des cellules de souris cavité péritonéale

La cavité péritonéale est une cavité abdominale des mammifères, délimitée par une membrane et remplie de liquide, qui contient le foie, la rate, la majeure partie du tractus gastro-intestinal...

L'isolement des cellules de la cavité péritonéale commence par la mise en place d'une souris euthanasiée sur le dos. La peau externe du péritoine est incisée puis délicatement rabattue pour exposer la peau interne. Du PBS contenant 3 % de FBS est injecté dans la cavité péritonéale, et le péritoine est massé doucement. Le liquide contenant les cellules péritonéales est recueilli et placé dans un tube de 15 millilitres sur de la glace.Les cellules sont lavées une fois et comptées sur un hémocytomètre. Bonjour, je suis Oji du laboratoire du Dr. Bon à l'Institut de recherche sur le sang du Blood Center du Wisconsin. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'isoler des cellules de la cavité péritonéale d'une souris.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour obtenir des cellules destinées à divers dosages phénotypiques, biochimiques et immunologiques. Principalement, nous nous intéressons aux populations de lymphocytes B péritonéaux. Commençons donc.Avant de commencer l'isolement des cellules immunitaires de la cavité péritonéale, préparez tous les matériaux nécessaires. Rassemblez d'abord un seau à glace, une seringue de cinq millilitres munie d'une aiguille de 27 gauge, une seringue de cinq millilitres munie d'une aiguille de 25 gauge, un bloc de polystyrène, ainsi que des épingles pour fixer la souris. Prévoyez également un plateau pour maintenir le bloc de fixation, des ciseaux, des pinces et des tubes de collecte avant la dissection.Pré-refroidir le PBS contenant 3 % de sérum de veau fœtal. Garder ceux-ci ainsi que les tubes de collecte sur de la glace pendant toute l'expérience après l'administration de l'anesthésique et de l'euthanasie appropriée, vaporiser la souris avec de l'éthanol à 70 % et la fixer sur le dos sur un bloc de polystyrène ou un tapis de dissection. À l’aide de pinces et de ciseaux, inciser la peau externe du péritoine.Replier doucement la peau pour exposer la peau interne qui tapisse la cavité péritonéale. En prenant soin de ne pas percer d'organes, insérer lentement une aiguille de 27 gauge dans le péritoine. Injecter cinq millilitres de PBS glacé dans la cavité péritonéale.Massez maintenant doucement le péritoine pour favoriser le détachement des cellules de la paroi péritonéale et leur chute dans la solution de PBS. Ensuite, fixez une seringue de cinq millilitres équipée d'une aiguille de calibre 25, côté biseau vers le haut, à ce niveau, puis insérez l'aiguille dans le péritoine. Recueillez autant de liquide que possible afin d'augmenter le rendement cellulaire.Pendant cette opération, déplacez doucement la pointe afin d'éviter que le tissu adipeux ou d'autres organes n'obstruent l'aiguille. Retirez l'aiguille et videz la suspension cellulaire dans des tubes de collecte en polypropylène. Recueillez le liquide restant dans la cavité en pratiquant une incision dans la peau interne du péritoine.Utilisez une pince pour maintenir la peau écartée tout en utilisant une pipette postérieure en plastique pour recueillir tout liquide restant. Enfin, centrifugez la suspension cellulaire pendant huit minutes à 1500 tr/min, jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans cinq millilitres de PBS. Comptage des cellules au cytomètre sanguin.L'utilisation de l'exclusion au bleu de tripan permettra la détermination du nombre de cellules. Typiquement, cinq à dix millions de cellules de la cavité péritonéale peuvent être isolées à partir d'une souris non manipulée. 50 à 60 % de la population cellulaire totale seront des cellules B.Environ 40 % seront des macrophages et des sites granulaires, et cinq à 10 % seront des cellules T. Nous venons de vous montrer comment isoler les cellules de la cavité péritonéale d'une souris. Lors de l'utilisation de cette procédure, il est important de limiter la quantité de sang dans la population de cellules de la cavité péritonéale en euthanasiant soigneusement les souris et en évitant de percer des organes situés dans la cavité péritonéale.Veillez à éliminer tout échantillon contaminé par le sang. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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L'isolement des cellules de souris cavité péritonéale

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