La production de lentivirus

Cette procédure commence par la transectation de 2 9 3 lymphocytes T avec des vecteurs de lentivirus, de plasmides et d’emballage viral, le surnageant viral est récolté après une période d’incubation d’au moins 48 heures. Le sangot est filtré pour être concentré à l’aide d’une ultracentrifugeuse après ultracentrifugation. La pastille virale est remise en suspension avec du PBS pour obtenir un titre de virus, diluez d’abord le virus concentré dans un milieu complet, puis effectuez une dilution en série pour infecter les cellules avec du lentivirus.

Bonjour, je suis Shein Wong du laboratoire de Michael McManus au Centre du diabète de l’Université de Californie à San Francisco. Je m’appelle Michael McManus. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de production de lentivirus.

Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour fabriquer des lentivirus pour l’interférence ARN. Alors commençons. Pour commencer ce protocole, préparez l’ADN avec lequel transfecter les 2 9 3 lymphocytes T.

Premier réactif de transfection du gène FU six dilué dans un tube de 1,5 millilitre en mélangeant 30 microlitres de Fuji six avec 600 microlitres de milieu exempt de sérum. Veillez à ne pas laisser Fuji toucher le côté du tube lorsque vous le livrez dans la température moyenne de la pièce d’incubation pendant cinq minutes. Ensuite, dans le capuchon du tube, mélangez quatre microgrammes de plasmide lentiviral avec 1,33 microgrammes.

Chaque troisième génération de vecteurs d’emballage viral. Le plasmide lentiviral contient l’ADN. Le virus s’insère dans le génome de chaque cellule infectée, tandis que les vecteurs d’emballage contiennent des gènes pour toutes les autres protéines nécessaires à la fabrication d’un virus de la lentille, fermer le couvercle et mélanger en inversant le tube plusieurs fois.

Incuber l’ADN et le réactif de transfection pendant 15 à 20 minutes à température ambiante. Il est maintenant temps de transfecter 2 9 3 cellules avec l’ADN que vous avez préparé à l’aide de cellules que vous avez plaquées 24 heures à l’avance et qui ont atteint une fluidité de 50 à 70 % dans la cagoule de culture tissulaire, pipetez tout l’ADN préparé sur la plaque 2 9 3 mélangée doucement en inclinant la plaque d’avant en arrière, Remettez les cellules dans l’incubateur et laissez la production virale se poursuivre pendant 48 à 96 heures avant la récolte. Au cours de l’incubation, les cellules 2 9 3 produisent des lentivirus dont les génomes contiennent une copie de l’ARN de votre ADN d’intérêt.

Il est maintenant temps de collecter le virus. Sortez vos cellules de l’incubateur. Ayez à portée de main dans la hotte de culture tissulaire, un filtre pour seringue de 0,4 ou cinq microns, une seringue jetable de 10 millilitres et un tube à centrifuger UltraClear Beckman.

Utilisez la seringue jetable pour retirer le surnageant, qui contient maintenant le virus. Fixez un filtre de seringue de 0,45 micron à l’embout et filtrez le virus dans un tube à centrifuger UltraClear Beckman. Le filtre ne laisse passer que les virus et non les cellules avant de jeter, d’incuber toutes les cellules productrices de virus.

Plaques de culture, seringues et filtres à 10 % d’eau de Javel pendant 45 minutes. Maintenant que vous avez collecté et filtré le virus, il est temps de concentrer d’abord le virus par ultracentrifugation. Utilisez du DMEM sans sérum pour équilibrer tous les tubes contenant des virus à moins de 0,2 gramme les uns des autres.

Ensuite, chargez les tubes de centrifugation équilibrés dans les godets de rotor SW 41 TI ou SW 28. Fermez les godets du rotor et accrochez-les au rotor. Placez ensuite le rotor à l’intérieur de l’ultracentrifugeuse.

Faites tourner le virus pendant environ 90 minutes à quatre degrés Celsius à 25 000 tr/min dans un rotor SW 41 TI ou à 24 000 tr/min dans un rotor SW 28. Après la centrifugation, retournez dans le capot de culture tissulaire et retournez le tube pour verser le SNAT dans un récipient contenant 10 % d’eau de Javel. Utilisez une lingette Kim pour absorber l’excès de liquide autour de la pastille et retournez le tube dans une grille pratique pendant pas plus de cinq minutes jusqu’à ce que vous soyez prêt à remettre la pastille en suspension.

Pour remettre en suspension la pastille virale, utilisez un embout filtrant pour ajouter 100 microlitres de PBS stérile pré-filtré dans votre tube. Ensuite, pipetez de haut en bas environ 20 fois. Laissez le virus à quatre degrés pendant la nuit pour terminer la remise en suspension.

Vous pouvez stocker les préparations virales à quatre degrés pendant environ une semaine et à moins 80 degrés pendant un an maximum. N’oubliez pas de traiter tous les tubes vides avec de l’eau de Javel à 10 % avant de les jeter. Si vous avez l’intention d’utiliser la préparation virale pendant plus d’une semaine, elle se conservera au réfrigérateur.

Faites des aliquotes minimales de cinq à 20 microlitres pour les expériences futures et une aliquote de trois à cinq microlitres pour le titrage, gelez et stockez les aliquotes à environ moins 80. L’étape suivante consiste à déterminer le titre viral. Si vous avez inclus un gène rapporteur fluorescent dans votre plasmide lentiviral, les cellules infectées seront fluorescentes et vous pourrez déterminer le titre viral à l’aide de la cytométrie en flux.

Pour commencer, diluez trois microlitres de virus concentré dans 1,5 millilitre de milieu complet dans des puits, de un à six. En une seule rangée d’une plaque de 96 puits. Effectuez les dilutions en série suivantes dans les six puits à 100 microlitres de milieu complet DM.To le premier puits ajoutez 100 microlitres de milieu sans virus.

C’est votre contrôle sans tache. Au deuxième, ajoutez bien 100 microlitres du virus dilué au troisième. Eh bien, ajoutez 100 microlitres du mélange du deuxième puits au quatrième.

Eh bien, ajoutez 100 microlitres du troisième puits au cinquième. Eh bien, ajoutez 100 microlitres du quatrième puits et au sixième. Eh bien, ajoutez 100 microlitres à partir du cinquième.

Eh bien, enfin, sortez 100 microlitres du sixième puits, jetez-le et blanchissez, ce qui porte le volume total dans tous les puits à 200 microlitres avec DMEM. À chaque dilution, la concentration virale diminue de moitié. Notez qu’il ne s’agit que de dilutions suggérées, qui devraient bien fonctionner pour le titrage des virus les plus concentrés.

Si votre virus est faible en titre ou non concentré, vous devrez peut-être ajuster vos dilutions. Traitez tout virus dilué non utilisé avec de l’eau de Javel à 10 % pendant 45 minutes avant de le jeter dans un contenant de déchets biologiques. Ajoutez environ 15 000 cellules T en bonne santé qui divisent activement 2, 9 et 3 cellules T dans chacun des six puits.

Vous pouvez utiliser une seule plaque à 96 puits pour titrer 16 préparations virales, remplir les puits à 200 microlitres, retourner les cellules dans l’incubateur et laisser l’infection se poursuivre pendant au moins 48 heures. Après l’incubation, analysez la fluorescence cellulaire à l’aide d’un cytomètre en flux. Vous pouvez utiliser le pourcentage de cellules fluorescentes par puits pour déterminer le titre ou le nombre de particules virales infectieuses par millilitre de virus ajouté.

Calculez le nombre d’unités infectieuses par millilitre à l’aide de la formule suivante lors de l’interprétation du débit. Résultats du cytomètre. Notez que l’on ne peut obtenir des calculs de titre précis que lorsque les cellules infectées n’ont pas reçu plus d’une intégration virale par cellule.

Pour vous assurer que c’est le cas, utilisez des cellules dont le taux d’infection est inférieur à 15 % pour les calculs. Les cellules ayant des taux d’infection plus élevés auront probablement reçu plusieurs intégrités virales par cellule. La dilution suggérée à la deuxième étape devrait permettre d’obtenir plusieurs échantillons dans cette plage d’infection.

Idéalement, utilisez plusieurs échantillons pour générer un graphique de titrage à partir duquel vous pouvez calculer le titre final. La formule calculée à partir de la ligne linéaire ajustée peut être utilisée pour calculer le titre viral, mais vous pouvez calculer le titre en utilisant un seul échantillon si nécessaire. On peut s’attendre à un titre d’un fois 10 à la septième unité de transduction par millilitre pour le virus non concentré, et d’une fois 10 à la huitième unité de transduction par millilitre pour le virus concentré.

Nous venons de vous montrer comment produire des lentivirus lors de cette procédure. Il est important de respecter toutes les réglementations en matière de biosécurité et d’éliminer les déchets correctement. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.