Name: La production de lentivirus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Apprenez la production de lentivirus pour la thérapie génique en utilisant des cellules 293T humaines. Cette méthode démontre la transfection, la récolte et la titration virale par fluorescence.

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Sandler base de l&#39;asthme Research Center (SABRE) Sandler Foundation

Partie 1: La transfection de cellules HEK 293 cellules à produire de lentivirus * 24 heures avant la transfection, plaque 2,5 x 10 6 cellules dans un plat de 10cm pour une confluence de 50-70% le jour suivant. <ol><li> Démarrer ce protocole par la préparation de l&#39;ADN avec lequel on sera plus tard son transfecter des cellules de rendre le virus. Premièrement, diluer FuGENE 6 réactif de transfection Roche, un réactif lipidique qui rendent les cellules prennent l&#39;ADN. Dans un tube de 1,5 ml, pipette 30μl FuGENE 6 dans 600ul milieu sans sérum (SFDMEM). Soyez prudent de ne pas laisser FuGENE toucher le côté du tube, comme il est livré dans le milieu. Que ce FuGENE et mélanger SFDMEM et incuber à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Dans le bouchon du tube, mélanger 4 ug lentiviraux plasmide avec 4 ug de chaque 3 ème génération de vecteurs viraux emballage (pMDL, pRSV et pVSV-G). Le plasmide lentiviral contient l&#39;ADN du virus va insérer dans le génome de chaque cellule qu&#39;il infecte, tandis que les vecteurs d&#39;emballages contenant des gènes de toutes les autres protéines nécessaires pour faire un lentivirus. </li><li> Fermer le couvercle et mélanger en inversant le tube à quelques reprises. </li><li> Incuber 15-20 minutes à température ambiante. </li><li> Pipeter ensemble du contenu du tube dans 293 plaques. Mélanger doucement par plaque basculante en arrière. </li><li> Retour aux cellules de l&#39;incubateur et de permettre la production virale se poursuivre pendant 48-96 heures avant la récolte. </li><li> Durant l&#39;incubation, les cellules 293 transcrire l&#39;ADN d&#39;intérêt à partir du plasmide lentiviral, créant une copie d&#39;ARN de la construction lentiviraux. Ils ont aussi transcrire et traduire des gènes dans les vecteurs d&#39;emballage dans les protéines virales. Ces protéines font procéder à des virus ARN contenant la version de votre construction lentiviral, dont le virus se transcription inverse et l&#39;insérer dans les génomes de toutes les cellules qu&#39;il infecte. </li></ol> Partie 2: Récolte lentiviraux <ol><li> Après la période d&#39;incubation, prélever des cellules de l&#39;incubateur et d&#39;utiliser une seringue de 10 ml à usage unique, pour éliminer le surnageant, qui contient maintenant le virus. Il y aura environ 10 ml de surnageant. </li><li> Fixez un filtre à seringue 0.45μM à la pointe et de filtrer les virus dans un tube Ultracentrifuger Beckman. Le filtre ne permet que des virus, des cellules et non de passer à travers. </li><li> Avant de jeter, incuber les cellules produisant du virus, des plaques de culture, des seringues et des filtres dans l&#39;eau de Javel à 10% pendant 45 minutes. </li></ol> Partie 3: Concentration lentiviraux par ultracentrifugation <ol><li> Charger des tubes à centrifuger en SW-41Ti ou SW-28 seaux rotor. </li><li> Utilisez DMEM sans sérum pour équilibrer tous les virus contenant des tubes à l&#39;intérieur 0.2g. </li><li> Sceau du rotor fermé seaux et de les accrocher du rotor avant de placer le rotor à l&#39;intérieur du ultracentrifugeuse </li><li> Spin le virus pendant 90 minutes dans une ultracentrifugeuse à 4 ° C à 25000 rpm dans un rotor SW-41Ti ou 24000 rpm dans un rotor SW-28. </li><li> Dans une hotte de culture de tissus, inverser les tubes à l&#39;envers pour verser le surnageant dans un récipient contenant l&#39;eau de Javel à 10%. </li><li> Utilisez un Kimwipe pour absorber l&#39;excès de liquide autour de la boulette et inverser le tube dans un rack pratique pour pas plus de cinq minutes. </li><li> Pour re-suspendre le culot viral, utiliser un embout de filtre pour ajouter 100 ul de PBS stérile dans le tube, puis la pipette et une baisse d&#39;environ 20 fois. </li><li> Laisser le virus à 4 ° C pendant la nuit pour terminer la remise en suspension. On peut stocker preps virale à 4 degrés pendant environ 1 semaine et à -80 degrés jusqu&#39;à un an. N&#39;oubliez pas de traiter tous les tubes vides avec l&#39;eau de Javel à 10% avant de les jeter. </li><li> Si on veut utiliser la prépa virale pendant plus de la semaine 1, faire des aliquots minimale de 5-20 pi pour des expériences futures et une aliquote de 3 à 5uL pour le titrage. Congeler et stocker l&#39;aliquots à 80 moins. </li></ol> Partie 4: Titrage lentiviraux par cytométrie en flux <ol><li> La prochaine étape est de déterminer le titre viral par cytométrie en flux. Cette méthode fonctionne uniquement dans les cas où le plasmide lentiviral contient un gène rapporteur fluorescent. L&#39;idée est que lorsque le virus infecte une cellule, il introduit l&#39;ADN plasmidique dans le génome lentiviral de cette cellule. La cellule infectée sera ensuite transcrire et traduire les gènes que vous avez inclus dans le plasmide lentiviral, et si vous avez inclus un gène rapporteur fluorescent, les cellules infectées seront fluorescence. Le niveau de fluorescence représente la puissance, ou titre, du virus. </li><li> Pour chaque stock viral pour être titrés, diluer 3 ul de virus concentré dans 1,5 ml de milieu complet (DMEM, stylo-streptococcique, la glutamine, FBS). </li><li> Dans les puits 1-6 dans une seule rangée d&#39;une plaque de 96 puits, effectuer les dilutions suivantes de série: à tous les 6 puits ajouter 100 ul de DMEM complet des médias. Pour le premier bien ajouter 100 ul de médias sans virus (ce qui est de votre contrôle non coloré), à la seconde même ajouter 100 ul du virus dilué (ce qui équivaut à1 ml de virus non dilué), au troisième puits ajouter 100 uldu mix du second puits, à la quatrième et ajouter 100 ml de la 3ème ainsi, pour la cinquième et ajouter 100 ul du puits 4, et pour la sixième et ajouter 100 ul de la 5ème bien. Enfin, prenez 100ul du puits 6 et jeter dans l&#39;eau de Javel. Une dilution en série a été réalisée, où chaque puits a la moitié du volume de virus par rapport à celle qui la précède. </li><li> Porter le volume total dans tous les puits à 200 pl. Notez que ce sont des dilutions seulement suggéré, ce qui devrait bien fonctionner pour titrage des virus les plus concentrées. Si le virus est faible en titre, ou non concentré on peut avoir besoin d&#39;ajuster les dilutions. </li><li> Traitez tout virus inutilisée dilué avec Javel à 10% pendant 45 minutes avant de les jeter dans un conteneur pour déchets biologiques dangereux. </li><li> Ajouter ~ 15000 saines, les cellules en division active 293 à chacun des six puits. Une seule plaque de 96 puits peut être utilisée pour titrer 16 preps virale. </li><li> Retour cellules à 37 degrés avec incubateur 5% de CO 2 et permettre l&#39;infection de procéder au moins 48 heures. </li><li> Après l&#39;incubation, les cellules sont analysées pour l&#39;expression journaliste (dans notre cas, la fluorescence) avec un cytomètre en flux. Les particules virales sont quantifiés par le pour cent des cellules fluorescentes par puits. </li></ol> Calculer le nombre d&#39;unités infectieuses par ml avec la formule suivante: <div style="text-align:center;"> (Nombre de cellules par puits, le jour des cellules d&#39;infection journaliste de X positive) X 1000 ______________________________________________________ ml de vecteur ajouté à bien </div> Partie 5: Résultats du représentant: Après une transfection de 48 heures d&#39;incubation après, la plaque de 293 cellules devrait être d&#39;environ 90% fluorescentes. Un pourcentage élevé de cellules fluorescentes est une indication d&#39;un pourcentage élevé de cellules produisant des virus. Après centrifugation, le culot viral est à peine visible lorsque la remise en suspension. Ceci est normal que la pastille est clair et très petites entreprises. Lors de l&#39;interprétation des résultats cytomètre en flux, notez que l&#39;on ne peut atteindre les calculs précis quand titre infectés (fluorescentes) des cellules avons reçu pas plus d&#39;une intégration virale par cellule. Afin de s&#39;assurer que cela est le cas, utiliser des cellules avec un taux &lt;15% d&#39;infection pour les calculs. Cellules avec des taux d&#39;infection plus élevés ont probablement reçu plusieurs intégrants viraux par cellule. Les dilutions suggéré dans l&#39;étape 2 devrait donner plusieurs échantillons dans cette gamme d&#39;infection. Idéalement, utilisez plusieurs échantillons pour générer une parcelle de titration (ligne linéaire) à partir de laquelle vous pouvez calculer le titre final, mais vous pouvez calculer un titre en utilisant un seul échantillon, si nécessaire. On peut s&#39;attendre à un titre de 1,0 x 10 7 TU / ml pour les non-concentrée de virus et 1,0 x 10 8 TU / ml pour le virus de concentré.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM cellules HEK 293T Pénicilline-streptomycine Glutamine Solution saline tamponnée au phosphate FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection FuGENE 6 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire de 10 cm Plaques de culture cellulaire de 96 puits </td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanal</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette filtrées</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf de 1,5 ml Seringue Filtre seringue (0,45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes d'ultracentrifugation</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture tissulaire à 5 % de CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotateur Beckman SW41T.I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Beckman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la production de lentivirus

Lentivirus Production

L&#39;interférence ARN (ARNi) est un système d&#39;inactivation des gènes dans les cellules vivantes. Dans l&#39;ARNi, les gènes homologues en séquence à court ARN interférents (siRNA) sont réduits au silence à l&#39;état post-transcriptionnel. ARN en épingle à cheveux courts, des précurseurs de siARN, peut être exprimé en utilisant des lentivirus, permettant l&#39;ARNi dans une variété de types cellulaires. Les lentivirus, comme le virus de l&#39;immunodéficience humaine, sont capables d&#39;infecter à la fois la division et non de division des cellules. Nous allons décrire une procédure pour lentivirus colis. Emballage se réfère à la préparation de virus compétents de vecteurs d&#39;ADN. Lentiviraux systèmes de production de vecteurs sont basés sur un «split» du système, où le génome viral naturel a été divisée en des constructions individuelles d&#39;aide plasmide. Ce fractionnement des différents éléments viraux en quatre vecteurs séparés diminue le risque de créer un virus capable de réplication-par recombinaison fortuite du génome lentiviral. Ici, un vecteur contenant le shRNA d&#39;intérêt et de trois vecteurs d&#39;emballage (p-VSVG, pRSV, pMDL) sont transfectées de façon transitoire dans les cellules humaines 293. Après au moins une période d&#39;incubation de 48 heures, le surnageant contenant le virus est récolté et concentrée. Enfin, le titre viral est déterminé par le journaliste (fluorescent) l&#39;expression d&#39;un cytomètre en flux.

Pour faire des lentivirus, des vecteurs d&#39;ADN sont transfectés dans les cellules humaines 293. Après la récolte et la concentration du surnageant, le titre viral est déterminé par l&#39;expression de fluorescence avec un cytomètre en flux.

La production de lentivirus

L'interférence ARN (ARNi) est un système de silençage génique dans les cellules vivantes. Dans l'ARNi, les gènes dont la séquence est homologue à celle de courts ARN interférants (siARN) sont...

Cette procédure commence par la transfection de cellules 293T avec un lentivirus, un plasmide et des vecteurs d’emballage viral ; le surnageant viral est récolté après une période d’incubation d’au moins 48 heures. Le surnageant est filtré puis concentré à l’aide d’une ultracentrifugation. Le culot viral est mis en suspension dans du PBS afin d’obtenir le titre viral : diluez d’abord le virus concentré dans un milieu complet, puis effectuez une dilution en série pour infecter les cellules avec le lentivirus.Bonjour, je suis Shein Wong du laboratoire de Michael McManus au centre du diabète de l'Université de Californie à San Francisco. Je suis Michael McManus. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour la production de lentivirus.Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour produire des lentivirus destinés à l'interférence ARN. Commençons donc. Pour commencer ce protocole, préparez l'ADN permettant de transfecter les cellules 2 9 3 T.Diluez d'abord le réactif de transfection FU gene six dans un tube de 1,5 millilitre en mélangeant 30 microlitres de Fuji six avec 600 microlitres de milieu sans sérum. Veillez à ne pas laisser le Fuji toucher les parois du tube lors de son ajout dans le milieu. Incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, dans le bouchon du tube, mélangez quatre microgrammes de plasmide lentiviral avec 1,33 microgrammes.Chaque vecteur d’emballage viral de troisième génération. Le plasmide lentiviral contient l'ADN. Le virus s'insérera dans le génome de chaque cellule qu'il infecte, tandis que les vecteurs d’emballage contiennent les gènes de toutes les autres protéines nécessaires à la fabrication d’un virus lentiviral. Fermez le couvercle et mélangez en retournant le tube plusieurs fois.Incubez l'ADN et le réactif de transfection de 15 à 20 minutes à température ambiante. Il est maintenant temps de transfecter les cellules 2 9 3 avec l'ADN que vous avez préparé : utilisez des cellules que vous avez ensemencées 24 heures auparavant et qui ont atteint une confluence de 50 à 70 % ; dans la hotte de culture cellulaire, pipetez tout l'ADN préparé sur la plaque contenant les cellules 2 9 3, puis mélangez délicatement en inclinant la plaque d'avant en arrière. Replacez les cellules dans l'incubateur et laissez la production virale se poursuivre pendant 48 à 96 heures avant la récolte. Pendant l'incubation, les cellules 2 9 3 produisent des lentivirus dont les génomes contiennent une copie ARN de votre ADN d'intérêt.Il est maintenant temps de recueillir le virus. Sortez vos cellules de l’incubateur. Préparez dans la hotte de culture cellulaire un filtre à seringue de 0,4 ou cinq micromètres, une seringue jetable de 10 millilitres et un tube d’ultracentrifugation UltraClear Beckman.Utilisez la seringue jetable pour prélever le surnageant, qui contient désormais le virus. Fixez un filtre à seringue de 0,45 micron à l'extrémité et filtrez le virus dans un tube à centrifuger UltraClear Beckman. Le filtre permet uniquement aux virus, et non aux cellules, de passer avant de jeter les cellules productrices de virus, qui doivent être incubées.Placer les plaques de culture, les seringues et les filtres dans une solution d'eau de javel à 10 % pendant 45 minutes. Maintenant que vous avez collecté et filtré le virus, il est temps de concentrer le virus par ultracentrifugation. Utilisez du DMEM sans sérum pour équilibrer tous les tubes contenant le virus à ± 0,2 gramme près les uns des autres.Ensuite, chargez les tubes de centrifugeuse équilibrés dans les godets du rotor SW 41 TI ou SW 28. Fermez hermétiquement les godets du rotor et accrochez-les au rotor. Puis placez le rotor à l'intérieur de l'ultracentrifugeuse.Faire centrifuger le virus pendant environ 90 minutes à quatre degrés Celsius à 25 000 tr/min dans un rotor SW 41 TI, ou à 24 000 tr/min dans un rotor SW 28. Après la centrifugation, retourner dans la hotte de culture tissulaire et retourner le tube pour verser le surnageant dans un récipient contenant de l’eau de Javel à 10 %. Utiliser un essuie-tout Kim pour absorber le liquide excédentaire autour du culot, puis placer le tube à l’envers dans un support adapté pendant pas plus de cinq minutes, jusqu’à ce que vous soyez prêt à resuspendre le culot.Pour resuspendre le culot viral, utilisez une pointe filtrante pour ajouter 100 microlitres de PBS stérile préfiltré à votre tube. Ensuite, pipetez vers le haut et vers le bas environ 20 fois. Laissez le virus à quatre degrés toute la nuit pour terminer la resuspension.Vous pouvez conserver les préparations virales à quatre degrés pendant environ une semaine et à moins 80 degrés pendant jusqu'à un an. N'oubliez pas de traiter tous les tubes vides avec de l'eau de javel à 10 % avant de les jeter. Si vous prévoyez d'utiliser la préparation virale pendant plus d'une semaine, elle se conserve au réfrigérateur.Prélevez des aliquotes minimales de cinq à 20 microlitres pour les expériences futures et une aliquote de trois à cinq microlitres pour la titration, puis congélez et stockez les aliquotes à environ moins 80. L'étape suivante consiste à déterminer le titre viral. Si vous avez inclus un gène rapporteur fluorescent dans votre plasmide lentiviral, les cellules infectées fluoresceront et vous pourrez déterminer le titre viral par cytométrie en flux.Pour commencer, diluez trois microlitres de virus concentré dans 1,5 millilitre de milieu complet dans les puits numérotés de un à six, disposés sur une seule rangée d'une plaque de 96 puits. Effectuez les dilutions sérielles suivantes dans les six puits avec 100 microlitres de DM complet. Au premier puits, ajoutez 100 microlitres de milieu sans virus.Il s'agit de votre témoin non coloré. Ajoutez 100 microlitres du virus dilué à la troisième cavité. Ajoutez 100 microlitres du mélange provenant de la deuxième cavité à la quatrième.On ajoute 100 microlitres du troisième puits au cinquième. On ajoute 100 microlitres du quatrième puits au sixième. On ajoute 100 microlitres du cinquième puits.Prélève finalement 100 microlitres à partir du sixième puits et jette-les, puis ajoute de l'eau de Javel pour ramener le volume total dans tous les puits à 200 microlitres avec du DMEM. À chaque dilution, la concentration virale diminue de moitié. Remarque : il s'agit uniquement de dilutions suggérées, qui conviennent bien pour la titration de la plupart des virus concentrés.Si votre virus présente un faible titre ou n'est pas concentré, vous devrez peut-être ajuster vos dilutions. Traitez tout virus dilué inutilisé avec de l'eau de javel à 10 % pendant 45 minutes avant de le jeter dans un contenant pour déchets biologiques dangereux. Ajoutez environ 15 000 cellules 293T saines et en division active à chacun des six puits.Vous pouvez utiliser une seule plaque de 96 puits pour titrer 16 préparations virales, compléter les milieux jusqu'à 200 microlitres, replacer les cellules dans l'incubateur et laisser l'infection se dérouler pendant au moins 48 heures. Après l'incubation, analyser la fluorescence des cellules à l'aide d'un cytomètre en flux. Vous pouvez utiliser le pourcentage de cellules fluorescentes par puits pour déterminer le titre ou le nombre de particules virales infectieuses par millilitre de virus ajouté.Calculez le nombre d'unités infectieuses par millilitre à l'aide de la formule suivante lors de l'interprétation des résultats du cytomètre en flux. Notez qu'il est possible d'obtenir des calculs précis du titre uniquement lorsque les cellules infectées ont reçu au maximum une intégration virale par cellule.Pour s'assurer que tel est le cas, utilisez des cellules présentant un taux d'infection inférieur à 15 % pour les calculs. Les cellules ayant des taux d'infection plus élevés auront probablement reçu plusieurs intégrations virales par cellule. La dilution suggérée à l'étape deux devrait produire plusieurs échantillons dans cette fourchette d'infection.Utilisez idéalement plusieurs échantillons pour générer une courbe de titrage à partir de laquelle vous pouvez calculer le titre final. La formule calculée à partir de la droite linéaire ajustée peut être utilisée pour déterminer le titre viral, mais vous pouvez calculer le titre à l’aide d’un seul échantillon si nécessaire. On peut s’attendre à un titre de un fois dix puissance sept unités de transduction par millilitre pour le virus non concentré, et de un fois dix puissance huit unités de transduction par millilitre pour le virus concentré.Nous venons de vous montrer comment produire des lentivirus lors de cette procédure. Il est important de respecter toutes les réglementations de biosécurité et d'éliminer les déchets de manière appropriée. Voilà, c'est terminé.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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