Préparation Étaler chromosomique des cellules souches embryonnaires humaines pour le caryotype

Introduction. Bonjour. Nous sommes issus de l'Institut des sciences biométriques de l'Université fédérale de Faja au Brésil. Dans cette vidéo, nous allons préparer des préparations chromosomiques de cellules souches embryonnaires humaines afin de détecter d'éventuelles altérations chromosomiques miraculeuses. Bien que les cellules souches embryonnaires humaines se soient révélées présenter un caryotype stable déployé, de nombreuses études ont signalé que, selon les conditions de culture, elles deviennent susceptibles d'acquérir des anomalies chromosomiques telles que l'ajout de chromosomes entiers ou de parties de chromosomes.

La caractérisation de l'intégrité génétique des HASS in vitro est cruciale, étant donné son importance essentielle pour les études d'embryogenèse et de test de médicaments. De plus, pour les futures propositions thérapeutiques, les modifications chromosomiques constituent une préoccupation réelle, car elles sont fréquemment associées à la cancérogenèse. Commençons donc.

Traiter les cellules avec du ate. Dans cette procédure, nous l'utilisons. Les huit à neuf lignées sont cultivées dans le milieu F 12 supplémenté avec 20 % de substitut de sérum sans comptage et 80 à neuf microgrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes. Commencez par retirer le flacon de l'incubateur et, sous une hotte à flux laminaire, ajoutez du coit à une concentration finale de 0,1 microgramme par millilitre.

L'ajout de Coit au milieu induit la mitose, le repos et la métaphase. Lorsque les chromosomes sont bien condensés et peuvent être visualisés plus facilement au microscope, veillez à utiliser des techniques stériles afin d'éviter toute contamination. Une fois le Coit ajouté, conservez le flacon et remettez les cellules dans l'incubateur.

Après la période d'incubation, les cellules ne sont pas encore prêtes à être fixées. Il n'est pas nécessaire de travailler dans des conditions stériles. Commencez par aspirer le milieu, puis, une fois terminé, ajoutez une tryine.

Le DTA est de 0,05 % dans le flacon. Veillez à ajouter suffisamment de trypsine pour recouvrir la surface inférieure des cellules. Boucher le flacon et agiter doucement pour répartir uniformément.

La trypsine permet aux cellules d'incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après les cinq minutes d'incubation à température ambiante, les cellules ne doivent plus être attachées à la face inférieure du flacon, et vous devrez inactiver la trypsine soit en ajoutant un milieu de culture contenant du sérum, soit en ajoutant délicatement du sérum aux cellules. Retirez soigneusement le bouchon du flacon et ajoutez le milieu de culture ou le sérum, en laissant le liquide s'écouler le long de la face inférieure du flacon, recouvrant ainsi les cellules.

Agiter la suspension cellulaire plusieurs fois de haut en bas afin de dissocier complètement les cellules. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres, mais auparavant, s'assurer que les cellules ont été bien dissociées et que la suspension ne contient aucun agrégat cellulaire visible. Une fois le transfert terminé, boucher le tube et centrifuger.

Incubez la suspension pendant cinq minutes. Après centrifugation à 800 tr/min, un culot cellulaire doit se former au fond du tube. Veillez à ne pas perturber le culot cellulaire.

Aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette P1000 jusqu’à ce qu’il reste environ 200 microlitres. Ce volume est médian par rapport à Resus. Suspendez le culot dans Resus.

Suspendez le palais. Tapez doucement plusieurs fois sur le tube avec vos doigts. Vérifiez que les cellules sont bien suspendues en vous assurant qu’il n’y a plus aucun agrégat de cellules dans la solution.

À ce stade, la solution doit être trouble. Ensuite, vous devez ajouter cinq millilitres d'une solution de chlorure de potassium à 75 millimolaire préchauffée à 37 degrés Celsius. La solution hypotonique doit être ajoutée très lentement le long de la paroi du tube tout en tournant ce dernier.

Après avoir ajouté les trois premiers millilitres, fermez hermétiquement le tube et manipulez-le avec précaution. Homogénéisez la suspension cellulaire avec une solution hypotonique en tournant doucement le tube à l’horizontale et en le faisant pivoter lentement.

Procéder en ajoutant lentement les deux millilitres restants de la même manière qu'auparavant. L'objectif de la solution hypotonique est d'augmenter le volume cellulaire afin de permettre le déroulement des chromosomes. Cette période d'incubation est donc cruciale pour obtenir de bonnes préparations chromosomiques. Une fois les cinq millilitres ajoutés, boucher le tube et incuber les cellules dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Lorsque la période d'incubation de 15 minutes est terminée, retirez le tube du bain-marie. À ce stade, vous devez travailler sous une hotte, car les vapeurs produites par la solution fixative sont toxiques. Si vous n'avez pas accès à une hotte, assurez-vous de travailler dans un endroit bien ventilé.

Retirez le bouchon du tube et ajoutez trois gouttes de la solution fixatrice. Il s'agit d'un mélange de méthanol et d'acide acétique en rapport de trois pour un, qui doit être préparé le jour même de l'utilisation. Bouchonnez fermement le tube et faites-le tourner doucement à l'horizontale en le faisant pivoter lentement d'abord dans le sens horaire, puis dans le sens antihoraire.

Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 800 tr/min sans frein. Il est très important que le cycle de rotation s'arrête lentement afin d'éviter la perte de matériau due à l'usure cellulaire après la centrifugation. Ce cardio sate vit dans environ 200.

Juste pour suspendre le culot, agiter doucement le tube avec les doigts plusieurs fois. Vérifiez que les cellules sont bien suspendues en s'assurant qu'aucun agrégat de cellules n'est visible. Ajouter lentement la solution fixative au volume de trois millilitres le long de la paroi du tube tout en faisant tourner le tube après avoir ajouté les trois premiers millilitres.

Fermez hermétiquement le tube T et homogénéisez soigneusement la suspension cellulaire en tournant doucement le tube horizontalement et en le faisant pivoter lentement. Assurez-vous d'effectuer au moins une rotation complète. Pour maximiser ce processus de mélange, ajoutez-en davantage.

Deux millilitres de la solution de fixateur le long de la paroi du tube pour faire déposer les cellules. Conserver la suspension cellulaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Les cellules fixées peuvent être stockées dans la solution de fixateur à quatre degrés Celsius pendant plusieurs mois.

Laver les cellules le jour suivant en centrifugeant les cellules cinq minutes à 800 tr/min sans frein. Éliminer le surnageant et laisser environ 200 microlitres. Suspendre le culot en tapotant plusieurs fois le tube avec les doigts.

Veillez à ce que les cellules soient bien associées et que la suspension ne contienne aucun agrégat cellulaire visible. Ajoutez lentement cinq millilitres de solution de fixation fraîche le long de la paroi du tube. Boucher le tube et homogénéiser les cellules en retournant doucement le tube horizontalement tout en le faisant tourner lentement.

Outre la protection des cellules, la solution fixative élimine les lipides puis dénature les protéines, ce qui facilite par la suite l'étalement des chromosomes. Après la centrifugation, éliminer le surnageant en laissant cinq minutes à 800 RRP M sans frein. Préparation des lames : à l'étape de centrifugation, laisser une quantité suffisante de solution pour homogénéiser le culot cellulaire.

Cette quantité de liquide peut dépendre du nombre de cellules. Agiter doucement le tube avec les doigts plusieurs fois. S'assurer que les cellules sont bien dissociées en vérifiant qu'il n'y a pas d'agrégats cellulaires visibles.

À ce stade, la solution doit être complétée par l'ajout de 20 à 30 microlitres de suspension cellulaire sur une lame propre et sèche en déplaçant la pipette parallèlement à cette surface claire. Lorsque la solution fixatrice s'évapore, la surface claire devient immédiatement granuleuse. Exposer cette lame, côté clair vers le haut, à la vapeur d'eau chaude pendant 30 secondes afin de provoquer un gonflement des cellules.

Analyser ces lumières. Après avoir préparé ces lames, les examiner au microscope à contraste de phase en utilisant les objectifs 10 et les objectifs pelés pour vérifier si la densité cellulaire convient à une analyse ultérieure. Cette lame est un exemple de préparation trop concentrée.

Remarquez que les noyaux cellulaires sont trop proches des métaphases étalées. Si vous avez une lame où la densité cellulaire est trop élevée, alors diluez la suspension cellulaire en ajoutant plus de solution fixatrice. Cette lame montre la densité cellulaire souhaitée.

Remarquez que les métaphases sont bien dispersées et isolées. Une fois qu'une lame avec une densité cellulaire optimale a été obtenue, elle ne peut pas être colorée ni analysée. Évitez de choisir les métaphases proches du noyau, car les chromosomes peuvent être cachés ou masqués à la vue.

Recherchez les métaphases qui sont arrondies, mais assurez-vous qu'aucun chromosome n'est aligné à partir de la métaphase YO. Choisissez des métaphases arrondies et bien isolées. Comme dans la diapositive suivante, essayez d'éviter de signaler de fausses IES dues au gain de chromosomes provoqué par des étalements supplémentaires. Mélangez-les, ou à la perte de chromosomes provoquée par des chromosomes alignés.

Nous espérons que cette vidéo vous aidera dans vos expériences futures. Si vous avez le moindre doute, n'hésitez pas à nous contacter. Amusez-vous bien et bonne chance.