L'utilisation du kit de détection de protéase fluorescent pour déterminer l'activité de protéase

Ce protocole commence par l'ajout, dans un tube de microcentrifugeuse, du tampon d'incubation, de la solution de caséine FXI et de l'échantillon contenant la protéase d'intérêt, puis par un mélange doux et une incubation à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes à l'abri de la lumière. Pour arrêter la réaction protéolytique à la fin de la période d'incubation, ajouter la solution d'acide trichloroacétique (TCA), bien mélanger et incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, toujours à l'abri de la lumière. Cette étape provoque la précipitation du substrat non réactif.

Centrifuger l'échantillon pendant 10 minutes. À 10 000 G, retirer le surnageant, qui contient les fragments marqués de FXI solubles dans l'acide. Transférer le surnageant dans une plaque à puits ou plusieurs puits, diluer avec le tampon de dosage et lire l'échantillon au fluorimètre.

Bonjour, je suis Carrie Cup Vineyard et je suis scientifique au sein de notre installation Sigma Aldridge DeKalb à St. Louis, dans le Missouri. Aujourd'hui, je vais vous présenter une procédure de dosage de l'activité protéasique par fluorométrie. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire de contrôle qualité afin de déterminer une faible activité protéasique.

Commençons. Pour cette procédure, le tampon d'incubation, le tampon de dosage et la solution d'acide trichloroacétique (TCA) à 0,6 normal sont fournis sous forme de solutions prêtes à l'emploi. Aliquoter la solution de Cain marquée au fite en volumes plus petits et conserver à moins 20 degrés Celsius, en veillant à la protéger de la lumière en utilisant des flacons ambrés ou en enveloppant les tubes transparents dans du papier d'aluminium.

Citer le substrat fite Cain réduit le besoin de cycles répétés de congélation-décongélation, car des cycles répétés de congélation-décongélation ou des agitations ou mélanges vigoureux du fite Cain pourraient entraîner une séparation du fite et du Cain, ce qui augmenterait le bruit de fond. Si vous étalonnez le fluorimètre ou déterminez la gamme linéaire du signal du fit e, préparez la solution témoin de fit. Préparez cette solution fraîchement en la reconstituant dans le tampon d'essai à la concentration appropriée.

Une fois prêt, protégez la solution de la lumière. Enfin, préparez le témoin de protéase tripsine en ajoutant 100 microlitres d'acide chlorhydrique un millimolaire au flacon de tripsine lyophilisée, puis en mélangeant brièvement pour s'assurer que la tripsine est bien dissoute. Le stockage de la tripsine dans des conditions acides augmente sa stabilité.

Remarquez que la solution témoin de trypsine est sensible à la température et n'est pas stable à faible concentration. Ensuite, commencez à préparer tous les échantillons pour le test, qui comprennent les échantillons d'essai ainsi que les témoins et le blanc tout au long du dosage. Conservez les échantillons à l'abri de la lumière pour chaque échantillon d'essai.

Combiner dans un tube de microcentrifugeuse, 20 microlitres de tampon d'incubation, 20 microlitres du substrat fit c kian et 10 microlitres de l'échantillon à tester. On peut utiliser une microcentrifugeuse transparente à condition que l'échantillon soit incubé à l'abri de la lumière. Remarquez également que les échantillons à tester, qui présentent une activité protéasique élevée, devront être dilués.

L'échantillon témoin de tripsine est utilisé comme témoin positif permettant de vérifier que le test fonctionne correctement, afin de déterminer la limite de détection ou d'établir une courbe standard générale. Pour préparer le témoin de tripsine, mélangez une part de tripsine acidifiée avec neuf parts de tampon d'incubation ou du tampon utilisé pour les échantillons à tester, et homogénéisez soigneusement. La concentration finale de travail de la tripsine est de 20 microgrammes par millilitre. Si vous utilisez une protéase spécifique différente, préparez la solution témoin avec cette protéase spécifique et un tampon approprié.

Continuer à préparer l'échantillon témoin en combinant 20 microlitres de tampon d'incubation, 20 microlitres de substrat fz cain et 10 microlitres du témoin de trypsine dans un tube de microcentrifugeuse. Il est recommandé d'effectuer au moins un échantillon témoin contenant cinq nanogrammes de trypsine lors de chaque dosage, ou d'utiliser une dilution en série. Le dernier échantillon est le blanc, préparé en combinant 20 microlitres de tampon d'incubation, 20 microlitres du substrat Fitz Caine et 10 microlitres d'eau ultrapure dans un tube de microcentrifugeuse.

Une fois les trois types d'échantillons prêts, mélanger délicatement chaque tube et incuber à 37 degrés Celsius à l'abri de la lumière pendant 60 minutes. Veiller à ne pas mélanger trop vigoureusement, car une turbulence excessive pourrait entraîner un fond de fluorescence élevé et réduire la sensibilité du test. Une incubation pouvant aller jusqu'à 24 heures peut être effectuée pour augmenter la sensibilité, mais des incubations plus longues ne sont pas recommandées car la caséine FXI pourrait commencer à se dégrader.

Encore une fois, afin d'éviter un fond de fluorescence élevé une fois l'incubation terminée, utilisez des équipements de protection appropriés pour ajouter 150 microlitres de la solution d'acide trichloroacétique (TCA) dans chaque tube de microcentrifugeuse. Après incubation avec le TCA, on doit observer un voile blanc dans le tube, correspondant au mélange de cain précipité, non digéré et insoluble. Mélangez doucement et incubez à 37 degrés Celsius à l'abri de la lumière pendant 30 minutes. À la fin de l'incubation avec la solution de TCA, centrifugez les tubes pendant 10 minutes à 10 000 Gs à température ambiante.

Le surnageant contient les fragments solubles acides marqués au fluorochrome utilisés pour la mesure de fluorescence. Prélevez délicatement à partir de la partie supérieure du tube afin qu'aucun précipité du culot ne soit aspiré dans l'embout de la pipette, ce qui provoquerait un résultat faussement positif lors de la détection fluorescente suivante destinée à mesurer l'activité protéasique à l'aide d'un fluorimètre. Mélangez 10 microlitres du surnageant TCA avec un millilitre de tampon d'analyse dans un tube, en homogénéisant doucement. En outre, diluez l'étalon FE pour analyse en ajoutant 10 microlitres de FE à un millilitre de tampon d'analyse. L'étalon FE et le contrôle de trypsine fournissent un niveau de fluorescence que l'échantillon ne doit pas dépasser. La solution de surnageant TCA et de tampon d'analyse peut être conservée à l'abri de la lumière à une température de 2 à 8 degrés Celsius pendant un maximum de 24 heures avant la mesure de la fluorescence.

Si la mesure est effectuée à l’aide d’un vétor, transférez un millilitre de la solution dans un vétor approprié ; si un grand nombre d’échantillons doivent être analysés, une plaque de 96 puits et un lecteur de plaque à fluorescence peuvent être utilisés pour acquérir des données fluorométriques. Dans cet essai, l’isothiocyanate de fluorescéine est fourni comme témoin pour une éventuelle étalonnage de l’appareil. On observe ici une plage de linéarité représentative du signal FS e suivant la procédure décrite.

L'utilisation de ce kit avec un temps d'incubation de 30 minutes pour la première étape d'incubation donne cette courbe standard typique pour des échantillons de trypsine et des échantillons témoins allant de 1,5 nanogramme à 25 nanogrammes. Les mesures de fluorescence ont été effectuées dans une plaque multipuits. La limite de détection du test correspond à la quantité de protéase produisant une lecture de fluorescence significative supérieure à la valeur obtenue avec l'échantillon témoin.

Aujourd'hui, nous vous avons montré comment utiliser le kit de détermination de la protéase Sigma Aldridge pour détecter l'activité protéasique fluorimétrique dans un échantillon biologique. Bien que ce kit soit optimisé pour votre utilisation, il est important de garder à l'esprit que, pour vos protéases particulières, vous pourriez avoir besoin de légères modifications. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.