Préparation du Pooled lysat plaquettaire humain (pHPL) comme un supplément efficace pour animaux sans sérum humain cultures de cellules souches
30 octobre 2009
Homme lysat plaquettaire est une riche source de facteurs de croissance et d'un supplément puissant dans la culture cellulaire. Ce protocole présente le processus de préparation d'un grand bassin de lysat plaquettaire humaine en commençant à partir du plasma riche en plaquettes, effectuant plusieurs cycles gel-dégel et d'épuiser les fragments de plaquettes.
Ce protocole décrit la procédure de préparation d'un grand lot de lysat plaquettaire humain, à partir de plasma riche en plaquettes. En effectuant un cycle de congélation-décongélation, les plaquettes sont lysées. Ensuite, au moins 10 unités de lysat plaquettaire humain sont regroupées en un seul lot de lysat plaquettaire humain poolé ou PHPL.
Ce volume d'environ trois litres est ensuite divisé en aliquots et à nouveau congelé pour épuiser les fragments plaquettaires. Ces aliquots sont décongelées, transférées dans des flacons et centrifugées. Le surnageant correspond au PHPL appauvri en fragments plaquettaires, contenant des facteurs de croissance d'origine plaquettaire utilisés pour compléter les cultures cellulaires.
Le culot restant de fragments de plaquettes est éliminé. Bonjour, je suis Kadina Sharmo du laboratoire du Dr TRO, unité de recherche sur les cellules souches à l'Université médicale de Grads. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour la préparation d'un pool d'isolats de plaquettes humaines.
Nous partirons du plasma riche en plaquettes, effectuerons plusieurs cycles de congélation-décongélation, puis éliminerons les fragments plaquettaires. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour obtenir un supplément suffisant pour les cultures cellulaires, en alternative au sérum de veau fœtal. Commençons donc.
Ce protocole débute avec du plasma riche en plaquettes, appelé PRP. Ce plasma peut avoir été préparé par aphérèse Cy ou obtenu à partir de couches buffy. Les personnes extérieures au domaine de la médecine transfusionnelle doivent acheter le PRP auprès d'une banque de sang locale ou d'un fournisseur agréé.
Vérifiez la stérilité de l'unité de PRP en transférant 20 millilitres de chaque unité vers un petit sac connecté, puis en déconnectant le sac à l’aide du soudeur. Cet aliquot peut être envoyé immédiatement après la préparation à un laboratoire de microbiologie pour un test de stérilité. Il est important de congeler les unités de PRP à au moins moins 20 degrés dans le sac de stockage d’origine.
Une fois que les tests bactériens sont négatifs, l'étape suivante peut être réalisée. Veiller à ne pas laisser le lysat plaquettaire humain, désormais appelé HPL, s'échauffer excessivement ; placer les unités d'HPL dans un bain-marie à 37 degrés jusqu'à ce que les caillots de glace disparaissent. Les plaquettes doivent être lysées après cette étape de congélation-décongélation afin de préparer un produit standardisé pour chaque pool de lysat plaquettaire.
Prélevez 10 à 15 unités de PRP décongelées. Connectez chaque poche HPL consécutive à la poche double de regroupement, puis transférez l'HPL dans ces deux poches. Déconnectez les poches HPL vides à l’aide du soudeur.
Mélangez le contenu des deux poches pour obtenir un volume final de trois à quatre litres de lysat plaquettaire humain mis en commun, désormais appelé PHPL. Connectez une petite poche et prélève un échantillon de 20 millilitres de PHPL afin de vérifier la stérilité du produit mis en commun.
Prélevez des aliquotes de PHPL pour un traitement ultérieur en raccordant de petits sacs au sac double de regroupement. Transférez des volumes d'environ 250 millilitres dans les petits sacs de stockage, puis déconnectez les sacs remplis à l’aide du soudeur. Effectuez maintenant un cycle supplémentaire de congélation-décongélation afin d’augmenter le taux de fragmentation des plaquettes et la quantité de facteurs de croissance libérés.
Procédez en congelant les petits sacs de PHBL portionnés à moins 20 degrés. Puis décongelez les sacs dans un bain-marie à 37 degrés. Dans la hotte à flux laminaire.
Utilisez des ciseaux stériles pour couper et ouvrir le tube de chaque poche, puis versez le PHPL dans des fioles de 50 millilitres. Souvent, les fragments de plaquettes ont tendance à s'agréger ; les plaquettes peuvent également induire une allo-immunisation. Pour éviter ces phénomènes, éliminez les fragments du PHPL par centrifugation à 4 000 ×g pendant 15 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée.
Ensuite, prélevez par pipette le surnageant plasmatique et transférez-le dans les tubes de stockage définitifs, puis jetez les culots de plaquettes afin d'éviter la présence de fragments dans vos cultures cellulaires avant congélation. Conservez des aliquotes de 50 millilitres de PHPL à nouveau à moins 20 degrés jusqu'à utilisation ultérieure. Maintenant que le PHPL dépourvu de fragments plaquettaires a été préparé, les caractéristiques du lysat peuvent être analysées.
La fonction et la qualité du lysat plaquettaire mis en commun sont testées en culture cellulaire et démontrées par la stimulation efficace de la prolifération cellulaire, la propagation de cellules stromales mésenchymateuses ou MSCs, ainsi que celle des cellules formant des colonies endothéliales, E CFCs, qui s'avère réussie à l'aide de PHPL appauvri en fragments plaquettaires. Veuillez consulter notre protocole écrit concernant les recettes des milieux ici. Deux applications du lysat plaquettaire humain mis en commun.
Dans la culture de cellules souches mésenchymateuses, les CSM provenant du donneur un ont été cultivées soit avec du PHPL, soit avec du PHPL appauvri en fragments plaquettaires. Comme indiqué, une contamination par des fragments plus importante est observée ici par rapport au PHPL appauvri en fragments plaquettaires seul. Les fragments plaquettaires ne soutiennent pas suffisamment la croissance des CSM.
Les trois images ont été prises après 13 jours de culture. Les CSM du donneur deux ont été cultivées pendant neuf jours dans du PHPL appauvri en fragments plaquettaires plutôt que dans du plasma riche en plaquettes. Remarquez que le PRP sans lyse plaquettaire ne soutient pas suffisamment la migration des CSM.
Voir également le protocole JoVE d'Andreas Reish, qui décrit l'utilisation de PHPL appauvri en fragments pour l'isolement et la culture de MSCs dérivées du sang de cordon ombilical humain. Nous venons de vous montrer comment préparer du PHPL afin de remplacer complètement le sérum d'origine animale dans vos cultures de cellules souches. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d'éliminer les fragments plaquettaires avant d'ajouter l'héparine et le PHPL à votre milieu de culture.
Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.
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Aperçu
Ce protocole décrit la préparation d'un lysat plaquettaire humain (HPL) à partir d'un plasma riche en plaquettes (PRP). Le processus implique des cycles de congélation-décongélation afin de lyser les plaquettes et de produire un lysat appauvri en fragments plaquettaires, riche en facteurs de croissance pour la supplémentation en culture cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Culture cellulaire
- Biologie des plaquettes
- Recherche sur les facteurs de croissance
Contexte
- Le lysat plaquettaire humain est un supplément puissant en culture cellulaire.
- Il contient divers facteurs de croissance essentiels à la prolifération et à la différenciation cellulaires.
- Le processus de préparation est crucial pour garantir la qualité et l'efficacité du lysat.
- Le plasma riche en plaquettes sert de matériau de départ pour la préparation du HPL.
Objectif de l'étude
- Présenter un protocole détaillé pour la préparation du lysat plaquettaire humain.
- Garantir l’élimination des fragments plaquettaires afin d’obtenir un lysat plus pur.
- Faciliter l’utilisation du LPH dans diverses applications de culture cellulaire.
Méthodes utilisées
- À partir de plasma riche en plaquettes (PRP).
- Réalisation de cycles de congélation-décongélation pour lyser les plaquettes.
- Préparation du lysat plaquettaire humain poolé (PHPL).
- Centrifugation pour éliminer les fragments plaquettaires du surnageant.
Résultats principaux
- Préparation réussie d'un grand pool de lysat plaquettaire humain.
- Élimination des fragments plaquettaires par centrifugation.
- Rendement d'environ trois litres de facteurs de croissance d'origine plaquettaire.
- Préparation adaptée à l'ajout en supplémentation dans les cultures cellulaires.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour préparer du lysat plaquettaire humain.
- Le LPH peut améliorer significativement les résultats de culture cellulaire.
- Des études supplémentaires peuvent explorer les applications du LPH dans divers domaines de recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les systèmes de culture exempts de sérum animal sont essentiels pour faire progresser les thérapies cellulaires basées sur les cellules souches vers la traduction clinique et la conformité réglementaire. Ce protocole permet la production à grande échelle de lysat plaquettaire humain (pHPL), un supplément défini et sans composant xénogène, qui soutient la prolifération des cellules souches mésenchymateuses et la propagation des cellules formant des colonies endothéliales. En standardisant la lyse plaquettaire et l'élimination des fragments, il réduit la variabilité d'un lot à l'autre et améliore la reproductibilité dans les flux de travail des phases exploratoires et précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Fournit un supplément défini d'origine humaine qui soutient les études mécanistiques des voies de prolifération et de différenciation des cellules souches.
- Valeur opérationnelle : Permet des conditions de culture reproductibles entre les expériences, réduisant la variabilité des tests de validation ciblée.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Fournit un milieu normalisé, riche en facteurs de croissance, qui soutient des lectures fiables dans les tests fonctionnels des cellules souches.
- Valeur opérationnelle : Facilite la standardisation des tests grâce à un lysat dépourvu de fragments, réduisant ainsi les interférences dues aux agrégats de plaquettes dans les plateformes de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet l'expansion de cellules souches pertinentes pour les maladies dans des conditions sans composants xénogènes, en conformité avec les exigences relatives aux biomarqueurs translationnels et aux modèles précliniques.
- Valeur opérationnelle : Permet une production échelonnée à partir de sources de donneurs regroupées, facilitant le transfert de technologie et le développement de procédés proches des bonnes pratiques de fabrication (GMP).
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre à la chaîne de découverte en fournissant un supplément sans sérum pour la culture de cellules souches, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'expansion préclinique, en soutenant l'identification des composés candidats et la réduction des risques mécanistiques.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses concernant la prolifération et la différenciation des cellules souches en offrant un microenvironnement constant et défini.
- Essais de criblage : Permet des tests reproductibles de composés ou de conditions dans des essais fondés sur les cellules souches grâce à un lysat standardisé et appauvri en fragments.
- Analytique : Fournit des données quantifiables telles que les taux de prolifération cellulaire et l'efficacité en unités formant des colonies, permettant des analyses comparatives entre différentes conditions de culture.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte à la recherche préclinique en permettant l'expansion de cellules stromales mésenchymateuses et de progéniteurs endothéliaux dans des conditions cliniquement pertinentes et sans utilisation d'origine animale.
- Réutilisation industrielle : Met en place un processus réutilisable et évolutif pour produire un supplément de qualité clinique à partir de plasma riche en plaquettes couramment approvisionné, réduisant ainsi la dépendance aux séra animaux variables.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive des résultats en culture de cellules souches en éliminant les composants sériques animaux non définis et en standardisant l'administration des facteurs de croissance.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la montée en échelle grâce au traitement groupé de donneurs et à des étapes standardisées de congélation-décongélation et de centrifugation.
- Valeur stratégique : Réduit les risques biologiques dans le développement de thérapies cellulaires en offrant une alternative humaine, exempte de composants xénogènes, au sérum de veau fœtal.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en permettant la génération de données précliniques cohérentes dans des systèmes de culture définis.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques de culture cellulaire stérile, en manipulation des plaquettes et en protocoles de centrifugation.
- Dépend de l'accès à du plasma riche en plaquettes provenant de banques de sang ou de services de transfusion autorisés, ainsi qu'à du matériel stérile de soudure ou de scellage pour la manipulation des poches.
- Exige des tests de stérilité normalisés du PRP entrant et du lysat mis en commun avant et après le traitement, afin de garantir la sécurité de la culture.
- Requiert l'adaptation des protocoles de culture pour tenir compte des concentrations spécifiques à chaque lot de facteurs de croissance, malgré la stratégie de mise en commun.
- Est limité par la nécessité de plusieurs cycles de congélation-décongélation et d'étapes de centrifugation, ce qui augmente le temps de traitement et nécessite un équipement spécialisé.
