Name: Lisolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-28T07:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Découvrez une méthode sans sérum animal pour isoler et amplifier les cellules progénitrices endothéliales ECFC à partir de sang périphérique humain adulte. Cette approche utilise le lysat plaquettaire humain pHPL pour réduire les risques d'immunisation.

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Les auteurs remercient le Dr Katharina Schallmoser pour fournir pHPL et Margaretha Frühwirth et Daniela Thaler pour une assistance technique excellente.

A.) ECFC ISOLATON JOUR 1: <ol><li> Avant de commencer avec l&#39;expérience de préparer la croissance milieu de culture cellulaire endothéliale moyenne-2 (EGM-2). Supplément 500ml endothéliale Basal Medium-2 avec de l&#39;héparine (1ml de 1000 U / ml), solution de 5ml 100x de pénicilline / streptomycine (tous Sigma, St. Louis, MO; <a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a> ), L-glutamine (2 mM de concentration finale ), et 50 ml commun lysat plaquettaire humain (pHPL). Ensuite, ajoutez 0,2 hydrocortisone ml, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml de VEGF, EGF 0,5 ml, 0,5 ml d&#39;IGF-1 et 0,5 ml d&#39;acide ascorbique (à condition que SingleQuots, tous Lonza, Walkersville, MD; <a href="http://www.lonzabioscience.com/">http://www.lonzabioscience. com /</a> ). Filtrat stérile de la moyenne grâce à un 0,2 m-taille des pores du filtre 500 ml sous vide Millipore. Depuis pHPL formes petits caillots vous pouvez avoir besoin de deux filtres pour une moyenne. Préchauffer filtrée EGM-2 à 37 ° C dans un bain d&#39;eau </li><li> Recueillir des échantillons de sang par le dessin 5 ml de sang périphérique adulte humain de la veine cubitale dans un sans conservateur 6ml de sodium d&#39;héparine tube Vacutainer sang. Vous devez traiter les échantillons de sang dans un délai maximum de deux heures. </li><li> Commencez par préparer un 75 cm 2 (T75; Costar) fiole avec un bouchon à évent, une pipette 25 ml et deux pipettes 5 ml dans un banc de flux laminaire. </li><li> Pré-remplissage de 15 ml pré-chauffé complété EGM-2 dans le ballon avec la pipette de 25 ml. Maintenant, ouvrez le flacon d&#39;échantillon de sang et tous les 5 ml à la pipette 5 ml dans le flacon. Rincer la fiole de sang vides avec 5 ml d&#39;supplémentaires EGM-2 avec la seconde pipette 5 ml. Le volume total au sein du T75 est de 25 ml. Fermez le bouchon à évent-du flacon et le placer dans une étuve à 37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d&#39;humidité pendant 24 heures. </li></ol> JOUR 2: <ol><li> Après environ 24 heures (une nuit), vous devriez retirer le mélange du sang moyen de se débarrasser des cellules non adhérentes. Pour préparer ces deux pipettes 25 ml et trois 5 pipettes ml dans le flux laminaire, préchauffer de 20 ml de compléter EGM-2 (préparée le jour précédent) et 30 ml de PBS à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Retirer le ballon avec l&#39;échantillon de l&#39;incubateur et supprimer tous les surnageant avec une pipette de 25 ml. Prenez soin de ne pas rayer la surface flacon pour éviter d&#39;endommager toute colonie potentiels. Lavez la surface intérieure des cellules flacon adhésion à trois reprises par délicatement en ajoutant 10 ml de PBS préchauffé et en inclinant le flacon d&#39;un côté à l&#39;autre. Retirez le CPE immédiatement à chaque fois et les jeter. </li><li> Ajouter 20 ml de frais préchauffé EGM-2 dans le ballon et le replacer dans l&#39;incubateur. Ce processus devrait être effectué aussi rapidement que possible et en douceur pour les cellules attachée à ne pas se détacher. CPEF détachent facilement si elles sont conservées dans du PBS ou à température ambiante pendant trop longtemps. </li><li> Ecran à travers le ballon systémique tous les deux jours à partir de deux jours en utilisant un faible grossissement d&#39;un microscope optique à la recherche d&#39;excroissance ECFC. Quand une colonie se trouve la marque sur le dessus sur le côté extérieur de la fiole en indiquant la position de la colonie. Notez que le Flaks ne doit pas être en dehors de l&#39;incubateur pendant plus de 5 minutes. </li></ol> JOUR 5: <ol><li> Le cinquième jour après le semis effectuer un changement de milieu complet pour enlever des cellules non adhérentes. Pour ce faire préchauffer 20 ml d&#39;EGM-2 à 37 ° C dans un bain d&#39;eau et de préparer deux pipettes 25 ml. </li><li> Retirez le support complet à l&#39;aide d&#39;une pipette de 25 ml et ajouter frais, préchauffé EGM-2 complété dès que possible. Les cellules ne devraient pas être laissés sans moyen de plus d&#39;une minute pour éviter le dessèchement. Placez de nouveau dans l&#39;incubateur et répéter le test du ballon quotidien. </li><li> Alimenter les cellules en remplaçant 30% de la moyenne par les frais complété EGM-2 deux fois par semaine. </li></ol> JOUR 14-28: <ol><li> Les colonies typiques de morphologie pavées devrait apparaître autour de 12 jours. Marquer le côté supérieur extérieur de la fiole d&#39;indiquer la position de chaque colonie. Autoriser les colonies de croître jusqu&#39;à ce jour 28 cellules individuelles à moins de commencer à se détacher. Une fois, des colonies primaires ont été identifiés, ils peuvent être récoltés entre 14 et 28 jours, en fonction de leur taille. </li></ol> B.) ECFC MOISSON <ol><li> Pré-chaud 5 ml de trypsine 0,05% / EDTA, 20 ml de PBS et 5ml frais complété EGM-2. </li><li> Complètement éliminer le milieu de la fiole dans un tube Falcon (prendre soin de ne pas toucher la surface du flacon pour éviter d&#39;endommager toute colonie potentiel) et se laver soigneusement les cellules avec 10 ml de PBS préchauffé. </li><li> Ajouter 5 ml de trypsine / EDTA et incuber pendant 5 minutes dans l&#39;incubateur. Les cellules ne devraient pas être exposés à la trypsine pendant plus de 7 min, car il devient toxique. Bien tapotant les côtés de la fiole aide les cellules à se détacher. Quench activité de la protéase trypsine en ajoutant environ 10 ml du milieu de culture utilisé préservée. </li><li> Retirez la suspension cellulaire dans un Falco 50 mlTube n. Laver le ballon une fois avec 10 ml de PBS qui est ensuite ajouté à la suspension de cellules récoltées. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 g pendant 7 min à 4 ° C pour collecter les cellules et enlever la trypsine. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire immédiatement dans 1 ml de PBS. Restez sur la glace. </li><li> Déterminer le nombre de cellules comme décrit dans un protocole JoVE par R. Ricardo et K. Phelani 5. </li></ol> C) ECFC EXPANSION <ol><li> Supplément de 500 ml EGM-2 tel que décrit dans A 1.1). Préchauffer à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Pour environ 2500 cm 2 d&#39;espace de culture de préparer une usine soit 11 T220 (225 cm 2) ou 15 T175 (175 cm 2) ou une cellule de quatre couches (FC-4; Nunc, Chicago, IL; <a href="http://www.nuncbrand.com/">http://www.nuncbrand . com</a> ). En outre, vous aurez besoin de deux nouvelles évent-bouchons et un entonnoir stérile spécial dans le banc d&#39;écoulement laminaire. </li><li> Pour CPEF semences à une densité cellulaire initiale de 100 c / cm 2 de calcul du nombre de cellules est nécessaire. Pour un CF-4 252 800 cellules sont resuspendues dans 500 ml fraîche EGM-2 et versé dans les FC-4 en utilisant l&#39;entonnoir stérile. Fermer un évent à l&#39;évent de plafonnement et d&#39;incliner le CF-4 d&#39;un côté de longitude, ce qui permet une répartition égale du milieu entre les 4 farines. Puis inclinez la chambre arrière et ouvrez le couvercle de l&#39;évent-bouchon. Placez CF-4 dans l&#39;incubateur. </li><li> Changer 20% de la moyenne au moins une fois par semaine jusqu&#39;à FC-4 est confluente. </li><li> Récolte des cellules comme décrit dans B.) en utilisant 70 ml de trypsine / EDTA et environ 200 ml de PBS. </li></ol> Les résultats représentatifs En utilisant cette méthode d&#39;isolement, nous avons observé une formation de colonies primaires au jour 12. Dans une étude précédente ont été en mesure de récupérer une moyenne de 4,0 ± 0,8 ECFC-colonies issues de chaque ml de sang périphérique. 4 CPEF a montré un aspect typique en pierre de galets. Après l&#39;expansion à grande échelle, avec une densité de semis de 100 cellules / cm 2, nous avons obtenu&gt; 1 x 10 8 cellules pour un total d&#39;environ 30 jours à partir de 3 hommes et 1 femmes volontaires (âge compris entre 26 et 50 ans). ECFC cultivés dans ces conditions se sont avérés être proliférative, fonctionnelle et génomiquement stable. 4 En outre les cellules peuvent être stockés (dans 10% de DMSO) dans l&#39;azote liquide pour une utilisation ultérieure. 3,4

<ol><li>Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+endothelial+cells+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia.</a> N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).</li>
<li>Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Cet isolement roman et la méthode d&#39;extension est un processus simple et efficace qui est plus efficace et moins de temps en évitant toute séparation des cellules (pas de gradient de densité nécessaire) et moins coûteux que les techniques conventionnelles. En utilisant de contact pHPL aux antigènes putatifs bovine et xenoimmunization ultérieure est exclue. Pendant la période de la culture des petits caillots peuvent se former, causée par la pHPL. Basé sur notre expérience de ces caillots n&#39;affectent pas la forma...

<table><tbody><tr><td>Milieu basal endothélial-2</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>500 ml</td></tr><tr><td>SingleQuots EGM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, hydrocortisone, acide ascorbique</td></tr><tr><td>Héparine sans conservateur</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td>10 U/ml par EGM-2</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>2 mM par EGM-2</td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100 U/mL de pénicilline et&lt;br/&gt;100&amp;#x03BC;g/mL de streptomycine par&lt;br/&gt;EGM-2</td></tr><tr><td>Tripsine/EDTA 1 mM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>7 ml pour flacon T75&lt;br/&gt;70 ml pour CF-4</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Usine à cellules quadruple (CF-4)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Entonnoir stérile</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture T75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; (avec bouchon ventilé)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes vacutainer de 6 mL (héparinate de sodium sans conservateur)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>préchargés avec 108 UI/6 ml d'héparinate&lt;br/&gt;de sodium sans conservateur</td></tr><tr><td>Tubes Falcon de 50 ml</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripets de 5 ml</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripets de 25 ml</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Squeezer</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre stérile à pores de 0,2</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>2 × 500 ml par EGM-2</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines colony forming progénitrices endothéliales

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Ce document présente une stratégie de rétablissement pour le roman de cellules progénitrices endothéliales formant colonie (CPEF) de l&#39;héparine mais autrement non manipulés pour adultes sang périphérique humain au sein d&#39;une moyenne de 12 jours. Après l&#39;expansion à grande échelle&gt; 1x10 8 CPEF peuvent être obtenus pour d&#39;autres essais. Avantageusement en utilisant pHPL le contact des cellules humaines avec bovin antigènes sériques peut être exclue. Par cytométrie en flux et par immunohistochimie des cellules isolées peuvent être caractérisés comme ECFC et leur fonctionnalité dans vitro pour former des structures vasculaires peuvent être testés dans un essai de Matrigel. De plus, ces cellules peuvent être injectées par voie sous cutanée dans un modèle de souris pour la forme fonctionnelle, des vaisseaux perfusés in vivo. Après l&#39;expansion à long terme et la prolifération cryoconservation, la fonction et la stabilité génomique semblent être préservées 3,4. Cet isolement des animaux en protéines libres et méthode d&#39;expansion est facilement applicable à générer une grande quantité de CPEF.

Cellules endothéliales progénitrices formant colonie (CPEF) sont un outil prometteur pour étudier l&#39;homéostasie vasculaire et de réparation.<sup&gt; 1,2</sup&gt; Cet article présente une nouvelle méthode de sérum animal-libres pour l&#39;isolement et l&#39;expansion de ECFC partir hépariné sang adultes périphérique humain avec des mises en commun lysat plaquettaire humain (pHPL) diminue le risque de la vaccination anti-bovin.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

Cet article présente une nouvelle stratégie de récupération des cellules progénitrices formant des colonies endothéliales (ECFC) à partir de sang adulte héparinisé mais non manipulé autrement...

En cultivant simplement le sang total dans un milieu optimisé sans sérum d'origine animale. Dans un flacon de 75 centimètres carrés, les E CFC adhèrent à la surface du flacon, éliminant ainsi la majorité des globules rouges et des globules blancs. Laver le flacon au jour un et éliminer les cellules restantes en changeant le milieu total au jour cinq.Continuez la sélection des colonies tous les deux jours, ou si cela vous convient, trois fois par semaine. Vous devriez observer les premières colonies vers le jour 12. Bonjour, je m'appelle Nicole Hoffman du laboratoire de l'Unité de recherche sur les cellules souches de l'Université de médecine grots.Aujourd'hui, nous allons vous présenter un processus simplifié pour l'isolement et l'expansion de cellules progénitrices formant des colonies endothéliales, ou ECFC, à partir du sang périphérique humain adulte. Dans notre laboratoire, nous utilisons ce protocole pour étudier la fonction et la biologie des ECFC in vitro et in vivo. Commençons donc.Cette section commence par la préparation et la stérilisation par filtration du milieu de croissance endothélial deux, qui sera utilisé pour la culture. Les CFE préchauffent 20 millilitres de milieu dans un bain-marie à 37 degrés. Prélevez cinq millilitres de sang périphérique humain adulte à partir de la veine cubitale dans un tube vacutainer de six millilitres contenant de l'héparine sodique sans conservateur.Les échantillons de sang doivent être traités dans les deux heures suivant leur prélèvement dans une hotte à flux laminaire. Utilisez un flacon de 75 centimètres carrés avec un bouchon ventilé, une pipette de 25 millilitres et deux pipettes de cinq millilitres dans une hotte à flux laminaire. Utilisez une pipette de 25 millilitres pour remplir préalablement le flacon avec 15 millilitres de milieu E GM deux supplémenté préchauffé.Ouvrez le flacon de sang et utilisez la pipette de cinq millilitres pour transférer directement les cinq millilitres de sang dans le flacon. Utilisez la pipette pour rincer le flacon vide de sang avec les cinq millilitres restants de milieu E GM deux pré-chauffé. Ajoutez ce volume au flacon.Fermer le bouchon ventilé du flacon, qui doit maintenant contenir 25 millilitres. Placer le flacon dans un incubateur réglé à 37 degrés, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'humidité pendant 24 heures. Le jour suivant, préchauffer 20 millilitres de e GM deux supplémenté et 30 millilitres de PBS dans un bain-marie à 37 degrés, et disposer 2 pipettes de 25 millilitres et trois pipettes de 10 millilitres dans une hotte à flux laminaire.Retirer le flacon contenant l'échantillon de l'incubateur et utiliser une pipette de 25 millilitres pour éliminer une partie du mélange sanguin qui contient les cellules non adhérentes. Prendre soin de ne pas rayer la surface du flacon avec la pipette. Pour éviter de détacher les cellules adhérentes, ajouter délicatement 10 millilitres de PBS préchauffé sur la surface interne du flacon où les cellules sont adhérentes, puis incliner le flacon d'un côté à l'autre.Retirez et jetez immédiatement le PBS. Répétez cette étape, effectuez deux lavages. Ensuite, travaillez rapidement et délicatement.Pour éviter de détacher les cellules, ajouter 20 millilitres de milieu EGM-2 frais préchauffé dans le flacon et le replacer dans l'incubateur. En prenant soin de ne pas laisser le flacon hors de l'incubateur plus de cinq minutes, utiliser un microscope optique à faible grossissement pour vérifier tous les deux jours la prolifération des ECFC dans le flacon. À partir du deuxième jour et jusqu'au cinquième jour suivant la mise en culture, préchauffer 20 millilitres d'EGM-2 dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et préparer 2 pipettes de 25 millilitres.Travailler rapidement pour éviter le dessèchement. Utiliser ces fournitures pour remplacer le milieu par du e GM deux complété frais préchauffé, ce qui éliminera les cellules non adhérentes. Remettre le flacon dans l’incubateur et répéter le processus de sélection quotidiennement.Remplacer 30 % du milieu par de l'EGM fraîchement supplémenté. Deux fois par semaine. Des colonies typiques présentant une morphologie en pavé devraient apparaître vers le jour 12.Marquez le côté externe supérieur du flacon pour indiquer la position de chaque colonie. Laissez les colonies croître jusqu'au jour 28, sauf si des cellules isolées commencent à se détacher. Une fois les colonies primaires identifiées, elles peuvent être récoltées entre les jours 14 et 28 selon leur taille.Préchauffez cinq millilitres d'une solution de trypsine-EDTA et 20 millilitres de PBS à 37 degrés. En prenant soin de ne pas toucher la surface du flacon, transférez tout le milieu dans un tube Falcon. Ce dernier servira ultérieurement à inhiber l'activité de la trypsine et à laver soigneusement les cellules avec 10 millilitres de PBS préchauffé.Ajoutez cinq millilitres de tripsine-EDTA et incubez la solution pendant environ cinq minutes à 37 degrés ou jusqu'à ce que les cellules se détachent. Veillez à ne pas dépasser sept minutes d'incubation, car la tripsine peut devenir toxique pour les cellules après cette durée ; donnez de légers coups fermes sur les parois du flacon pour favoriser le détachement des cellules une fois la réaction terminée. Inhibez l'activité protéasique de la tripsine en ajoutant environ 10 millilitres du milieu de culture utilisé et conservé.Transférez la suspension cellulaire dans un tube Falcon de 50 millilitres. Lavez le flacon une fois avec 10 millilitres de PBS et ajoutez la solution de lavage à la suspension cellulaire récoltée. Faites centrifuger la suspension cellulaire à 300 ×g pendant sept minutes dans une centrifugeuse réfrigérée afin de recueillir les cellules et d'éliminer la trypsine, jetez le surnageant et remettez immédiatement le culot cellulaire en suspension dans un millilitre de PBS.Gardez les cellules en suspension sur de la glace. Déterminez le nombre de cellules comme décrit dans un autre protocole JoVE par Ricardo et Phelan. Puis passez à l'expansion des ECFC.Dans le cas où plus de 360 000 CFC-E sont récupérées, passez à l'étape d'expansion ; en revanche, si moins de 260 000 CFC-E sont récupérées, envisagez d'élargir davantage la culture avant l'expansion à grande échelle. Pour ce faire, semez environ 75 000 CFC-E dans 20 millilitres de milieu EGM-2 dans un flacon de culture cellulaire de 75 centimètres carrés et cultivez pendant une semaine supplémentaire ou jusqu'à atteinte de la confluence.Complétez 500 millilitres de E GM deux comme décrit dans le protocole écrit joint et préchauffez ce mélange dans un bain-marie à 37 degrés. Pour chaque surface de culture d’environ 2 500 centimètres carrés, préparez un cell factory à quatre étages ou CA quatre. En outre, rassemblez deux bouchons Tyvek neufs et une poire stérile spéciale, puis stockez-les dans la hotte à flux laminaire afin de semer les E CFC à une densité cellulaire initiale de 100 cellules par centimètre carré.Tout d'abord, calculez le nombre de cellules pour chaque CF quatre 250.2, 800. Les cellules sont remises en suspension dans 500 millilitres de E GM deux frais et versées dans le CF quatre. À l'aide d'une éprouvette stérile, utilisez le bouchon recouvert de Tyvek pour fermer un orifice et inclinez le CF quatre sur un côté longitudinal afin d'assurer une répartition uniforme du milieu entre les quatre niveaux.Maintenant, la chambre peut être inclinée vers l'arrière et le couvercle du bouchon Tyvek peut être ouvert. Veillez à protéger les orifices d'aération ouverts à l'aide de deux bouchons rouges. Ces bouchons peuvent être achetés avec le CF four lors du transport vers l'incubateur.Placer le CF4 dans l’incubateur et retirer les bouchons rouges pour permettre les échanges gazeux ; renouveler 20 % du milieu avec du milieu préchauffé au moins une fois par semaine jusqu’à ce que le CF4 soit confluent. Ce processus dépend du donneur et se produira probablement après 10 à 14 jours. Enfin, les cellules peuvent être récoltées comme décrit précédemment en utilisant de la trypsine-EDTA préchauffée et le milieu utilisé pour inhiber l’activité protéasique.En outre, utilisez environ 200 millilitres de PVS pour le lavage vers le jour 12. Les colonies de CEFC commenceront à apparaître avec une morphologie typique en pavé, comme vous pouvez le voir dans cette colonie, ou sous forme de quelques cellules regroupées, comme dans cette colonie observée au jour 12. Au fur et à mesure que les colonies grandissent, davantage de cellules adoptent la morphologie en pavé caractéristique.Comme vous pouvez le voir ici, après 15 jours et après 18 jours par immunochimie, les CFC-e isolées peuvent être caractérisées à l’aide de marqueurs typiques de la surface des cellules endothéliales, tels que CD146, CD144, CD31 en fermentation et le facteur de von Willebrand. Nous venons de vous montrer comment isoler et amplifier des cellules progénitrices formant des colonies endothéliales à partir du sang périphérique humain adulte lors de cette procédure. Il est important de se rappeler que le taux de réussite de ce protocole dépend du donneur et varie de 50 à 70 %. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Ce protocole décrit l'isolement et à l'expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l'utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

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Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

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Isolement de cellules progénitrices endothéliales de volontaires sains et de leur potentiel migratoire Influencé par échantillons de sérum après chirurgie cardiaque

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

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Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

Le système d'analyse sphéroïque de co-culture tridimensionnaux est conçu pour imiter l'angiogenèse physiologique. Les sphéroïdes de co-culture sont formés par deux précurseurs de cellules vasculaires humaines, Les ECFC et les MSC, et incorporés dans le gel de collagène. Le nouveau système est efficace pour évaluer les modulateurs angiogéniques, et fournit des informations plus pertinentes à l'étude in vivo.

Système d'analyse d'angiogenèse tridimensionnel utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par des cellules de formation de colonies endothéliales et des cellules souches mésenchymales

Présenté ici est un protocole simple pour la différenciation dirigée des cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines en environ 1 semaine.

Différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Découvrez une méthode sans sérum animal pour isoler et amplifier les cellules progénitrices endothéliales ECFC à partir de sang périphérique humain adulte. Cette approche utilise le lysat plaquettaire humain pHPL pour réduire les risques d'immunisation.

L'isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

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