Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

Ce protocole décrit l'isolement et à l'expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l'utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Le cordon ombilical humain est une source facilement accessible de cellules progénitrices. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l’isolement et l’expansion ultérieure des progéniteurs endothéliales e CFC, une sous-population de cellules à l’intérieur de la paroi vasculaire et des cellules progénitrices mésenchymateuses. CSM dérivées d’un seul cordon ombilical humain.

D’abord, à l’aide de ciseaux longitudinalement, coupez le long de la veine ombilicale humaine et grattez les cellules de la surface interne du vaisseau. Transférez les cellules du grattoir dans une fiole et attendez la croissance de la colonie. Certaines des cellules grattées présenteront un phénotype progéniteur et proliféreront fortement pour former de grandes colonies.

Une fois que ces cellules ont proliféré, les e CFC peuvent être expansés dans de nouveaux flacons. Pour une analyse plus approfondie, une population de cellules mésenchymateuses peut également être isolée du cordon ombilical humain. Coupez des parties du cordon en petits morceaux et transférez-les dans une plaque de culture stérile.

Après quelques jours, l’excroissance des cellules stromales sera visible autour des morceaux de tissu du cordon intervasculaire. Transférez ces cellules dans de nouveaux flacons et élargissez-les pour une analyse plus approfondie. Ce protocole vous permet d’obtenir deux types de lignées de cellules progénitrices à partir d’un seul cordon de matériel de départ en trois à quatre semaines.

Bonjour, je m’appelle Andreas Danish et je travaille dans le laboratoire du Dr T Strong dans une unité de recherche sur les cellules souches de l’Université de médecine des Grads en Autriche. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour l’isolement, l’expansion et l’analyse des cellules des canaux mésenchymateux et endothéliales humains à partir d’un code ombilical. Juste une remarque sur la terminologie.

Nos cellules sont appelées cellules stromales mésenchymateuses multipotentes, ou MSE, et le côlon endothélial formant des cellules pro ou e CSC. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la fonction et la biologie des cellules progénitrices non hématiques. Alors commençons.

Avant les étapes d’isolement cellulaire, essuyez le capot de culture tissulaire à flux laminaire avec de l’inadine et rassemblez des plaques de culture cellulaire stériles. Des flacons de culture cellulaire, des instruments chirurgicaux stérilisés au PBS, des grattoirs cellulaires, un porte-tube, des bandelettes de 25 millilitres et une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille à extrémité émoussée. N’oubliez pas de préchauffer le milieu de culture à deux cellules alpha MEM et EGM dans un bain d’eau à 37 degrés.

Transférez maintenant le cordon ombilical dans le flux laminaire et lavez-le deux fois dans du PBS. Pour éliminer le sang contaminant, utilisez une seringue stérile de cinq millilitres pour canuler la veine du cordon d’un côté. Maintenant, rincez la veine ombilicale avec du PBS jusqu’à ce que le liquide s’écoule.

L’autre extrémité du cordon devient complètement transparente sans teinte rouge. Commencez l’isolement des cellules progénitrices formant une colonie endothéliale en remplissant un flacon de 75 centimètres carrés avec 15 à 20 millilitres de milieu EGM deux préchauffé. Placez le cordon dans une nouvelle plaque remplie de PBS stérile et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper le cordon en deux morceaux d’environ cinq centimètres de long chacun.

Insérez maintenant une lame des ciseaux chirurgicaux et coupez la veine longitudinalement. À ce stade, un assistant peut utiliser des pinces pour maintenir la veine pendant que d’autres coupes sont effectuées. Placez le cordon avec la veine ouverte dans une nouvelle plaque.

Sans PBS, utilisez un grattoir cellulaire pour frotter la surface interne de la veine sur une zone d’au moins un centimètre. Lavez le grattoir dans le milieu EGM two pour libérer les cellules des vaisseaux frottées dans le ballon. Cette procédure devra être répétée jusqu’à 10 fois.

Fermez le flacon et mettez-le dans un incubateur réglé à 37 degrés, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité. Maintenant que les CFC électroniques ont été isolés, passons aux CSM. Maintenant que la couche endothéliale a été grattée, utilisez un scalpel stérile pour couper le cordon en très petits morceaux.

Un à deux millimètres. Utilisez au maximum des pinces stériles pour transférer ces morceaux dans une plaque de culture pré-étiquetée. Laissez la plaque ouverte pendant au moins cinq minutes avant de la remplir de fluide pour permettre aux morceaux d’adhérer à la surface en plastique.

En utilisant la vitesse la plus basse possible, ajoutez doucement 30 à 35 millilitres de MEM préchauffé alpha modifié. Fermez l’assiette et placez-la dans un incubateur réglé à 37 degrés avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité. L’excroissance des cellules stromales mésenchymateuses à partir des morceaux de cordon prendra trois à sept jours, après quoi les cellules pourront être dilatées.

Pendant ce temps, ECFC peut être étendu, ce qui vous montrera à l’étape suivante. Le lendemain, utilisez un microscope inversé pour examiner les cellules. Si la procédure de raclage a été effectuée correctement, les premiers amas de cellules en prolifération seront complètement visibles.

Remplacez le milieu E GM two pour éliminer toutes les cellules et particules non attachées. Continuez à élargir les cellules et à échanger un tiers du milieu deux fois par semaine. Après 10 à 12 jours, de très grandes colonies endothéliales seront régulièrement observées.

Maintenant, retirez le milieu et lavez-le avec du PBS pour vous débarrasser de l’utilisation restante de protéines. 0,05 % de trypsine 0,7 millimolaire EDTA pour détacher les cellules. Lors du transfert de cellules dans de nouveaux récipients de culture, assurez-vous de choisir des flacons de taille appropriée pour obtenir une faible densité de semis.

Cela contribuera à une expansion ultérieure. Notre laboratoire récupère généralement la descendance de plus de 20 grandes colonies dans quatre flacons de deux cent vingt-cinq centimètres carrés. N’oubliez pas de remplacer un tiers du support deux fois par semaine.

Un protocole similaire est utilisé pour l’expansion de MSC dans la section suivante. Une fois que trois à sept jours se sont écoulés, utilisez un microscope inversé pour vérifier l’apparition de cellules en forme de fuseau près du tissu attaché. Lorsqu’il y a suffisamment de croissance cellulaire, les morceaux ont tendance à se fixer car ils perdent le contact avec le plastique.

Après 10 à 12 jours, retirez les morceaux de tissu. Détacher les CSM du plastique à l’aide d’une solution de trypsine EDTA et transférer les cellules dans de nouveaux flacons de culture préremplis de milieu de taille et de nombre appropriés pour garantir une faible densité d’ensemencement pendant l’expansion cellulaire. Il sera nécessaire de remplacer un tiers du milieu deux fois par semaine une fois que les deux types de cellules auront été élargis.

Une coloration suivie d’une cytométrie en flux peut être effectuée pour détecter l’expression de marqueurs de surface cellulaire indiquant des phénotypes progéniteurs et déterminer qu’il n’y a pas de contamination par des cellules hématopoïétiques. Semez les e CFC purs récoltés à une très faible densité de placage de trois ou 10 cellules par centimètre carré dans des plaques de culture cellulaire pour garantir la croissance d’une seule colonie Échangez un tiers du milieu deux fois par semaine après 14 jours. La fin de la culture.

Retirer le support. Lavez deux fois avec du PBS et fixez les colonies avec une solution de fixation glacée Pendant 15 minutes au réfrigérateur, jetez la solution de fixation et laissez les plaques ouvertes pour sécher pendant 10 minutes. Réhydratez les cellules avec de l’eau distillée pendant 10 minutes.

Ajouter la solution d’hématine Harris et colorer les colonies fixées pendant 12 minutes. Retirez la solution d’hématine et rincez les plaques à l’eau du robinet. Pour se débarrasser de la solution de coloration restante.

Prenez des photos de chaque colonie à l’aide d’un stéréomicroscope et importez des fichiers au format jpeg ou TIFF sur votre ordinateur. Ouvrez les photos avec le logiciel image J et analysez le numéro de cellule précis de chaque colonie comme décrit dans l’animation suivante. Ouvrez le logiciel image J et importez une image de colonie à l’aide de la fonction d’ouverture de fichier dans le menu déroulant.

Procédez à l’aide du processus. Soustraire la fonction d’arrière-plan. Utilisez la fonction de sélection elliptique ou au pinceau dans le menu de l’image J pour marquer la marge de la colonie.

Effacez l’image environnante à l’aide de la fonction d’édition effacer l’extérieur et recadrez l’image en sélectionnant le recadrage de l’image. Ajustez le seuil manuellement à l’aide de la fonction de réglage du seuil d’image afin que toutes les cellules soient complètement colorées. Rouge. Comptez le numéro de cellule de la colonie en le sélectionnant.

Analysez, analysez des particules. Choisissez les paramètres appropriés optimisés pour chaque type de cellule et sélectionnez OK Si exécuté correctement. Ce protocole permet d’isoler une population pratiquement pure de cellules qui partagent les caractéristiques des cellules progénitrices endothéliales et mésenchymateuses humaines, qui sont autologues les unes aux autres parce qu’elles sont dérivées du même cordon.

À partir du cinquième jour, des cellules mésenchymateuses en forme de fuseau apparaîtront sous le morceau de cordon attaché à la plaque de culture. Après un à deux jours, les premiers amas de colonies endothéliales formant des cellules progénitrices ou CFC deviendront visibles au microscope inversé. Cette énorme colonie de CFC en croissance rapide s’est formée après 11 jours.

Les CSM et les CFC E peuvent être adoptés et élargis. Nous recommandons une analyse ultérieure de tous les produits de culture à l’aide de la cytométrie en flux pour confirmer le phénotype approprié. N’oubliez pas que les lignées endothéliale et mésenchyme réagissent aux anticorps spécifiques du CD 73, du CD 1 46, du CD 29 et du CD 1 0 5.

Notons que les CSM exprimaient la première cuisse, qui a été détectée à l’aide d’un anticorps anti CD 90. Les E CFC sont positifs pour le CD 31, également appelé molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires ou pcam. Il est bien établi que l’expression de l’immunoréactivité du CD 34 dans le cordon par les CFC E peut être réduite par des cultures répétées.

Les marqueurs de cellules sanguines tels que CD 45, H-L-A-D-R et CD 14 sont restés négatifs pour les deux types de cellules. La hiérarchie des cellules progénitrices parmi les CFC E peut être évaluée à l’aide du logiciel Image J en comptant le nombre précis de cellules de chaque colonie. Nous venons de vous montrer comment isoler, développer et analyser les masses et les ECE à partir d’un code ombilical humain lors de cette procédure.

Il est important de travailler dans des conditions stériles et de vérifier le phénotype et la pureté avant d’utiliser les cellules dans des études ultérieures. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.