Visualisation de la réplication d'ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

Dans cette technique, les lamelles de verre sont fonctionnalisées avec un mélange de molécules inertes et de chevilles de biotine. Une cellule d’écoulement est créée avec cette surface fonctionnalisée et placée sur un microscope à gazon. Des matrices de cercle roulant biotinylées sont fixées à la surface à l’aide de streptavidine multivalente.

Lorsque les substrats sont répliqués par l’ajout de protéines et de nucléotides de la zone de réplication, l’ADN double brin résultant est étendu par flux laminaire et imagé en temps réel à l’aide d’un colorant inter-assemblage. Bonjour, je suis Nathan Tanner du laboratoire d’Antoine Van Ian au Département de chimie biologique et de pharmacologie moléculaire de la Harvard Medical School. Je m’appelle Joe Laro, je travaille également dans le laboratoire Van Noian.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’imagerie par fluorescence de la réplication de l’ADN en temps réel au niveau de la molécule unique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les activités coordonnées de synthèse d’ADN de complexes de réplication individuels. Alors commençons.

Pour commencer cette procédure, il faut associer l’oligo de queue biotinylé à l’ADN simple brin M 13 en ajoutant un excès d’oligo dix fois supérieur dans le chauffage du tampon TBS à 65 degrés Celsius, puis en désactivant le bloc de chaleur pour permettre un refroidissement lent afin d’anéler correctement l’amorce. Maintenant que le premier M 13 est prêt, ajoutez-le à un mélange de 64 nanomolaires d’ADN polymérase T sept et de tampon de réplication T sept contenant des D NDP et du chlorure de magnésium et incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant 12 minutes. À la fin de l’incubation, tremper avec de l’EDTA de 100 millimolaires.

Ensuite, purifiez l’ADN du produit rempli avec du phénol isoamyl alcool chloroforme, extrayez et dialysez dans un tampon TE ou un autre tampon de stockage approprié, extrayez chaque phase organique pour récupérer tout résidu amorcé. M 13 après dialyse déterminer la concentration d’ADN avec un spectrophotomètre UV-vis. Une itération de la préparation de la matrice peut produire une concentration nanomolaire suffisante de matrice pour des centaines, voire des milliers d’expériences sur une seule molécule.

Maintenant que l’ADN est prêt, procédez à la préparation des bordereaux de protection fonctionnalisés. L’ADN à répliquer est attaché à des lamelles de verre fonctionnalisées avec Amil Lane, le groupe Oxy de l’Amil se lie au verre, laissant un amin disponible pour lier les molécules de cheville biotinylées. Ce revêtement aide à réduire les liaisons non spécifiques à la surface.

Pour bien nettoyer les lamelles en verre, placez-les dans des bocaux tachés et remplissez les bocaux de sonicate d’éthanol. Pendant 30 minutes, rincez les bocaux et remplissez-les d’une molaire d’hydroxyde de potassium Sonicate pendant 30 minutes et répétez les deux lavages. Pour la première réaction de fonctionnalisation, toutes les traces d’eau doivent être éliminées.

Remplissez les pots de coloration d’acétone et de sonicate pendant 10 minutes. Videz les bocaux et remplissez-les à nouveau d’acétone. Procédez à l’ajout du réactif sinus dans les bocaux et agitez pendant deux minutes.

Ensuite, trempez avec un grand excès d’eau. Séchez ensuite les lamelles en les faisant cuire à 110 degrés Celsius au four pendant 30 minutes. Ensuite, préparez le mélange PEG à environ 0,2 % de poids par volume à l’aide d’une cheville intégrée, y compris une entretoise de couvercle en verre permettra de séparer les lamelles de couverture, pipette 100 microlitres sur une lamelle sèche siloisée.

Placez une deuxième lamelle sur le dessus. Incuber les lamelles dans la solution PEG pendant trois heures. Ensuite, séparez chaque paire de lamelles et lavez-les abondamment à l’eau.

Veillez à garder les lamelles fonctionnalisées vers le haut car un seul côté sera recouvert d’une cheville. Enfin, séchez les lamelles à l’air comprimé et stockez-les sous vide dans un dessiccation, les surfaces restent stables pendant au moins un mois. Ainsi, des dizaines de lamelles peuvent être fabriquées en un lot et utilisées au besoin.

Maintenant que les lamelles sont prêtes, on peut assembler la chambre d’écoulement pour l’expérience sur une molécule unique. Commencez par placer 20 à 25 millilitres de tampon de blocage contenant du BSA dans un dessiccation pour éliminer les bulles d’air pour les étapes ultérieures. Ensuite, diluez 25 microlitres de streptavidine dans 100 microlitres de PBS et étalez la solution sur la surface d’une gaine fonctionnalisée pendant 20 minutes à température ambiante pour permettre à la streptavidine de se lier à la biotine de surface tout en préparant d’autres parties de la chambre.

Pendant que la lamelle est en train d’incuber, coupez un morceau de ruban adhésif double face avec un support des deux côtés de manière à ce qu’il corresponde à la taille de la lame de quartz utilisée pour assembler la chambre d’écoulement. Marquez la position des trous de tube sur le ruban avec un crayon afin qu’un contour de la chambre d’écoulement puisse être dessiné sur le ruban. Après avoir marqué les trous, faites un rectangle de deux millimètres de large autour des marquages.

Ce rectangle servira de canal d’écoulement, alors assurez-vous de faire des côtés droits et de laisser de l’espace autour de l’entrée et de la sortie du tube. Coupez maintenant le ruban marqué le long du contour dessiné, en faisant des coupes droites et nettes pour vous assurer qu’aucun adhésif ne dépasse dans le canal. Nettoyez soigneusement la lame de quartz à l’aide d’acétone pour enlever l’adhésif de la construction des cellules d’écoulement utilisée dans les expériences précédentes.

Trouvez le meilleur alignement du contour du canal. Retirez un côté du support adhésif et placez soigneusement le ruban adhésif sur la glissière du terrain. Veillez à bien aligner le ruban car les trous d’entrée et de sortie doivent rester débloqués.

Ensuite, préparez les longueurs de coupe de tube de 0,76 millimètre pour l’entrée et la sortie de la cellule d’écoulement. Il est utile de couper l’extrémité du tube à un angle d’environ 30 degrés afin que le tube n’appuie pas à plat contre le fond de la chambre. Suspendez le tube sur des supports de tubes à essai pour une fixation facile à la cellule d’écoulement dans les étapes suivantes.

L’incubation de la lamelle de couverture est maintenant terminée. Rincez soigneusement la housse enduite d’ENC streptocoque avid à l’eau et séchez-la à l’air comprimé. Attention à ne pas retourner la housse car un seul côté est fonctionnalisé.

Enfin, terminez l’assemblage de la chambre d’écoulement en retirant l’autre côté du support du ruban et en plaçant la glissière en quartz sur la lamelle. Appuyez légèrement sur la lamelle pour expulser l’air emprisonné dans l’adhésif. Cela aidera à empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le canal d’écoulement.

Scellez les côtés de la chambre avec de l’époxy. Insérez le tube coupé dans les trous du quartz et scellez-le en place avec de l’époxy et laissez sécher pendant quelques minutes. Lorsque le joint époxy est sec, commencez à bloquer la surface.

À l’aide d’une aiguille de calibre 21. Tirez une partie du tampon de blocage Degas à travers l’un des tubes. Rincez plusieurs fois pour éliminer les bulles d’air et laissez la chambre incuber pendant au moins une demi-heure avant de passer à la réplication de la molécule unique. Expérience.

Maintenant que la cellule d’écoulement a été bloquée, placez-la sur la platine du microscope. Maintenez la chambre en place à l’aide de clips de platine et assurez-vous que le canal d’écoulement est aligné le long de l’axe y. Connectez le tube de sortie de la cellule d’écoulement à la pompe à seringue à l’aide d’un tube de connecteur de plus grand diamètre.

Placez l’entrée dans le tampon de blocage et tirez sur la seringue pour éliminer tout air dans le tube. Une légère secousse du tube de sortie aidera à éliminer toutes les bulles d’air emprisonnées dans la cellule d’écoulement. Ajoutez maintenant l’ADN, diluez la matrice d’ADN stock à 25 picomolaires dans un millilitre de tampon de blocage dans la chambre à un débit modéré tel que 0,025 millilitres par minute pendant 30 minutes pour permettre une bonne couverture de surface de l’ADN.

Une fois que l’ADN est dans la chambre, lavez l’excès d’ADN à l’aide d’un tampon de lavage bloquant pour au moins 200 volumes de cellules d’écoulement. Pour vous débarrasser de tout l’ADN libre, allumez le laser et la caméra. Le CCD refroidi doit atteindre la température avant de pouvoir être utilisé.

Après avoir lavé l’excès d’ADN et dégazé le tampon de réplication, préparez le mélange de réactions de réplication des nucléotides DTT et cytoxine dans le tampon de réplication. Ajoutez ensuite les protéines et mélangez délicatement. Versez ensuite le mélange réactionnel dans la cellule d’écoulement.

La vitesse d’écoulement doit ici être suffisante pour étirer l’ADN double brin sur une largeur de deux millimètres. Un canal d’écoulement de 100 micromètres de haut et 0,04 millilitre par minute fonctionne bien. Laissez le temps au mélange de pénétrer dans la chambre environ 10 minutes.

Déplacez le champ de vision sur le côté du canal et concentrez-vous sur le matériau adhésif pour vous assurer qu’il est près de la surface pour la mise au point et pour commencer l’imagerie. Ajustez la puissance laser, la mise au point du microscope et l’angle du gazon. Gardez la puissance basse pour éviter tout photoclivage de l’ADN coloré.

Acquérez à une à cinq images par seconde pendant plusieurs minutes en fonction de la vitesse de réplication de l’ADN. Répétez l’opération pour obtenir des trajectoires de réplication plus longues ou passez à un nouveau champ pour voir plus de molécules lorsque presque tout le mélange réactionnel a été pompé dans le flux cellulaire dans plus de tampon avec cyt pour voir d’autres champs de vision. La prise de plusieurs images de différentes molécules répliquées fournit des statistiques pour la détermination de la productivité.

Dans le cercle roulant. La synthèse de la force principale du test de réplication étend la queue, reliant le cercle et la surface, la queue est convertie en ADN double brin par la polymérase du brin retardé et étirée par un flux laminaire illustré. Voici un exemple de champ de vision avec cyt orange à une excitation de 532 nanomètres.

Les petits spots fluorescents sont des substrats attachés non répliqués. Notez l’extrême longueur des produits et le grand nombre de produits par champ. Un champ de vision typique montrera de nombreuses molécules répliquées visibles sous forme de lignes brillantes croissantes d’ADN coloré Les expériences à 37 degrés Celsius donnent cinq à 50 molécules par champ en fonction de la densité de surface.

La zone T sept repla initie beaucoup plus efficacement et répliquera plus de 50 % des molécules d’un champ. Avec une densité aussi élevée, il est difficile de résoudre des molécules individuelles comme on le voit ici. Effectuez donc l’expérience T sept à des concentrations de protéines ou à une densité de surface plus faibles Les graphiques Chime des molécules répliquatives typiques d’E coli et les expériences T sept incluent les trajectoires finales des molécules d’E coli et T sept tracées en fonction du temps, les trajectoires sont ajustées avec une régression linéaire pour obtenir des taux de réplication, qui dans cet exemple sont de 467,1 paires de bases par seconde pour E coli et de 99,4 paires de bases par seconde.

Pour T sept, les distributions de vitesse des trajectoires de molécules uniques correspondent à des gaussiennes simples donnent une moyenne de 535,5 plus ou moins 39 paires de bases par seconde pour e coli et de 75,9 plus ou moins 4,8 paires de bases par seconde. Pour T sept, les distributions de longueur des produits de réplication sont ajustées avec une décroissance exponentielle simple pour obtenir la productivité, qui est de 85,3 paires de plus ou moins 6,1 kilobases pour e coli et de 25,3 plus ou moins 1,7 paires de kilobases pour G sept. Alors nous venons de vous montrer comment mesurer la réplication coordonnée de l’ADN avec des molécules uniques.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de bien fonctionnaliser les lamelles et de créer des canaux d’écoulement droits et propres. Assurez-vous de maintenir la charge de puissance du laser et de minimiser le photoclivage de l’ADN long. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.