Name: Visualisation de la réplication dADN molécule unique par microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Découvrez une technique de microscopie à fluorescence moléculaire unique pour visualiser la réplication de l'ADN par des réplisomes individuels en temps réel. Cette méthode permet d'étudier les activités coordonnées de la synthèse de l'ADN.

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Samir Hamdan aidé dans le développement de cette technique. E. coli sont des protéines du laboratoire du professeur Nick Dixon, protéines de l&#39;Université de Wollongong, et T7 sont du professeur Charles Richardson, Harvard Medical School. Le travail est soutenu par le National Institutes of Health (GM077248 d&#39;AMvO) et la Fondation Jane Coffin Childs (JJL).

Avant d&#39;effectuer la réplication d&#39;une expérience unique molécule, un peu de matériaux doivent être préparés à l&#39;avance. 1. Modèle de réplication d&#39;ADN Le substrat pour la réaction de réplication est un biotinylé, queue M13 cercle roulant préparés en utilisant standards de biologie moléculaire 1,2 techniques. Matériaux: M13mp18 ADN simple brin, biotinylé oligonucléotide amorce de queue (5&#39;-biotine-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), l&#39;ADN polymérase T7, un bloc de chaleur, de phénol / alcool isoamylique / Chloroforme <ol><li> Recuire les oligo biotinylé la queue à l&#39;M13 en ajoutant un excès de 10 fois d&#39;oligo dans du tampon TBS (330 nM queue oligo, 33 nM M13). </li><li> Chauffer le mélange à 65 ° C dans le bloc thermique. Une fois chauffée, tournez le bloc de chauffage hors tension et permettre un refroidissement lent à bien recuit l&#39;amorce. </li><li> Ajouter la M13 amorcée à un mélange de 64 nM polymérase T7 ADN et le tampon de la réplication T7 contenant dNTPs et MgCl 2. </li><li> Incuber la réaction à 37 ° C pendant 12 minutes et étancher avec 100 mM d&#39;EDTA. </li><li> Purifier l&#39;remplie dans l&#39;ADN des produits avec extraction phénol / chloroforme / isoamyle et dialyser dans un tampon TE ou d&#39;autres tampons de stockage approprié et de déterminer la concentration d&#39;ADN (Back-extraire chaque phase organique à récupérer tout résidu amorcée M13). </li><li> Une itération de préparation modèle peut facilement faire plusieurs millilitres de modèle de concentration nanomolaire, assez pour des centaines de milliers de molécule unique d&#39;expériences. </li></ol> 2. Lamelles fonctionnalisés Pour la fixation à l&#39;ADN de la lamelle de verre, le verre est d&#39;abord fonctionnalisés avec un aminosilane, qui est ensuite couplé à des molécules de PEG biotinylé. Ce revêtement contribue à réduire les interactions non spécifiques de l&#39;ADN et les protéines de réplication avec la surface 1,3. Matériaux: lamelles de verre, des pots de coloration, 3-aminopropyltriéthoxysilane, méthoxy-PEG5k-NHS ester biotine-PEG5k-NHSester, l&#39;acétone, 1M KOH, l&#39;éthanol, Four Bain sonicateur, <ol><li> Nettoyez soigneusement les lamelles de verre en les plaçant dans des bocaux coloration et le remplissage des bocaux avec de l&#39;éthanol. Soniquer pendant 30 minutes et rincer les bocaux et les remplir de 1 M KOH. Soniquer pendant 30 minutes Répéter deux lavages. </li><li> Pour la réaction de fonctionnalisation d&#39;abord, toute trace d&#39;eau doivent être enlevés. Remplissez les bocaux avec de l&#39;acétone et soniquer pendant 10 min. Rincez à nouveau les bocaux avec de l&#39;acétone. </li><li> Préparer un 2% v / v solution du réactif de silane dans l&#39;acétone. Ajouter à la coloration des bocaux et agiter pendant 2 minutes. Cette réaction des couples du groupe alcoxy de l&#39;aminosilane à la vitre, laissant une amine réactive pour la prochaine étape de couplage. Arrêter la réaction avec un large excès d&#39;eau. </li><li> Sécher les lamelles en les cuisant à 110 ° C dans le four pendant 30 minutes. </li><li> Préparer un méthoxy 50:1: biotine PEG mélange dans 100 mM NaHCO 3 à pH 8,2. But pour environ 0,2% p / v PEG biotinylé. </li><li> Pipeter 100 uL du mélange PEG sur une lamelle sèche silanisé et placer une autre lamelle sur le dessus. Y compris une entretoise lamelle de verre permettra la séparation des lamelles. </li><li> Incuber les lamelles dans la solution de PEG pendant 3 heures, puis de séparer chaque paire de lamelles et laver abondamment avec de l&#39;eau. Veillez à garder les lamelles latérales fonctionnalisées en tant que côté une fois sera recouvert avec du PEG. </li><li> Sécher les lamelles et stocker sous vide. Les surfaces restent stables pendant au moins un mois, donc des dizaines de lamelles peuvent être faites dans un lot et utilisés au besoin. </li></ol> Ces matériaux doivent être faites d&#39;avance, puis utilisées pour chaque expérience. Pour commencer chaque expérience unique molécule, commencer par rassembler la chambre d&#39;écoulement. 3. Préparation Chambre de circulation L&#39;expérience est réalisée en utilisant une chambre de flux simple, construit avec une lamelle fonctionnalisée, scotch double-face, une lame de quartz et les tubes. Une chambre d&#39;écoulement est préparé pour le 1,4 expérimentation chaque molécule unique. Matériaux: ruban adhésif double face, une lame de rasoir, glisser à quartz avec des trous pour tuyaux, à séchage rapide époxy, lamelle fonctionnalisés (voir ci-dessus), une solution de streptavidine (25 uL de 1 mg / ml dans le PBS), tubes de tampon de blocage (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 2 mM, NaCl 50 mM, 0,2 mg / ml BSA, 0,005% de Tween-20) <ol><li> Commencez par placer 20-25 ml de tampon de blocage dans un dessiccateur pour éliminer les bulles d&#39;air pour les étapes ultérieures. </li><li> Prenez une lamelle de PEG-fonctionnalisés et la propagation de la solution de streptavidine 125 PBS-dilué sur la surface. Laissez ce à incuber pendant 20 minutes tout en préparant d&#39;autres parties de la chambre, ce qui permet de lier streptavidine biotines surface. </li><li> Coupez un morceau de double facebandes d pour correspondre à la taille de la diapositive à quartz. Marquer la position des trous de tuyau sur la bande avec un crayon afin que les grandes lignes de la chambre d&#39;écoulement peuvent être tirées sur la bande (1 mg / ml). </li><li> Faire un 2 mm de large rectangle autour des trous. Ce sera le canal d&#39;écoulement, donc soyez sûr de faire les côtés droit et laisser de la place autour de l&#39;entrée et la sortie de tube. Si désiré, des canaux multiples ou de tailles différentes peuvent être utilisées. </li><li> Coupez le long du contour dessiné, rendant coupes droites et propres pour s&#39;assurer que personne ne dépasse colle dans le canal. </li><li> Nettoyez soigneusement l&#39;acétone de quartz à l&#39;aide ou l&#39;éthanol pour enlever l&#39;adhésif de la construction de cellules d&#39;écoulement précédentes. </li><li> Trouver le meilleur alignement du contour de canal, retirer un côté de l&#39;adhésif et placer soigneusement le ruban sur la lame de quartz. Soyez prudent afin d&#39;aligner la bande correctement, comme les trous d&#39;entrée et de sortie doivent rester débloqué. </li><li> Couper des longueurs de tuyaux pour l&#39;entrée et la sortie de la cellule d&#39;écoulement. Il aide à couper l&#39;extrémité du tube à environ un angle de 30 ° pour que le tube ne sera pas de presse à plat contre le fond de chambre. Placer les tubes sur une sorte de soutien pour les suspendre pour une fixation facile à la cellule de flux dans les prochaines étapes. </li><li> Rincer la lamelle recouvertes de streptavidine abondamment à l&#39;eau et sécher à l&#39;air comprimé. Rappelez-vous que seul un côté est fonctionnalisé; attention à ne pas tourner la lamelle sur. Retirer de l&#39;autre côté du support cassette et placer la lame de quartz sur la lamelle. </li><li> Appuyez légèrement sur la lamelle pour faire sortir tout l&#39;air emprisonné dans la colle. Cela permettra d&#39;éviter les bulles d&#39;air d&#39;entrer dans le canal d&#39;écoulement. </li><li> Scellez les côtés de la chambre à l&#39;époxy. Insérer le tuyau coupé dans les trous du quartz et sceller en place à l&#39;époxy. Cela doit sécher pendant quelques minutes. </li><li> Une fois sèche, commencer à bloquer la surface en tirant partie de la mémoire tampon dégazée par un blocage de tubes. Une aiguille de calibre 21 correspond parfaitement à l&#39;intérieur du tube de 0,76 mm. Rincez plusieurs fois pour enlever les bulles d&#39;air, et permettre à la chambre à incuber pendant au moins une demi-heure. </li></ol> 4. Expérience de la réplication de molécules simples Matériaux: chambre de flux Préparé, SYTOX d&#39;Orange, un microscope TIRF, 532 nm laser, caméra CCD, de l&#39;informatique avec le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image, substrat d&#39;ADN de cercle roulant, les protéines de réplication <ol><li> Après la cellule de débit a été bloqué, tout est prêt pour commencer l&#39;expérience unique molécule. </li><li> Prenez la cellule d&#39;écoulement et le placer sur la platine du microscope. Tenir la chambre en place avec des clips scène et être sûr que le canal d&#39;écoulement est positionné directement le long de l&#39;axe y. </li><li> Connectez le tube de sortie de flux de cellules à l&#39;aide d&#39;une pompe seringue tube diamètre de connecteur ou une aiguille. Placer l&#39;entrée dans le tampon de blocage et tirez sur la seringue pour enlever tout l&#39;air dans le tube. Un film de douceur du tube de sortie aidera à éclaircir les bulles d&#39;air piégées dans la cellule d&#39;écoulement. </li><li> Diluer la matrice d&#39;ADN d&#39;actions à 25 pM dans 1 ml de tampon de blocage. Débit dans la chambre à débit modéré pour permettre une couverture de surface bien de l&#39;ADN. 0,025 ml / min pendant 30 minutes fonctionne bien. Cela peut être varié en fonction du nombre de molécules d&#39;ADN sont sur la surface de chaque lot de lamelles ou combien sont souhaitées pour l&#39;expérience. </li><li> Une fois que l&#39;ADN est dans, laver tout excédant d&#39;ADN à l&#39;aide du tampon de blocage. Laver pendant au moins 200 flux de cellules volumes pour se débarrasser de tout l&#39;ADN libre. </li><li> Commencez dégazage le tampon de la réplication. Pour les E. expériences de réplication coli, cela à 37 ° C pour réduire le risque de bulles dans la chambre d&#39;écoulement chauffé. </li><li> Allumez le laser et la caméra. Le CCD refroidie doit atteindre la température avant de pouvoir être utilisé. </li><li> Si vous effectuez une expérience de 37 ° C, tournez le chauffage. Soyez sûr l&#39;objectif est en contact avec la cellule de flux ou il sera un dissipateur thermique plus tard. </li><li> Après le lavage et le dégazage, la réaction peut être préparé. Nucléotides Mix, la TNT, et SYTOX dans le tampon de la réplication. Puis ajouter les protéines et les mélanger délicatement. </li><li> Débit du mélange réactionnel dans la cellule de flux. Cette vitesse d&#39;écoulement doit être suffisante pour étirer ADNdb. Pour une 2-mm de large, 100-um canal d&#39;écoulement hauteur 0,04 ml / min fonctionne bien. </li><li> Prévoyez du temps pour le mélange à pénétrer dans la chambre et commencer l&#39;imagerie. Un bon conseil est de déplacer le champ de vision sur le côté du canal et de se concentrer sur le matériau adhésif. Cela permettra d&#39;assurer vous êtes près de la surface de focalisation. </li><li> Régler la puissance du laser, mise au point microscope, et l&#39;angle de la FRBR. Gardez la faible puissance pour éviter toute photoclivage de l&#39;ADN coloré. Acquérir à 1-5 images / seconde pendant plusieurs minutes, selon le taux de réplication de l&#39;ADN. Si vous le souhaitez, répétez pour obtenir des trajectoires plus de réplication ou de passer à un nouveau champ pour voir plus de molécules. </li><li> Après le mélange réactionnel est presque vide, c&#39;est une bonne idée de circuler dans plusieurs tampons avec SYTOX pour voir d&#39;autres champs de vue. Prendre des images multiples de différentes molécules reproduit fournit des statistiques pour la détermination de processivité. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Molécules répliquant activement sont facilement considérées comme des lignes de plus en plus de l&#39;ADN coloré. Dans nos expériences, coulant 25 pM du substrat M13 donne 100-1000 molécules dans un 60x, 125 um um champ x 125 de vue (figure 1). Réaliser des expériences de réplication en utilisant les E. protéines coli réplisome à 37 ° C (voir Matériaux pour plus de détails) donne des molécules de 50 à 50 répliquant par champ de vue. A des concentrations équivalentes de l&#39;réplisome T7, qui initie sur le substrat beaucoup plus efficacement, nous observons&gt; 70% des molécules dans un champ de répliquer. Ces conditions donnent une densité du produit si élevé que des molécules individuelles sont difficiles à résoudre et d&#39;analyser, de sorte que les expériences sont réalisées à T7 concentrations de protéines plus faible. Analyse des données: Pour obtenir des données de taux, il suffit de tracer l&#39;extrémité de l&#39;ADN en fonction du temps et de calculer la pente (figure 2). Pour processivité, déterminer la longueur totale de l&#39;ADN. Ces deux numéros devront être convertis en paires de bases. Avant d&#39;effectuer l&#39;expérience, vous devriez connaître la taille de pixel de la caméra à l&#39;agrandissement approprié. Pour la conversion de paires de bases, une bonne estimation est tout simplement la conversion basé sur la longueur cristallographique de l&#39;ADN, 2,9 bp / nm. Cependant, un écoulement laminaire ne sera pas complètement étirer l&#39;ADN, donc un calibrage de longueur d&#39;ADN devraient être effectuées en prenant un ADN de longueur connue, par exemple 48 502 pb λ ADN, de le fixer à la cellule de flux avec un oligo biotinylé et en mesurant sa SYTOX teinté longueur à le débit utilisé pour l&#39;expérience de la réplication. Déterminer le nombre de paires de base / pixel permet un calcul précis des taux de réplication et processivities. Prendre de nombreuses images et des films offrira un grand nombre de molécules de produits, permettant de traçage de distributions de taux et de processivité (figure 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: (A partir Ref 1.) Un dessin animé) de l&#39;essai de réplication de cercle roulant. (SA, streptavidine). Diriger brin synthèse étend la queue reliant le cercle et la surface. La queue est converti en ADN double brin par la polymérase brin retardé et étirée par flux laminaire. Exemple de terrain b) de vue avec SYTOX Orange et d&#39;excitation 532 nm. De petites taches fluorescentes sont attachés, non répliquée substrats. Notez la longueur extrême des produits et le grand nombre de produits par le terrain (chaque cellule contient des flux&gt; 5000 domaines tels). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: (adapté de référence 1.) A, b) Kymographs des molécules typiques répliquant de T7 (a) et E. coli (b) des expériences. c) les trajectoires des molécules à partir de Endpoint a) et b) tracée en fonction du temps. Les trajectoires sont équipés de régression linéaire pour obtenir des taux de réplication. Les exemples montrés sont 99,4 pb s -1 et 467,1 pb s -1. d) Longueur distributions de produits de réplication, l&#39;ajustement avec décroissance exponentielle simple à obtenir processivité: 25,3 ± 1,7 kpb (T7), 85,3 ± 6,1 kpb (E. coli). e) Taux de distribution des trajectoires seule molécule, l&#39;ajustement des gaussiennes unique. Moyens: 75,9 ± 4,8 s -1 pb (T7), 535,5 ± 39 pb s -1 (E. coli).

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

Une critique de contrôle n&#39;est examinant l&#39;effet de la tache orange, SYTOX, sur les protéines de réplication d&#39;intérêt. Une façon simple de faire cela est de réaliser l&#39;expérience de réplication dans la cellule de flux comme décrit mais avec l&#39;omission de SYTOX. Après le mélange réactionnel a coulé dans la chambre, ajoutez tampon avec SYTOX pour colorer l&#39;ADN et d&#39;examiner la distribution des longueurs de molécules répliquées. Alternativement, les réactions en vrac standard peut être utilisé pour vérifier tout effet de SYTOX sur le taux de réplication et de l&#39;efficacité. L&#39;expérience décrite ici utilise seulement un canal d&#39;écoulement unique. Ceci peut être changé facilement en créant multi-canal chambres d&#39;écoulement ou de l&#39;utilisation de PDMS ou similaire dispositifs microfluidiques. Augmenter le nombre de canaux facilite grandement le dépistage des concentrations de protéines, des mutants, ou des molécules d&#39;inhibiteur et augmente la rapidité de la réplication de données de collecte. Comme mentionné précédemment, nous effectuons les E. expériences de réplication coli à 37 ° C à l&#39;aide d&#39;un chauffe-maison construite en aluminium flux de cellules, un élément résistif chauffant (cartouche chauffante) et une alimentation variable. Cela donne une bonne stabilité en température et évite l&#39;achat d&#39;un chauffe-objectif. Pour calibrer l&#39;appareil de chauffage, nous avons simplement percé un trou dans le centre d&#39;une cellule à écoulement supérieure à quartz, a inséré un thermocouple dans le canal d&#39;écoulement et coulé tampon comme normale. Mesure de la température du tampon de flux de cellules à des tensions croissante permet un chauffage précis.

Réplication T7: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM de glutamate de potassium, chlorure de magnésium 10 mM, 100 ug / ml de BSA, avec 5 mM de dithiothréitol, 600 uM dNTP, 300 uM ATP, CTP 300 uM, et 15 nM SYTOX orange ajouté immédiatement avant utilisation. Protéines ajouté que: 5 nM GP4 (hexamère), 40 nM polymérase (1:1 gp5: thiorédoxine), 360 nm gp2.5 1,5. La réplication de E. coli: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM d&#39;acétate de magnésium, chlorure de potassium 80 mM, 100 ug / ml de BSA avec 10 mM de dithiothréitol, 40 uM dNTP, 200 rNTP uM, et 15 nM SYTOX orange ajouté immédiatement avant utilisation. Protéines ajouté que: 30 nM DnaB (hexamère), 180 Nm DNAC (monomère), 30 nM αεθ, 15 nM τ γ 2 1 δδ&#39;χψ ou τ 3 δδ&#39;χψ, 30 nM β (dimère), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tétramère), 20 nM Pria, 40 nM Prib, 320 nM pric, 480 nM DNAT 1,6

visualisation de la réplication d&#39;adn molécule unique par microscopie à fluorescence

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Nous décrivons un simple microscope à fluorescence-temps réel basé sur la méthode pour l&#39;observation de réplication de l&#39;ADN à la molécule seul niveau. Une circulaire, matrice d&#39;ADN fourchue est attaché à une lamelle de verre fonctionnalisée et reproduit abondamment après l&#39;introduction de protéines de réplication et de nucléotides (figure 1). Le produit de plus en plus l&#39;ADN double-brin (ADNdb) est étendu avec un écoulement laminaire et visualisées en utilisant un colorant intercalant. Mesure de la position de l&#39;extrémité d&#39;ADN en croissance en temps réel permet la détermination précise du taux de réplication (figure 2). Par ailleurs, la longueur des produits d&#39;ADN rempli des rapports sur la processivité de la réplication. Cette expérience peut être effectuée très facilement et rapidement et ne nécessite qu&#39;un microscope à fluorescence avec un appareil assez sensible.

Ce protocole illustre une simple molécule unique technique de microscopie par fluorescence pour la visualisation de la réplication de l&#39;ADN par replisomes individuelles en temps réel.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

Nous décrivons une méthode simple en temps réel, basée sur la microscopie à fluorescence, pour observer la réplication de l'ADN à l'échelle de la molécule unique. Un ADN circulaire et fourchu...

Dans cette technique, des lamelles en verre sont fonctionnalisées avec un mélange de molécules de PEG inertes et de PEG biotine. Une cellule d'écoulement est créée à l'aide de cette surface fonctionnalisée et placée sur un microscope à épifluorescence. Des matrices de roulage biotinylées sont fixées à la surface à l'aide de streptavidine multivalente.Lorsque les substrats sont répliqués par l'ajout de protéines de la zone de réplication et de nucléotides, l'ADN double brin résultant est allongé par écoulement laminaire et observé en temps réel à l'aide d'un colorant intercalant. Bonjour, je suis Nathan Tanner du laboratoire d'Antoine Van Ian, du Département de biochimie biologique et de pharmacologie moléculaire à la faculté de médecine de Harvard. Je suis Joe Laro, également du laboratoire Van Noian.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'imagerie par fluorescence de la réplication de l'ADN en temps réel au niveau de la molécule unique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les activités coordonnées de synthèse de l'ADN par des complexes de réplication individuels. Commençons donc.Pour commencer cette procédure, annelez l'oligo portant une queue biotinylée à l'ADN simple brin M13 en ajoutant un excès dix fois supérieur d'oligo dans un tampon TBS, en chauffant à 65 degrés Celsius, puis en éteignant le bloc chauffant pour permettre un refroidissement lent afin d'assurer un bon appariement du primer. Maintenant que le primer M13 est prêt, ajoutez-le à un mélange contenant 64 nanomolaire de polymérase ADN T7 et du tampon de réplication T7 contenant des dNDP et du chlorure de magnésium, puis incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant 12 minutes. À la fin de l'incubation, arrêtez la réaction avec du EDTA à 100 millimolaire.Ensuite, purifiez l'ADN du produit comblé à l'aide d'un mélange phénol-isoamyl alcool-chloroforme, extrayez et dialysez dans un tampon TE ou un autre tampon de stockage approprié. Effectuez une extraction inverse de chaque phase organique afin de récupérer tous les amorces résiduelles. Après dialyse, déterminez la concentration en ADN à l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible. Une seule itération de préparation du modèle permet d'obtenir une concentration nanomolaire suffisante de matrice pour des centaines à des milliers d'expériences au niveau de la molécule unique.Maintenant que l'ADN est prêt, passez à la préparation des lamelles fonctionnalisées. L'ADN à répliquer est fixé sur des lamelles en verre fonctionnalisées avec Amil Lane, le groupe Oxy de l'Amil se liant au verre et laissant un groupe amin disponible pour fixer des molécules de PEG biotinylées. Ce revêtement permet de réduire la liaison non spécifique à la surface.Pour nettoyer soigneusement les lamelles en verre, placez-les dans des bocaux de coloration et remplissez les bocaux d'éthanol soumis à une sonication. Rincez les bocaux pendant 30 minutes, puis remplissez-les avec une solution d'hydroxyde de potassium à un molaire et soumettez-les à une sonication pendant 30 minutes ; répétez ces deux lavages. Pour la première réaction de fonctionnalisation, toutes les traces d'eau doivent être éliminées.Remplir les bocaux de coloration avec de l'acétone et placer au bain à ultrasons pendant 10 minutes. Vider les bocaux et les remplir à nouveau avec de l'acétone. Passer ensuite à l'ajout du réactif sine dans les bocaux et agiter pendant deux minutes.Ensuite, arrêter la réaction en ajoutant un large excès d'eau. Puis sécher les lamelles en les faisant cuire à 110 degrés Celsius dans une étuve pendant 30 minutes. Préparer ensuite le mélange de PEG à environ 0,2 % en poids par volume à l'aide de PEG aminé, l'ajout d'un espaceur en lamelle de verre permettant de séparer les lamelles ; pipeter 100 microlitres sur une lamelle silylée sèche.Placer une deuxième lame à couvrir par-dessus. Incuber les lames à couvrir dans la solution de PEG pendant trois heures. Ensuite, séparer chaque paire de lames à couvrir et laver abondamment à l'eau.Veillez à maintenir les lames à couvrir avec leur face fonctionnalisée vers le haut, car un seul côté sera recouvert de PEG. Enfin, séchez les lames à couvrir à l'air comprimé et stockez-les sous vide dans un dessiccateur ; les surfaces restent stables pendant au moins un mois. Ainsi, des dizaines de lames à couvrir peuvent être préparées par lot et utilisées au besoin.À présent que les lamelles sont prêtes, on peut assembler la chambre d'écoulement pour l'expérience de molécule unique. Commencez par placer 20 à 25 millilitres de tampon de blocage contenant de l'albumine de sérum bovin (BSA) dans un dessiccateur afin d'éliminer toute bulle d'air pour les étapes ultérieures. Ensuite, diluez 25 microlitres de streptavidine dans 100 microlitres de PBS et répartissez la solution sur la surface d'une lamelle fonctionnalisée avec des ergots ; incubez pendant 20 minutes à température ambiante pour permettre à la streptavidine de se lier à la biotine de surface, tout en préparant les autres parties de la chambre.Pendant l'incubation du coverslip, découper un morceau de ruban adhésif double face, avec protection sur les deux côtés, de manière à ce qu'il corresponde à la taille de la lame de quartz utilisée pour assembler la chambre d'écoulement. Marquer à l'aide d'un crayon la position des trous pour les tubulures sur le ruban afin de pouvoir tracer le contour de la chambre d'écoulement sur celui-ci. Après avoir marqué les trous, dessiner un rectangle d'une largeur de deux millimètres autour des marquages.Ce rectangle servira de canal d'écoulement ; veillez donc à réaliser des côtés droits et à laisser suffisamment d'espace autour de l'entrée et de la sortie du tube. Découpez maintenant le ruban marqué le long du contour tracé, en effectuant des coupes droites et nettes afin de garantir qu'aucun adhésif ne dépasse dans le canal. Nettoyez soigneusement la lame de quartz à l'aide d'acétone pour éliminer tout adhésif résiduel provenant de la construction de la cellule d'écoulement utilisée lors d'expériences précédentes.Trouvez l'alignement optimal du contour du canal. Retirez un côté du support adhésif et placez soigneusement le ruban sur la lame porteuse. Veillez à bien aligner le ruban afin que les orifices d'entrée et de sortie restent dégagés.Ensuite, préparez les morceaux de tube de 0,76 millimètre de diamètre pour l'entrée et la sortie de la cellule d'écoulement. Il est utile de couper l'extrémité du tube selon un angle d'environ 30 degrés afin que le tube ne s'aplatisse pas contre le fond de la chambre. Placez les tubes sur des porte-tubes pour faciliter leur raccordement à la cellule d'écoulement lors des étapes suivantes.À présent, l'incubation du lamelle est terminée. Rincez soigneusement la lamelle revêtue de streptavidine ENC à l'eau et séchez-la à l'aide d'air comprimé. Veillez à ne pas retourner la lamelle, car un seul côté est fonctionnalisé.Enfin, terminez le montage de la chambre d'écoulement en retirant l'autre côté du support adhésif et en plaçant la lame de quartz sur le couvre-objet. Appuyez légèrement sur le couvre-objet pour chasser tout air piégé dans l'adhésif. Cela aidera à prévenir l'entrée de bulles d'air dans le canal d'écoulement.Scellez les côtés de la chambre avec de l'époxy. Insérez le tube coupé dans les trous du quartz et fixez-le avec de l'époxy, puis laissez sécher quelques minutes. Une fois le joint d'époxy sec, commencez le blocage de la surface.À l’aide d’une aiguille de 21 gauge, aspirez un peu de tampon de blocage Degas à travers l’un des tubes. Rincez plusieurs fois pour éliminer les bulles d’air et laissez la chambre incuber pendant au moins une demi-heure avant de passer à l’expérience de réplication unique de molécule.Maintenant que la cellule d'écoulement a été bloquée, placez-la sur la platine du microscope. Maintenez la chambre en place à l'aide de pinces de platine et assurez-vous que le canal d'écoulement est aligné selon l'axe y. Connectez le tube de sortie de la cellule d'écoulement à la pompe à seringue à l'aide d'un tube de raccordement de diamètre plus grand.Placer l'entrée dans du tampon de blocage et tirer doucement sur la seringue pour éliminer tout air présent dans le tube. Un léger tapotement sur le tube de sortie aidera à éliminer les bulles d'air piégées dans la cellule d'écoulement. Ajouter ensuite l'ADN, diluer le modèle d'ADN stock à 25 picomolaire dans un millilitre de tampon de blocage et faire circuler la solution dans la chambre à un débit modéré, par exemple 0,025 millilitre par minute, pendant 30 minutes afin d'obtenir une bonne couverture de la surface par l'ADN.Une fois l'ADN introduit dans la chambre, éliminer l'excès d'ADN en effectuant un lavage avec le tampon de blocage pendant au moins 200 volumes de la cellule d'écoulement. Pour éliminer tout l'ADN libre, allumer le laser et la caméra. Le CCD refroidi doit atteindre sa température avant de pouvoir être utilisé.Après avoir éliminé l'excès d'ADN et dégazé le tampon de réplication, préparez le mélange de réaction de réplication contenant les nucléotides, le DTT et la cytoxine dans le tampon de réplication. Ajoutez ensuite les protéines et mélangez délicatement. Ensuite, introduisez le mélange réactionnel dans la chambre d'écoulement.La vitesse d'écoulement doit être suffisante pour étirer l'ADN double brin dans un canal d'écoulement de deux millimètres de largeur et de 100 micromètres de hauteur ; un débit de 0,04 millilitre par minute convient bien. Laisser suffisamment de temps pour que le mélange pénètre dans la chambre, environ 10 minutes.Déplacez le champ de vision vers le côté du canal et focalisez-vous sur le matériau adhésif afin de vous assurer que vous êtes proche de la surface pour la mise au point et le début de l’imagerie. Ajustez la puissance du laser, la mise au point du microscope et l’angle du peigne. Maintenez la puissance faible pour éviter toute clivaison photo-induite de l’ADN marqué.Acquérez des images à raison d'une à cinq images par seconde pendant plusieurs minutes, selon la vitesse de réplication de l'ADN. Répétez l'opération pour obtenir des trajectoires de réplication plus longues ou déplacez-vous vers un nouveau champ pour observer davantage de molécules lorsque presque tout le mélange réactionnel a été introduit dans la cellule ; faites circuler davantage de tampon avec du cyt pour examiner d'autres champs de vision. La prise d'images multiples de différentes molécules répliquées permet d'obtenir des statistiques pour la détermination de la productivité.Dans le cercle roulant. L'essai de réplication par allongement de brin direct étend la queue reliant le cercle à la surface, et cette queue est convertie en ADN double brin par la polymérase du brin discontinu, puis étirée par un écoulement laminaire, comme illustré. Voici un exemple de champ de vision avec du cyt orange en excitation à 532 nanomètres.Les petits points fluorescents sont des substrats non répliqués attachés. Remarquez la longueur extrême des produits et le grand nombre de produits par champ. Un champ typique montre de nombreuses molécules en cours de réplication, visibles sous forme de lignes brillantes allongées d'ADN coloré. Les expériences sur E Coli à 37 degrés Celsius donnent de cinq à cinquante molécules par champ, selon la densité de surface.La zone de réplication T7 démarre de manière beaucoup plus efficace et répliquera plus de 50 % des molécules dans un champ. Avec une telle densité élevée, il est difficile de distinguer les molécules individuelles, comme on le voit ici. Réalisez donc l'expérience avec le système T7 à des concentrations protéiques ou à une densité de surface plus faible. Les graphiques Chime de molécules répliquant typiques provenant des expériences avec E. coli et T7 incluent les trajectoires finales de molécules d’E. coli et de T7 tracées en fonction du temps. Ces trajectoires sont ajustées par régression linéaire afin d'obtenir les taux de réplication, qui sont dans cet exemple de 467,1 paires de bases par seconde pour E. coli et de 99,4 paires de bases par seconde pour T7.Pour T7, les distributions de vitesse des trajectoires de molécules uniques, ajustées par des gaussiennes simples, donnent une moyenne de 535,5 ± 39 paires de bases par seconde pour E. coli et de 75,9 ± 4,8 paires de bases par seconde pour T7. Pour T7, les distributions de longueur des produits de réplication sont ajustées par une décroissance exponentielle simple afin d'obtenir le rendement, qui est de 85,3 ± 6,1 kilo paires de bases pour E. coli et de 25,3 ± 1,7 kilo paires de bases pour G7. Nous venons de vous montrer comment mesurer la réplication coordonnée de l'ADN au niveau de molécules uniques.Lors de cette procédure, il est important de bien fonctionnaliser les lamelles et de réaliser des canaux d'écoulement propres et rectilignes. Veillez à contrôler la puissance du laser et à minimiser le clivage photochimique de l'ADN long. Voilà, c'est terminé.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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