Assemblée, de chargement, et l'alignement d'une cellule échantillon ultracentrifugation analytique
5 novembre 2009
L'ultracentrifugation analytique (AUC) de cellules de l'échantillon et le tampon de l'échantillon détient référence et au cours d'expériences et est exposé à vide élevé et des vitesses de rotor jusqu'à 60.000 rpm. Cette vidéo va démontrer le souci du détail nécessaire pour l'assemblage, le chargement et l'alignement de cette composante très importante d'une expérience ASC.
Bonjour, je m’appelle Andrea Balbo. Je travaille dans le groupe de Peter Shucks aux National Institutes of Health. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer nos procédures d’assemblage, de chargement et d’alignement du rotor d’une cellule d’échantillonnage analytique d’ultracentrifugeuse.
Commençons. Recueilli. Voici les composants d’une cellule d’échantillonnage d’ultracentrifugeuse analytique Empilé à l’intérieur du boîtier de la cellule se trouve un champ de charbon de bois à double secteur de 12 millimètres, pièce maîtresse d’épon qui sera prise en sandwich entre deux assemblages de fenêtres. Chaque ensemble de fenêtre se compose d’un joint de fenêtre, d’une doublure de fenêtre et d’une fenêtre maintenue à l’intérieur du support de fenêtre.
Ces pièces seront ensuite glissées à l’intérieur du boîtier de la cellule en alignant leurs rainures de clavette avec la clé qui se trouve à l’intérieur du canon du boîtier, un joint de boîtier, puis un anneau à vis fermant la cellule d’échantillonnage avec une pression de couple comprise entre 120 et 140 livres. Après avoir chargé votre échantillon dans la référence, deux joints de bouchon de boîtier et un bouchon de boîtier scellent les trous de chargement de la cellule pour éviter les artefacts de balayage, les fuites et la casse pendant les expériences, il est essentiel que tous les composants soient propres, secs, sans poussière, et dans le meilleur état possible, examinent souvent et remplacent si nécessaire. Vous aurez également besoin des éléments suivants, une ultracentrifugeuse analytique, un rotor à quatre trous en titane, une balance de laboratoire, une clé dynamométrique avec un cadran lisible et un support de couple, un contrepoids et des contrepoids, un tournevis à tête plate, une paire de pinces, un pipeteur de 200 microlitres équipé d’une longue pointe de pipette conique, des outils d’alignement et du lubrifiant spin coat.
Nous commençons la construction d’échantillons de cellules en assemblant deux assemblages de fenêtres. Placez d’abord un joint de fenêtre au bas du support de fenêtre. Placez ensuite la doublure de fenêtre, ou parfois appelée coussin de fenêtre, à l’intérieur du support de fenêtre de sorte que l’ouverture de la doublure soit opposée à la rainure de clavette du support à un léger angle.
Placez ensuite la fenêtre dans le support, en alignant la marque de traçage sur la fenêtre avec la rainure de clavette du support de fenêtre. Appuyez doucement sur les bords des deux côtés de la fenêtre. Pour assurer une bonne étanchéité et un twerkage précis de la cellule d’échantillonnage, nous enduisons légèrement le joint du boîtier dans la bague à vis.
Avec le lubrifiant spin coat, étalez une très petite quantité de spin coat entre votre pouce et votre index. Enduisez les filetages des bagues vissées d’une fine pellicule invisible de spin coat. De même, enduisez le joint du boîtier.
Essuyez tout lubrifiant visible. Pour commencer l’assemblage d’un échantillon de cellule. Faites glisser une fenêtre avec la fenêtre vers le haut vers vous dans le boîtier de la cellule en alignant la rainure de clavette avec la clé du boîtier.
Alignez la rainure de clavette de la pièce centrale avec la clé du boîtier et laissez-la tomber doucement sur le dessus de l’ensemble de fenêtre à l’intérieur du boîtier. N’utilisez jamais d’outil pour enfoncer la pièce maîtresse dans le boîtier de la cellule. Cela pourrait causer des dommages permanents à la pièce maîtresse, entraînant des expériences de stockage de fuites.
Tournez la deuxième fenêtre de manière à ce qu’elle soit tournée vers la pièce maîtresse et loin de vous. Alignez la rainure de clavette avec la clé du boîtier et faites-la glisser vers le bas sur le dessus de la pièce maîtresse. Placez le joint du boîtier sur le dessus.
Puis un anneau de vis pour que le mot out soit visible. À l’aide de vos doigts. Ensuite, un outil d’alignement, serrez à la main la bague de vis.
Parfois, la pièce maîtresse ne glisse pas facilement dans le canon du boîtier. Vous pouvez d’abord l’aligner, puis placer la deuxième fenêtre par-dessus. En appliquant une légère pression vers le bas sur l’ensemble de la fenêtre.
Vous pouvez glisser les deux dans le boîtier de la cellule en même temps. De cette façon, nous évitons d’appuyer directement sur la pièce maîtresse. C’est le bon moment pour regarder la cellule à la recherche de poussière, de peluches et d’empreintes digitales.
Vous remarquerez également les anneaux de Newton qui indiquent qu’il y a encore de l’air entre la pièce maîtresse et les fenêtres. Ceux-ci disparaîtront après le serrage avec la bague de vis vers le haut et le mot out visible. Placez la cellule d’échantillonnage tout en bas à l’intérieur de la cellule.
Pince de serrage du support de couple. Maintenez la cellule en place en appliquant une pression constante sur la poignée du support de couple. En un mouvement continu, serrez l’anneau de vis entre 120 et 140 pouces-livres.
Relâchez la poignée du support de couple et retirez délicatement la cellule d’échantillonnage. Nous chargeons régulièrement un volume de 400 microlitres dans chaque secteur de la pièce maîtresse de 12 millimètres. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, positionnez la cellule d’échantillon avec les trous de chargement sur le dessus et le mot sur la bague de vis visible.
Faites glisser la pointe de la pipette à mi-chemin dans le secteur central gauche à travers les trous de chargement et distribuez lentement 200 microlitres de solution de référence. Répétez l’opération une fois pour atteindre un total de 400 microlitres en utilisant la même pointe de pipette et la même technique avec précaution et lentement. Remplissez le secteur central droit avec 400 microlitres de solution d’échantillon.
Il est impératif de faire correspondre au plus près les volumes de solutions de référence et d’échantillons. Ajustez fermement la pointe de la pipette sur la pipette, chargez et distribuez lentement les solutions, en évitant de charger des bulles et en utilisant la même pointe de pipette pour les deux solutions. Tous aident à maintenir les volumes égaux pour sceller la cellule.
Placez deux joints de bouchon de boîtier rouges bien ajustés dans chaque trou de chargement, en vous assurant qu’ils sont soigneusement positionnés entre la pièce centrale et le boîtier en aluminium. Couvrez chaque trou de chargement avec un bouchon de boîtier et serrez à la main avec un petit tournevis à tête plate. Avant de charger le rotor, assurez-vous que le contrepoids et la cellule qui sera opposée au contrepoids sont à moins de 0,5 gramme l’un de l’autre.
Commencez avec un solde à zéro. Tout d’abord, pesez une cellule d’échantillonnage qui sera en position opposée au contrepoids. Déchirez la balance pour soustraire le poids de la cellule de l’échantillon.
Pesez ensuite le contrepoids. Ici, nous constatons que le contrepoids est 4,193 grammes plus léger que la cellule d’échantillon. Sélectionnez un poids de contrepoids de quatre grammes et vissez-le dans le trou de fixation du contrepoids, en vous assurant qu’il ne dépasse pas du haut.
Pesez le contrepoids pour vous assurer que le poids final est inférieur à 0,5 gramme. À l’aide d’un rotor à quatre trous, placez le contrepoids en position quatre de sorte que la flèche blanche soit visible et pointant dans la direction de la force centrifuge. À l’aide d’un outil d’alignement, assurez-vous qu’il est tout en bas à l’intérieur du rotor.
Positionnez la cellule d’échantillonnage de la balance avec les bouchons du boîtier orientés vers le centre du rotor et le mot sur la bague à vis visible. Encore une fois, à l’aide d’un outil d’alignement, assurez-vous qu’il est tout en bas à l’intérieur du rotor. En regardant sous le rotor.
Alignez l’intérieur. Traceur, marquez le repère le plus proche du centre du rotor avec le repère sur le contrepoids à l’aide d’un outil d’alignement. De la même manière, alignez la cellule d’échantillonnage à la position deux.
Une fois que toutes les cellules sont alignées, le rotor est prêt à être placé dans la chambre de centrifugation.
Aperçu
Ce vidéo montre le montage, le chargement et l'alignement d'une cellule d'échantillon pour ultracentrifugeuse analytique (AUC), une étape cruciale pour les expériences d'UCA. Une manipulation et une préparation adéquates des composants de la cellule d'échantillon sont soulignées afin de garantir des résultats précis.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Ultracentrifugation analytique
- Méthodes biophysiques
- Techniques de préparation des échantillons
Contexte
- La cellule d'échantillon AUC est essentielle pour réaliser des expériences à des vitesses élevées du rotor.
- Elle se compose de plusieurs composants qui doivent être assemblés avec précision.
- Il est crucial de maintenir la propreté et un alignement correct afin d'éviter les artefacts expérimentaux.
- Comprendre le processus d'assemblage est fondamental pour les chercheurs utilisant l'AUC.
Objectif de l'étude
- Fournir un guide détaillé sur le montage et le chargement d'une cellule d'ultracentrifugation analytique (AUC).
- Mettre en évidence l'importance d'une préparation méticuleuse dans les expériences d'ultracentrifugation analytique.
- Garantir que les chercheurs puissent reproduire le processus avec précision.
Méthodes utilisées
- Assemblage des éléments de fenêtre et du composant central dans la cellule d'échantillon.
- Application d'un couple pour fixer les composants de la cellule d'échantillon.
- Chargement des solutions de référence et d'échantillon dans la cellule.
- Équilibrage de la cellule d'échantillon à l'aide d'un contrepoids pour des mesures précises.
Résultats principaux
- Assemblage réussi de la cellule d'échantillon pour l'UCP, tel que démontré dans la vidéo.
- Les techniques de chargement appropriées garantissent un nombre minimal de bulles et des volumes égaux.
- Les réglages du contrepoids sont essentiels pour une performance précise du rotor.
- Les indicateurs visuels, tels que les anneaux de Newton, aident à évaluer la qualité de l'assemblage.
Conclusions
- Une attention méticuleuse à l'assemblage des cellules d'échantillonnage est essentielle pour les expériences d'ultracentrifugation analytique (AUC).
- Le respect des procédures décrites peut améliorer la fiabilité expérimentale.
- Un entretien régulier et un contrôle des composants sont recommandés.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'assemblage et l'alignement corrects des cellules d'échantillon d'ultracentrifugeuse analytique sont essentiels pour obtenir des données biophysiques fiables sur la taille, la forme, la pureté et les états d'oligomérisation des protéines. Une préparation méticuleuse des cellules d'échantillon réduit au minimum les artefacts expérimentaux, garantissant l'intégrité des données pour la validation des cibles et les études mécanistiques en phase précoce de la découverte de médicaments. Cette rigueur procédurale renforce la fiabilité prédictive des criblages ultérieurs et des optimisations de composés leaders.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet la détermination précise des états d'oligomérisation des protéines et des interactions protéine-protéine, informant directement les hypothèses de validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Offre une évaluation sans marquage, en solution, des propriétés des macromolécules dans des conditions proches de l'état natif.
- Valeur prédictive : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la dé-risquation des cibles en fournissant des coefficients de sédimentation quantitatifs et des paramètres de forme.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit des données sur la taille et la forme hydrodynamiques, essentielles pour la formulation des tampons d'essai et le criblage de la stabilité.
- Valeur opérationnelle : Garantit l'intégrité et la monodispersité des échantillons, critiques pour la reproductibilité des essais biochimiques et cellulaires.
- Intégration à la plateforme : Permet la caractérisation biophysique de cibles purifiées avant des campagnes de criblage à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet l'évaluation de la formation de complexes protéiques et des changements conformationnels liés aux mécanismes des maladies.
- Valeur opérationnelle : Facilite les contrôles de cohérence entre lots de protéines recombinantes utilisées dans les modèles précliniques.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre la caractérisation biophysique de la cible et les essais fonctionnels dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le flux de travail relatif à la cellule d'échantillonnage de l'ultracentrifugeuse analytique s'intègre dans le continuum de la découverte, depuis la validation de la cible jusqu'à l'identification de l'élément précurseur, en fournissant des données biophysiques qui éclairent les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin, fondées sur le comportement et la stabilité de la cible.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses concernant l'oligomérisation des cibles et leurs réseaux d'interaction, permettant une réduction des risques biologiques avant le développement de tests.
- Criblage : Garantit la monodispersité et la stabilité de la cible, influant directement sur la préparation aux essais et la qualité des données dans les campagnes de criblage.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives du coefficient de sédimentation et de la masse moléculaire, permettant la comparaison des états protéiques dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les propriétés biophysiques de la cible purifiée et sa validation fonctionnelle dans des modèles précliniques grâce à une qualité constante du matériel.
- Réutilisation institutionnelle : Constitue une capacité standardisée et réutilisable de caractérisation biophysique applicable à plusieurs cibles et projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans les propriétés des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique et amélioration de la rigueur de la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Préparation standardisée des échantillons, reproductibilité entre les essais et évolutivité entre les laboratoires.
- Valeur stratégique : Décisions éclairées concernant la poursuite ou l'abandon de projets, réduction des taux d'échec dus à l'instabilité des cibles et amélioration de l'efficacité du capital en phase précoce de découverte.
- Impact sur le portefeuille : Hiérarchisation des cibles ajustée au risque, fondée sur des données de dé-risquage biophysique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques biophysiques et une manipulation précise des composants optiques.
- Dépend d'instruments d'ultracentrifugation analytique, de clés dynamométriques, d'outils d'alignement et d'une manipulation d'échantillons compatible avec un environnement propre.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de nettoyage, d'assemblage et d'application du couple de serrage.
- Implique des adaptations selon les types d'échantillons, les conditions de tampon et les géométries des cellules-centre.
- Limité par la fragilité des composants ; les fenêtres et les cellules-centre sont sensibles aux dommages causés par les particules, un couple de serrage inapproprié ou un mauvais alignement.
