Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules

Pour étudier la dynamique de molécules individuelles sur une période prolongée, il est nécessaire de localiser d'abord ces molécules dans l'espace. Nous y parvenons en les immobilisant à la surface d'une cellule microfluidique. La procédure commence par l'assemblage de la cellule, qui contient quatre chambres où les biomolécules seront fixées.

Les chambres sont reliées à l'extérieur par des capillaires d'entrée et de sortie. La cellule est fabriquée en fusionnant un disque de PDMS structuré avec une lame de couverture en quartz. La cellule assemblée est ensuite montée sur le microscope à fluorescence et des tubulures flexibles sont connectées aux capillaires afin de permettre un échange facile des solutions à travers les chambres, dans un premier temps pour activer la surface en immobilisant des molécules, puis en faisant circuler une solution d'albumine sérique bovine biotinylée à travers l'un des canaux.

L'albumine sérique bovine (BSA) va s'adsorber sur la chambre. Ensuite, faites circuler une solution de streptavidine, qui se liera à la biotine. Enfin, faites circuler votre oligonucléotide biotinylé, qui se liera à la streptavidine, ancrant ainsi la molécule d'intérêt à la surface du coverslip en quartz.

Un tampon d'imagerie conçu pour maximiser la stabilité et l'intensité de la durée de vie des fluorophores est acheminé dans la chambre à un débit constant pendant toute la période d'acquisition. Le dispositif automatisé analyse différentes sections de la surface à la recherche de molécules possédant à la fois des fluorophores donneurs et accepteurs, puis les déplace une par une dans le volume d'analyse afin d'obtenir pour chacune une courbe d'intensité de fluorescence en fonction du temps, jusqu'à ce que les deux fluorophores subissent une photobléachisation. Bonjour, je suis Nicholas Dfi du laboratoire du professeur Miller, du département de génie biomédical de l'Université de Boston.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'obtenir des traces F de molécules uniques à partir d'acides nucléiques immobilisés, en utilisant un dispositif confocal. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la dynamique des acides nucléiques ainsi que les interactions entre acides nucléiques et enzymes. Commençons donc.

Le Microfluid Excel est fabriqué en fusionnant un disque en polydiméthylsiloxane (PDMS) de deux millimètres d'épaisseur, préalablement gravé, à une lame de couverture en quartz fraîchement nettoyée. Pour réaliser le disque en PDMS structuré, mélangez 10 parties de base d'élastomère de silicone avec une partie d'agent de réticulation, homogénéisez soigneusement puis dégazez pendant une heure sous vide. Une fois l'élastomère de silicone dégazé, versez-le délicatement dans le moule de la cellule microfluidique.

Laisser le mélange d'élastomère durcir sur un bloc chauffant à 70 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois durci, décoller délicatement le disque de PDMS du moule à l’aide d’une lame de rasoir. Le disque de PDMS contient quatre chambres rectangulaires de 30 microlitres.

Fusionner le côté plat du disque en PDMS, c’est-à-dire le côté ne contenant pas les canaux, sur une fenêtre en verre de un pouce à l’aide d’une oxydation au plasma des deux surfaces pendant 30 secondes. La fenêtre en verre comporte huit trous de deux millimètres aux deux extrémités des canaux, préalablement percés. Ensuite, un tube capillaire souple en silice fondue d’une longueur de deux pouces est inséré dans chaque trou de la fenêtre en verre.

Pour ce faire, insérez d'abord une aiguille, puis introduisez le tube capillaire jusqu'à ce qu'il atteigne le canal. Scellez les orifices de la fenêtre en verre à l'aide d'un composé de moulage en silicone à prise rapide, comme le quick cast. Rincez les canaux à l'éthanol et à l'eau après avoir activé la cellule au plasma et utilisé une lame de couverture circulaire en quartz de un pouce, récemment nettoyée au piranha, pendant 30 secondes.

Sceller la lame sur le côté de la cellule contenant les canaux. Les chambres sont désormais étanches. Laisser durcir la cellule assemblée toute la nuit à température ambiante.

Après que le microfluidique Excel assemblé ait polymérisé toute la nuit, il est placé dans un support sur mesure et monté sur la platine du microscope confocal afin de commencer l'activation de la surface de la cellule. Pour l'immobilisation des molécules, reliez un tube souple aux capillaires de la cellule afin de faciliter l'injection de tampon à l'aide d'une seringue et d'une aiguille. Injectez ensuite une solution de BSA biotinylée à 0,1 milligramme par millilitre dans le tampon A dans le canal et incubez pendant au moins 30 minutes.

Après une incubation de 30 minutes, faire circuler 300 à 500 microlitres de tampon A afin d'éliminer toute trace de BSA biotinylée non absorbée dans le canal, en prenant soin de ne pas emprisonner de bulles d'air dans la chambre. Ensuite, injecter une solution de 0,1 milligramme par millilitre de STR din dans le tampon A et incuber pendant 15 minutes.

Après l'écoulement du temps d'incubation de 15 minutes, faire circuler 300 à 500 microlitres de tampon A afin d'éliminer tout streptavidine non absorbée du canal. Comme précédemment, éviter de piéger des bulles d'air dans la chambre. Enfin, faire circuler une solution de trois à cinq picomolaires de l'échantillon biotinylé.

Pour vérifier la couverture des molécules fluorescentes, un balayage de surface est effectué. Incubez l'échantillon biotinylé pendant 10 minutes et répétez l'écoulement du tampon. Comme indiqué précédemment, le tampon d'imagerie ou IB comprend un système enzymatique de piégeage de l'oxygène et un inhibiteur de l'état triplet tel que les trol, qui doivent être dissous en premier pour préparer le IB.

Cinq milligrammes de trol se lient à 10 millilitres de tampon glucosé par vortexage pendant quelques minutes et agitation pendant au moins 10 minutes. Filtrer la solution et la laisser dégazer sous vide pendant 10 minutes. Mélanger délicatement la solution de verrouillage TRO avec la solution enzymatique Glocky tout en évitant la formation de bulles d'air.

Remplissez le réservoir avec la solution IB. Ensuite, à l’aide d’une pompe à seringue mécanique, contrôlez le débit en faisant circuler l’IB dans le canal à un débit constant de cinq microlitres par minute, et faites barboter du gaz argon dans le réservoir d’IB afin d’empêcher l’oxygène atmosphérique de se dissoudre dans le tampon. La numérisation de surface, la localisation des molécules et l’acquisition des courbes d’intensité de molécules uniques sont contrôlées par le programme LabVIEW, qui analyse des zones de 20 par 20 micromètres carrés avec une résolution de 0,2 micromètre à une vitesse de 0,1 micromètre par milliseconde.

Les données provenant du balayage de surface sont immédiatement traitées afin d'obtenir les positions pondérées par l'intensité de tous les pixels dont le nombre de signaux dépasse le niveau du fond. Une fois les molécules immobilisées détectées, elles sont déplacées une par une dans le volume confocal et les intensités des fluorophores donneur et accepteur sont enregistrées en fonction du temps jusqu'à ce que les deux fluorophores subissent une photobléach. La platine est ensuite programmée pour se déplacer vers une nouvelle origine située à 100 millimètres de distance, et le processus de balayage est répété.

Le MICROFLUID Excel assemblé est montré ici. Il s'agit de balayages de surface montrant des molécules uniques dans les canaux donneur vert et accepteur rouge. Quelques tracés typiques de molécules uniques, affichant l'intensité de l'accepteur en rouge et celle du donneur en vert, sont présentés.

Nous venons de vous montrer comment obtenir des traces de molécules uniques à partir de biomolécules immobilisées en utilisant un dispositif confocal. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous rappeler d'exécuter chaque étape avec soin et de prendre votre temps, car il s'agit d'une expérience délicate. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.