Name: Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Apprenez à obtenir des traces FRET de molécules d'ADN individuelles immobilisées sur une surface à l'aide d'un microscope confocal à balayage automatisé. Cette méthode permet d'étudier la dynamique des acides nucléiques et leurs interactions enzymatiques en temps réel.

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Nous remercions Chandran Sabanayagam pour son aide dans le développement du système, Joshua Edel pour des conseils sur la conception du dispositif microfluidique et le personnel de l&#39;Institut de Rowland à l&#39;Université Harvard pour l&#39;usinage de pièces de l&#39;installation. Nous reconnaissons les discussions utiles avec les membres du groupe de Meller à l&#39;Institut Rowland et l&#39;Université de Boston, et les membres du groupe T. Ha &#39;s à l&#39;UIUC pour des renseignements utiles. Enfin, nous apprécions le soutien financier de la National Science Foundation (PHY-0701207) et l&#39;Institut national de la santé (GM075893).

1 - Assemblage de la cellule microfluidique La cellule microfluidique est fait par fusion d&#39;un motif, 2 mm d&#39;épaisseur, polydiméthylsiloxane (PDMS) de disque à une lamelle de quartz fraîchement nettoyée. Le disque contient quatre PDMS 30 pl chambres rectangulaires qui sont accessibles par entrée et de sortie flexibles capillaires relié à un réservoir tampon et une pompe seringue, respectivement, pour les flux contrôlé de tampon. La cellule d&#39;écoulement est pris en charge sur sa face arrière par une fenêtre en verre et placé sur un support de cuve sur-mesure contenant une eau refroidie élément thermoélectrique pour réguler la température. <ol><li> Pour rendre le modelé PDMS disque, mélange de base 10 pièces en élastomère silicone avec une partie de durcisseur, bien mélanger et laisser le dégazage pendant 1 heure dans le vide. </li><li> Verser délicatement le mélange sur le moule en élastomère cellulaire microfluidique. Dans notre cas, il s&#39;agit d&#39;une plaquette de silicium 1 &quot;avec quatre bandes (1x10 1x10 4 x 3 x 300 um) fabriqués à partir de résine photosensible négative. Laissez ce pour guérir sur une plaque chaude à 70 ° C pendant deux heures. </li><li> Retirer délicatement le disque guéri PDMS à partir du moule en utilisant une lame de rasoir. Fusible du disque sur une fenêtre 1 verre&#39;&#39;(contenant 8 x 2 mm de diamètre trous pré-percés aux deux extrémités des canaux) par plasma oxydant deux surfaces pendant 30 secondes. Fusible les fenêtres de verre sur le côté plat du disque PDMS (le côté ne contenant pas les canaux). </li><li> Insérez un 2-pouce de long tube flexible capillaire en silice fondue à travers le trou de chaque fenêtre en verre jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le canal. Insertion d&#39;une aiguille d&#39;abord, puis la suite avec le capillaire peut faciliter ce processus. Scellez les trous fenêtre en verre en utilisant un moyen rapide de cure coulée de silicone comme les Kwik-Cast. </li><li> Rincez les canaux avec de l&#39;éthanol et d&#39;eau, et le plasma-activer la cellule avec un fraîchement nettoyée, 1 pouce lamelle circulaire de quartz pendant 30 secondes. Nous vous suggérons de nettoyer ce lamelle en utilisant piranha *. Fusible la lamelle sur le côté de la cellule contenant les canaux, étanchéité des chambres. </li><li> Laisser la cellule assemblée pour guérir une nuit à température ambiante. </li></ol> * Piranha est une solution de H 2 O 2 et H 2 SO 4 dans des proportions 1:2.5. Pour nettoyer les lamelles, les plonger dans le piranha à 90 ° C pendant 20 min. 2 - Activer la surface pour l&#39;immobilisation molécule Pour les études d&#39;acides nucléiques, le schéma simple de surface immobilisation consiste à enduire d&#39;abord un verre ou lamelle de quartz avec biotinylé albumine sérique bovine (BSA), puis avec streptavidine. Cela permet à l&#39;échantillon biotinylé à être immobilisé avec une haute spécificité pour les jours à température ambiante. <ol><li> Relier les tubes flexibles pour les capillaires pour l&#39;injection de tampon facile en utilisant une seringue et une aiguille. </li><li> Injecter une solution de 0,1 mg / ml de BSA biotinylé dans le tampon A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM, filtrés en utilisant des filtres 0,02 um) dans le canal et incuber pendant au moins 30 min. </li><li> Débit de 300 à 500 pi de tampon A à enlever toute la BSA biotinylé libre à partir du canal, en faisant attention à ne pas coincer les bulles d&#39;air dans la chambre. </li><li> Injecter une solution de 0,1 mg / ml de streptavidine dans le tampon A et incuber pendant 15 min. Ensuite, répétez l&#39;étape 3. </li><li> L&#39;écoulement à travers une solution 3-5 pM de l&#39;échantillon biotinylé. Effectuer une analyse de surface pour vérifier la couverture des molécules fluorescentes. Si nécessaire, augmenter la concentration de l&#39;échantillon afin d&#39;obtenir une meilleure couverture. Incuber pendant 10 min et répétez l&#39;étape 3. </li></ol> La cellule microfluidique est monté sur une platine motorisée xy permettant grossier (jusqu&#39;à 25 mm) en utilisant le mouvement optiquement encodée moteurs à courant continu, et de fin (1 nm) en utilisant deux mouvements en boucle fermée actionneurs piézoélectriques (Physik Instrumente modèle M-014 ou similaire). Cela peut être fait avant ou après l&#39;activation de la surface pour l&#39;immobilisation de l&#39;échantillon. 3 - Préparer le tampon d&#39;imagerie (IB) L&#39;IB est constitué d&#39;un système d&#39;oxygène enzymatique balayage et un extincteur triplet, comme Trolox. Depuis l&#39;IB est rincé en permanence grâce à la nuit, au moins 10 ml doit être préparé à l&#39;avance. <ol><li> Préparer 10 ml de 0,8% p / v de D-glucose, au moins 35 mM Tris-HCl pH 8,0 et NaCl 50 mM dans de l&#39;eau déminéralisée. La plus forte concentration de tampon est important pour deux raisons: Trolox dissolution sera acidifier la solution, et la réaction enzymatique va aussi abaisser le pH de la solution au fil du temps. Depuis cette solution a une longue durée de vie peut être stocké sous forme de solution stock. </li><li> Dissolvez 5 mg de Trolox dans le tampon préparé à l&#39;étape 1 par vortex pendant quelques minutes puis agiter pendant&gt; 10 min. Trolox n&#39;est pas très soluble dans l&#39;eau à pH&gt; 7, donc ne vous précipitez pas cette étape. Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,2 um et de laisser le dégazage sous vide pendant 10 minutes. </li><li> Préparer le «gloxy&quot; solution enzymatique en mélangeant 60 ul water, 20 pl de tampon 5X A, 20 pl de la catalase, glucose oxydase 1 mg et 100 ul de 10 mg / ml de BSA. Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,22 um centrifugeuse. </li><li> Mélanger délicatement le tampon de l&#39;étape 2 avec le &quot;gloxy« solution de l&#39;étape 3 en évitant la formation de bulles d&#39;air. </li><li> Débit de l&#39;IB à travers le canal à un taux constant de 5 pl / min en utilisant une pompe seringue mécanique pour contrôler le débit. Bubble gaz argon dans le réservoir pour empêcher IB oxygène atmosphérique de re-dissoudre dans la mémoire tampon. </li></ol> Le balayage de surface, la localisation et l&#39;acquisition de molécules simples traces d&#39;intensité molécule est contrôlé par un programme LabVIEW qui permet la collecte automatisée de données 1. Le programme scanne 20x20 um deux zones à une résolution de 0,2 um, avec un taux de 0,1 um / ms. Les données sont immédiatement traitées pour produire l&#39;intensité pondéré emplacements de tous les pixels au-dessus des comptages de fond. Une fois les molécules immobilisées sont trouvés, ils sont déplacés un par un dans le volume confocal et les intensités des donateurs et fluorophore accepteur sont enregistrés en fonction du temps jusqu&#39;à deux photobleach fluorophores. La scène est alors programmé pour passer à une nouvelle origine 100 um loin, et le processus de numérisation est répété. 4 - Les résultats représentatifs Voici quelques images montrant la cellule microfluidique assemblés avant l&#39;activation de surface et après être monté sur le microscope prêt pour l&#39;immobilisation molécule. Si le canal est activé avec succès, balaye la surface devrait être similaire à l&#39;analyse décrite ci-dessous montrant d&#39;émission du donneur (vert) de teinture et de l&#39;accepteur (rouge) après l&#39;excitation directe des bailleurs de fonds. Ces molécules sont déplacés un par un dans le volume de sondage et la fluorescence est enregistrée au cours du temps jusqu&#39;à ce que les colorants photobleach, comme le montre les traces molécule unique. De traces comme celles-ci on peut obtenir l&#39;efficacité de FRET qui informe sur les instantanés donneur-accepteur de séparation, qui à son tour, est utilisé pour explorer la structure et la dynamique des molécules d&#39;intérêt biologique. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" border="0" /> Figure 1: cellule microfluidique avec quatre canaux, chacun avec entrée / sortie des capillaires. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" border="0" /> Figure 2: Cellule montée sur le microscope prêt pour les mesures. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Figure 3" border="0" /> Figure 3: Configuration pour SM-mesures de FRET. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Figure 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Figure 5" border="0" /> Figures 4 et 5: canal rouge et vert d&#39;une analyse de surface des molécules excitées immobilisé FRET avec le laser vert. S&#39;il vous plaît cliquer pour voir une version agrandie de la <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">figure 4</a> , ou <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">la figure 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Figure 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Figure 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Figure 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Figure 9" border="0" /> Les figures 6, 7, 8 et 9: Intensité des trajectoires des bailleurs de fonds (en vert) et accepteur (rouge) fluorophores étiqueté à une molécule d&#39;ADN 8, 10, 16 et 18 paires de bases d&#39;intervalle. S&#39;il vous plaît cliquer pour voir une version agrandie de la <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">figure 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">figure 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">figure 8</a> , ou <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">9 chiffres</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

Bien que le protocole ci-dessus a été optimisé pour notre système particulier et pour un choix spécifique de teintures (TMR et ATTO647N), il n&#39;est en aucun cas la seule méthode prouvée. Récemment, un système d&#39;oxygène alternatives balayage constitué d&#39;acide protocatéchique (PCA) / ​​protocatéchuate-3 ,4-dioxygénase (PCD) a été montré pour augmenter la photostabilité de certains colorants 4. De même, les autres triplet-état quenchers tels que β-mercaptoéthanol (BME) peut être utilisé à la place de Trolox, bien que ceux-ci pourraient ne pas supprimer la longue durée de clignoter de certains colorants, en particulier Cy5 5. Bien immobilisation par biotine-streptavidine biotinylé albumine sérique bovine (BSA) est le choix préféré pour les études des acides nucléiques, un polyéthylène glycol (PEG) à revêtement de surface est mieux adapté pour les études des protéines car elle empêche les non-adhérence spécifique 1. En outre, les sous-diffraction limitée vésicules taille peut être utilisé pour encapsuler des biomolécules d&#39;intérêt dans les cas où elle peut être affectée par les interactions de surface 6. Dans cet article, nous avons utilisé une configuration confocale équipé photodiodes à avalanche en silicone pour acquérir les traces d&#39;intensité de fluorescence. Ce protocole fonctionne aussi bien avec Total Internal Reflection Fluorescence microscopes (FRBR) équipé de caméras CCD. Indépendamment de la microscopie à utiliser, sm-FRET peut informer sur les résolutions spatiales approcher l&#39;angström lorsque le donateur et le signal de l&#39;accepteur sont correctement corrigés 7.

<table><tbody><tr><td>Tuyau capillaire en silice fondue</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>Lame de couverture en silice fondue</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>Tuyau</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA biotinylée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'élastomère Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>Kit d'élastomère en silicone</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Scellant Kwik-Cast</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>Composé de moulage en silicone</td></tr></tbody></table>

système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée biomolécules

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopie a été largement utilisée pour étudier la structure et la dynamique des molécules d&#39;intérêt biologique, tels que les acides nucléiques et des protéines. Seule molécule de FRET (sm-FRET) des mesures sur molécules immobilisées permettent des observations à long du système de manière efficace tant que les deux colorants photobleach-résultant en temps des traces de ce rapport sur la dynamique biomoléculaire avec un large éventail d&#39;échelles de temps allant de quelques millisecondes à quelques minutes. Pour faciliter l&#39;acquisition d&#39;un grand nombre de traces pour les analyses statistiques, le processus doit être automatisé et l&#39;environnement de l&#39;échantillon doit être étroitement contrôlé sur le temps de mesure entière (~ 12 heures). Ceci est accompli en utilisant un microscope confocal à balayage automatisé qui permet à l&#39;interrogatoire de milliers de molécules uniques pendant la nuit, et une cellule microfluidique qui permet l&#39;échange contrôlé de tampon, avec la teneur en oxygène limité et maintient une température constante pendant toute la période de mesure. Ici, nous montrons comment assembler le dispositif microfluidique et comment activer sa surface pour l&#39;immobilisation d&#39;ADN. Ensuite, nous expliquent comment préparer un tampon pour maximiser la durée de vie et de photostabilité des fluorophores. Enfin, nous montrons les étapes impliquées dans la préparation de l&#39;installation pour l&#39;acquisition automatisée de résolution dans le temps seule molécule FRET traces de molécules d&#39;ADN.

Dans cet article, nous décrivons comment nous obtenons FRET traces de molécules individuelles d&#39;ADN immobilisés sur une surface en utilisant un microscope confocal à balayage automatisé.

Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules

La microscopie par transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (FRET) a été largement utilisée pour étudier la structure et la dynamique de molécules d'intérêt biologique, ...

Pour étudier la dynamique de molécules individuelles sur une période prolongée, il est nécessaire de localiser d'abord ces molécules dans l'espace. Nous y parvenons en les immobilisant à la surface d'une cellule microfluidique. La procédure commence par l'assemblage de la cellule, qui contient quatre chambres où les biomolécules seront fixées.Les chambres sont reliées à l'extérieur par des capillaires d'entrée et de sortie. La cellule est fabriquée en fusionnant un disque de PDMS structuré avec une lame de couverture en quartz. La cellule assemblée est ensuite montée sur le microscope à fluorescence et des tubulures flexibles sont connectées aux capillaires afin de permettre un échange facile des solutions à travers les chambres, dans un premier temps pour activer la surface en immobilisant des molécules, puis en faisant circuler une solution d'albumine sérique bovine biotinylée à travers l'un des canaux.L'albumine sérique bovine (BSA) va s'adsorber sur la chambre. Ensuite, faites circuler une solution de streptavidine, qui se liera à la biotine. Enfin, faites circuler votre oligonucléotide biotinylé, qui se liera à la streptavidine, ancrant ainsi la molécule d'intérêt à la surface du coverslip en quartz.Un tampon d'imagerie conçu pour maximiser la stabilité et l'intensité de la durée de vie des fluorophores est acheminé dans la chambre à un débit constant pendant toute la période d'acquisition. Le dispositif automatisé analyse différentes sections de la surface à la recherche de molécules possédant à la fois des fluorophores donneurs et accepteurs, puis les déplace une par une dans le volume d'analyse afin d'obtenir pour chacune une courbe d'intensité de fluorescence en fonction du temps, jusqu'à ce que les deux fluorophores subissent une photobléachisation. Bonjour, je suis Nicholas Dfi du laboratoire du professeur Miller, du département de génie biomédical de l'Université de Boston.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'obtenir des traces F de molécules uniques à partir d'acides nucléiques immobilisés, en utilisant un dispositif confocal. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la dynamique des acides nucléiques ainsi que les interactions entre acides nucléiques et enzymes. Commençons donc.Le Microfluid Excel est fabriqué en fusionnant un disque en polydiméthylsiloxane (PDMS) de deux millimètres d'épaisseur, préalablement gravé, à une lame de couverture en quartz fraîchement nettoyée. Pour réaliser le disque en PDMS structuré, mélangez 10 parties de base d'élastomère de silicone avec une partie d'agent de réticulation, homogénéisez soigneusement puis dégazez pendant une heure sous vide. Une fois l'élastomère de silicone dégazé, versez-le délicatement dans le moule de la cellule microfluidique.Laisser le mélange d'élastomère durcir sur un bloc chauffant à 70 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois durci, décoller délicatement le disque de PDMS du moule à l’aide d’une lame de rasoir. Le disque de PDMS contient quatre chambres rectangulaires de 30 microlitres.Fusionner le côté plat du disque en PDMS, c’est-à-dire le côté ne contenant pas les canaux, sur une fenêtre en verre de un pouce à l’aide d’une oxydation au plasma des deux surfaces pendant 30 secondes. La fenêtre en verre comporte huit trous de deux millimètres aux deux extrémités des canaux, préalablement percés. Ensuite, un tube capillaire souple en silice fondue d’une longueur de deux pouces est inséré dans chaque trou de la fenêtre en verre.Pour ce faire, insérez d'abord une aiguille, puis introduisez le tube capillaire jusqu'à ce qu'il atteigne le canal. Scellez les orifices de la fenêtre en verre à l'aide d'un composé de moulage en silicone à prise rapide, comme le quick cast. Rincez les canaux à l'éthanol et à l'eau après avoir activé la cellule au plasma et utilisé une lame de couverture circulaire en quartz de un pouce, récemment nettoyée au piranha, pendant 30 secondes.Sceller la lame sur le côté de la cellule contenant les canaux. Les chambres sont désormais étanches. Laisser durcir la cellule assemblée toute la nuit à température ambiante.Après que le microfluidique Excel assemblé ait polymérisé toute la nuit, il est placé dans un support sur mesure et monté sur la platine du microscope confocal afin de commencer l'activation de la surface de la cellule. Pour l'immobilisation des molécules, reliez un tube souple aux capillaires de la cellule afin de faciliter l'injection de tampon à l'aide d'une seringue et d'une aiguille. Injectez ensuite une solution de BSA biotinylée à 0,1 milligramme par millilitre dans le tampon A dans le canal et incubez pendant au moins 30 minutes.Après une incubation de 30 minutes, faire circuler 300 à 500 microlitres de tampon A afin d'éliminer toute trace de BSA biotinylée non absorbée dans le canal, en prenant soin de ne pas emprisonner de bulles d'air dans la chambre. Ensuite, injecter une solution de 0,1 milligramme par millilitre de STR din dans le tampon A et incuber pendant 15 minutes.Après l'écoulement du temps d'incubation de 15 minutes, faire circuler 300 à 500 microlitres de tampon A afin d'éliminer tout streptavidine non absorbée du canal. Comme précédemment, éviter de piéger des bulles d'air dans la chambre. Enfin, faire circuler une solution de trois à cinq picomolaires de l'échantillon biotinylé.Pour vérifier la couverture des molécules fluorescentes, un balayage de surface est effectué. Incubez l'échantillon biotinylé pendant 10 minutes et répétez l'écoulement du tampon. Comme indiqué précédemment, le tampon d'imagerie ou IB comprend un système enzymatique de piégeage de l'oxygène et un inhibiteur de l'état triplet tel que les trol, qui doivent être dissous en premier pour préparer le IB.Cinq milligrammes de trol se lient à 10 millilitres de tampon glucosé par vortexage pendant quelques minutes et agitation pendant au moins 10 minutes. Filtrer la solution et la laisser dégazer sous vide pendant 10 minutes. Mélanger délicatement la solution de verrouillage TRO avec la solution enzymatique Glocky tout en évitant la formation de bulles d'air.Remplissez le réservoir avec la solution IB. Ensuite, à l’aide d’une pompe à seringue mécanique, contrôlez le débit en faisant circuler l’IB dans le canal à un débit constant de cinq microlitres par minute, et faites barboter du gaz argon dans le réservoir d’IB afin d’empêcher l’oxygène atmosphérique de se dissoudre dans le tampon. La numérisation de surface, la localisation des molécules et l’acquisition des courbes d’intensité de molécules uniques sont contrôlées par le programme LabVIEW, qui analyse des zones de 20 par 20 micromètres carrés avec une résolution de 0,2 micromètre à une vitesse de 0,1 micromètre par milliseconde.Les données provenant du balayage de surface sont immédiatement traitées afin d'obtenir les positions pondérées par l'intensité de tous les pixels dont le nombre de signaux dépasse le niveau du fond. Une fois les molécules immobilisées détectées, elles sont déplacées une par une dans le volume confocal et les intensités des fluorophores donneur et accepteur sont enregistrées en fonction du temps jusqu'à ce que les deux fluorophores subissent une photobléach. La platine est ensuite programmée pour se déplacer vers une nouvelle origine située à 100 millimètres de distance, et le processus de balayage est répété.Le MICROFLUID Excel assemblé est montré ici. Il s'agit de balayages de surface montrant des molécules uniques dans les canaux donneur vert et accepteur rouge. Quelques tracés typiques de molécules uniques, affichant l'intensité de l'accepteur en rouge et celle du donneur en vert, sont présentés.Nous venons de vous montrer comment obtenir des traces de molécules uniques à partir de biomolécules immobilisées en utilisant un dispositif confocal. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous rappeler d'exécuter chaque étape avec soin et de prendre votre temps, car il s'agit d'une expérience délicate. Voilà, c'est terminé.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Cette vidéo montre des expériences avec l'analyse subséquente des interactions protéine-protéine par l'utilisation de micro-surfaces texturées. L'approche offre la possibilité de détecter les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et combine haute capacité de débit avec la possibilité d'extraire des informations quantitatives.

In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

Les interactions protéine-protéine sont visualisées dans les cellules avec une résolution spatiale nanométrique en combinant la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) avec la microscopie de localisation photoactivée (PALM). L’utilisation de BiFC-PALM pour l’imagerie des interactions Ras-Raf dans les cellules U2OS permet de visualiser le regroupement à l’échelle nanométrique et la diffusion de complexes Ras-Raf individuels.

Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

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Information sur la structure à partir d&#39;une seule molécule FRET expériences utilisant la Nano-positionnement Système rapide

Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des données de trois couleurs smFRET et son analyse avec un ensemble 3D modèle de Markov caché. Avec cette approche, les scientifiques peuvent extraire informations cinétiques systèmes complexe des protéines, y compris coopérativité ou interactions corrélées.

À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine

Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’homogénéité étiquetage pour chaque espèce de protéine dans un échantillon complexe des protéines à l’échelle de la molécule.

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

Cet article fournit des instructions étape par étape pour effectuer des mesures FRET précises entièrement corrigées sur des biomolécules individuelles à diffusion libre à l’aide de la smfBox open source et peu coûteuse, de l’allumage à la collecte et à l’analyse de données, en passant par l’alignement et la mise au point.

Effectuer des mesures FRET à molécule unique précises et précises à l’aide de la smfBox open source

Cet article présente une méthode d’analyse spatio-temporelle de sondes mobiles à transfert d’énergie de résonance de Förster (smFRET) à molécule unique utilisant la microscopie à fluorescence à grand champ. La boîte à outils logicielle nouvellement développée permet de déterminer les traces temporelles smFRET des sondes en mouvement, y compris l’efficacité FRET correcte et les positions moléculaires, en tant que fonctions du temps.

Analyse spatio-temporelle bidimensionnelle automatisée de sondes FRET mobiles à molécule unique

Ici, un protocole pour effectuer et analyser la liaison, la mobilité et l’assemblage de molécules uniques sur des membranes lipidiques artificielles encombrées à l’aide de la microscopie à fluorescence interne totale à molécule unique (smTIRF) est présenté.

Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Ici, nous présentons le protocole pour étudier la flexibilité locale et la dynamique des biomolécules en utilisant l’anisotropie de fluorescence résolue en temps au niveau de la molécule unique en mode microscopie confocale.

Anisotropie de fluorescence résolue dans le temps à partir de molécules uniques pour caractériser la flexibilité locale dans les biomolécules

Ce protocole décrit le marquage à anticorps unique (SAL) pour résoudre l’organisation spatiale à l’échelle nanométrique des protéines de la membrane plasmique. En tirant parti des interactions cumulatives anticorps-épitope au niveau de la molécule unique, le SAL membranaire (mSAL) cartographie les distributions locales des épitopes tout en capturant simultanément le comportement de liaison des anticorps dans l’environnement cellulaire natif.

Microscopie de localisation à une seule molécule des protéines membranaires utilisant le marquage à anticorps unique

Apprenez à obtenir des traces FRET de molécules d'ADN individuelles immobilisées sur une surface à l'aide d'un microscope confocal à balayage automatisé. Cette méthode permet d'étudier la dynamique des acides nucléiques et leurs interactions enzymatiques en temps réel.

Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules

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