Name: L’utilisation du SC1 (Pluripotin) pour soutenir l’auto-renouvellement des CSEm en l’absence de LIF (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Apprenez à maintenir l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires de souris avec la molécule SC1, alternative économique au facteur LIF. Cette méthode permet de préserver la pluripotence sans protéine coûteuse.

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5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Sheng Ding de l'Institut de recherche Scripps et le Dr Hongkui Deng de l'Université de Pékin pour leur aide et leurs orientations.

1. Préparation des plaques de cellules nourricières MEF
<ol>
<li>Un jour avant la culture des cellules ES, décongelez un flacon de cellules sérotonineuses MEF CF-1 E14,5 irradiées (voir notre protocole sur la décongélation des cellules ES).</li>
<li>Ensemencez les cellules sérotonineuses MEF à une densité de 10 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits. Incubez les cellules toute la nuit à 37 °C et 5 % CO2. Milieu pour cellules MEF : DMEM supplémenté avec 10 % de PBS-ES, 1X de glutamine et 1X d'acides aminés non essentiels.</li>
</ol>
2. Maintien de l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires de souris
<ol>
<li>Détacher les cellules ES à l’aide de trypsine. Ensemencer les cellules à une densité de 50 000 cellules/puits sur des plaques de cellules nourricières MEF préparées au préalable, dans un milieu de croissance (Knockout MEM complété avec 15 % de KSR, 4 mM de L-glutamine, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels et 1X BME) supplémenté avec du SC1 à la concentration souhaitée (nous avons utilisé 100 nM, 300 nM et 1 μM). Nous avons également ajouté un puits témoin positif supplémenté avec 1000 μ/ml de LIF. Incuber les cellules toute la nuit à 37 °C et 5 % CO2.</li>
<li>Entretenir les cellules à 37 °C et 5 % CO2 pendant 3 à 4 jours à chaque passage. Renouveler le milieu toutes les 48 heures.</li>
<li>Passager les cellules à un ratio de 1:10 à 1:15 à l’aide de trypsine afin de maintenir une densité similaire à celle du semis initial. Après 5 passages, les cellules peuvent être analysées pour l'expression des marqueurs typiques de pluripotence par immunocytochimie.</li>
</ol>
3. Examen immunocytochimique des marqueurs de pluripotence
<ol>
<li>Laver doucement les cellules trois fois avec du PBS.</li>
<li>Fixer les cellules avec 500 μl de fixateur pendant 20 minutes à température ambiante.</li>
<li>Laver doucement les cellules trois fois avec du PBS.</li>
<li>Bloquer la liaison non spécifique avec 500 μl de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.</li>
<li>Incuber les cellules avec 250 μl d'anticorps primaire spécifique (nous avons utilisé Nanog, Sox2, SSEA1 et Oct4 aux dilutions suivantes : 1:500, 1:2000, 1:500 et 1:500).</li>
<li>Laver doucement les cellules trois fois avec du PBS.</li>
<li>Incuber les cellules avec 250 μl d'anticorps secondaire pendant deux heures à température ambiante, à l'abri de la lumière (nous avons utilisé un anticorps secondaire de âne anti-souris conjugué à Alexa Fluor® 555 à 1:2000 et un anticorps secondaire de âne anti-lapin conjugué à Alexa Fluor® 488 à 1:2000).</li>
<li>Laver doucement les cellules trois fois avec du PBS.</li>
<li>Ajouter du DAPI (concentration finale de 1 μg/ml) au dernier lavage et incuber pendant 5 minutes pour visualiser les noyaux.</li>
<li>Analyser les cellules au microscope à fluorescence.</li>
</ol>
4. Résultats représentatifs :
1. Résultats de la morphologie :
Les cellules souches embryonnaires de souris (ESC R1) ont été cultivées sur des cellules nourricières MEF en présence de LIF ou de SC1 afin de maintenir l'auto-renouvellement à un stade indifférencié. Après le deuxième passage, une différenciation pouvait être observée chez les cellules ne recevant ni LIF ni SC1 (contrôle négatif), et après 5 passages, essentiellement aucune colonie indifférenciée n'était observée. Les colonies traitées au LIF (contrôle positif) sont restées à un stade indifférencié tout au long des 5 passages cellulaires. Les cellules traitées au SC1 à des concentrations de 300 nM ou 100 nM sont également restées indifférenciées après 5 passages, cependant, les cellules traitées avec 1 μM de SC1 ont subi une mort cellulaire après le quatrième passage. (fig. 2 de la note d'application) Le tableau 1 résume les observations morphologiques.
2. Expression des marqueurs de pluripotence
Des cellules souches embryonnaires de souris maintenues pendant 5 passages ont été fixées et examinées par immunocytochimie pour SSEA1, Oct4, Nanog et Sox2. L'expression des marqueurs était similaire à celle des cellules maintenues en présence de LIF. (fig. 3 et 4 de la note d'application)
<img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Microscopie en contraste de phase des cellules R1 maintenues avec LIF ou SC1 ; comparaison de la morphologie cellulaire." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Comparaison de la morphologie des cellules maintenues en présence de LIF ou de SC1. Aucune différence de morphologie n'a été observée.
<img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Immunocytochimie des cellules R1, conditions LIF et SC1, marqueurs Nano, Sox, SSEA, Oct, DAPI, 10X." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2 et 3"> Figure 2 et Figure 3 : Coloration des cellules souches embryonnaires pour Nanog, SSEA1, Sox2 et Oct4, maintenues avec SC1 ou LIF (figure 4 de la note d'application). Les cellules maintenues en présence de SC1 présentent une expression des marqueurs de pluripotence similaire à celle des cellules maintenues en présence de LIF.
Tableau 1
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Témoin négatif</td>
 <td>Témoin positif LIF</td>
 <td>SC1 1 µM</td>
 <td>SC1 300 nM</td>
 <td>SC1 100 nM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1er passage</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2e passage</td>
 <td>Quelques morphologies différenciées</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3e passage</td>
 <td>Majorité des cellules différenciées</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4e passage</td>
 <td>Aucune colonie de CSE</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Mort cellulaire observée</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5e passage</td>
 <td>Différenciées</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Mort cellulaire observée</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 <td>Morphologie normale des cellules ES</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs de cet article sont employés par Stemgent, société qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

La petite molécule SC1 peut être utilisée pour maintenir l'auto-renouvellement à l'état indifférencié des cellules souches embryonnaires murines. Toutefois, avant utilisation sur une lignée cellulaire non testée, il convient de la titrer afin de déterminer la concentration optimale. Par exemple, nous avons testé trois concentrations sur la lignée de cellules souches embryonnaires murines ESC R1. Les concentrations de 100 nM et 300 nM ont permis de maintenir les cellules souches embryonnaires murines, tandis qu'une concentration de 1 μM s'est révélée toxique.
SC1 peut également être utilisé dans des conditions sans cellules nourricières.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>anticorps SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>anticorps Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>anticorps Sox2</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>anticorps Oct4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

l'utilisation du sc1 (pluripotin) pour soutenir l'auto-renouvellement des mesc en l'absence de lif

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Les cellules souches embryonnaires (ES) de souris sont habituellement cultivées avec un facteur d'inhibition de la leucémie (LIF) pour maintenir leur auto-renouvellement.1Cependant, le LIF est coûteux et l'activation de la voie LIF/JAK/STAT3 n'est pas absolument nécessaire pour maintenir l'état d'auto-renouvellement.2La molécule SC1 pourrait constituer une alternative économique au facteur de leucémie inhibiteur (LIF). La molécule SC1 agit par inhibition double de Ras-GAP et d'ERK1.3Illustration de son mécanisme d'action, ce qui en fait un outil utile pour étudier le mécanisme moléculaire fondamental de l'auto-renouvellement. Ici, nous démontrons la procédure de culture de cellules souches embryonnaires murines en présence de SC1 et montrons qu'elles sont capables de maintenir l'auto-renouvellement en l'absence de LIF. Les cellules cultivées avec SC1 présentaient une morphologie similaire à celle des cellules maintenues avec LIF. Les deux présentaient une morphologie typique des cellules souches embryonnaires murines après cinq passages. L'expression de marqueurs typiques de pluripotence (Oct4, Sox2, Nanog et SSEA1) a été observée après cinq passages en présence de SC1. De plus, SC1 n'a causé aucune toxicité apparente sur les cellules souches embryonnaires murines.

La protéine SC1 agit par inhibition double de Ras-GAP et d'ERK1. Nous avons évalué la fonction de SC1 dans le maintien de l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires murines en l'absence de LIF, et avons montré que SC1 est capable de maintenir l'auto-renouvellement des cultures de cellules souches embryonnaires murines.

L'utilisation du SC1 (Pluripotin) pour soutenir l'auto-renouvellement des mESC en l'absence de LIF

Les cellules souches embryonnaires (ES) de souris sont classiquement cultivées avec le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) pour maintenir leur auto-renouvellement.1 Cependant, le LIF est coûteux et ...

Bonjour, je suis Sarah NAU du laboratoire STEM Gen à Boston. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de maintenir l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires de souris en présence de la petite molécule C1 mousse. Les cellules souches embryonnaires sont normalement cultivées en présence du facteur inhibiteur de la leucémie pour maintenir leur auto-renouvellement.L est cependant coûteux. Nous allons donc proposer ici une alternative économique, la molécule de petite taille SC1. Dans la dernière partie de la vidéo, nous vous montrerons une comparaison de l'expression des marqueurs de pluripotence entre les cellules cultivées dans L et celles cultivées dans SC1.Commençons donc. Un jour avant la culture des cellules souches embryonnaires, décongelez un flacon de cellules nourricières irradiées. Ensemencez les cellules nourricières à une densité de 10 000 cellules par puits.Dans une plaque de 12 puits, incuber les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, ensemencer les cellules ES sur la couche de cellules nourricières MEF à une densité de 50 000 cellules par puits sur les plaques préparées avec des cellules nourricières, dans un milieu de croissance supplémenté en SC1 à la concentration souhaitée : nous avons utilisé 100 nanomolaires, 300 nanomolaires et 1 micromolaire.En tant que témoin, nous ajoutons un puits qui a été complété avec 1000 microgrammes par millilitre de LIF. Incuber ensuite les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Le lendemain, renouvelez le milieu pour la culture continue. Renouvelez le milieu toutes les 48 heures lors du repiquage des cellules, un passage pour 10 toutes les trois à quatre journées, afin de maintenir une densité similaire à la densité initiale de semis. Après cinq passages, nous pouvons désormais vérifier l'expression des marqueurs typiques de pluripotence à l'aide de l'immunochimie pour commencer l'immunochimie des cellules souches.Commencez par laver délicatement les cellules trois fois avec du PBS. Fixez les cellules avec 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules dans du PBS trois fois supplémentaires, bloquez la liaison non spécifique avec 500 microlitres de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.Ensuite, ajoutez 250 microlitres de l'anticorps primaire aux cellules et laissez-les incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit. Dans cette expérience, nous effectuons l'incubation avec les anticorps nano SOX deux, SSEA un et OCT quatre. Après une autre série de lavages, incubez les cellules avec 250 microlitres de l'anticorps secondaire marqué par un colorant fluorescent pendant deux heures à température ambiante, en les protégeant de la lumière, puis lavez les cellules une dernière fois en ajoutant du DAPI à une concentration finale de un microgramme par millilitre lors du dernier lavage.Incubez ensuite les cellules pendant cinq minutes afin de colorer les noyaux. Enfin, analysez les cellules au microscope à fluorescence. Ci-dessous sont présentées des images en champ clair de cellules souches embryonnaires de souris cultivées sur des cellules nourricières en présence de LIF ou de SC un, afin de maintenir l'auto-renouvellement dans un état non différencié.Ici, des cellules souches embryonnaires de souris sont montrées, qui ont été maintenues pendant cinq passages. Les cellules ont été fixées et examinées par immunocytochimie pour SSEA-1, OCT-4, Nanog et SOX-2. L'expression des marqueurs pour les cellules maintenues dans le milieu C1 était similaire à celle des cellules maintenues en présence de LIF.Nous venons de vous montrer comment utiliser la molécule SC un pour maintenir l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires de souris. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la concentration de la molécule SC un doit être titrée afin de déterminer la concentration optimale avant d'être utilisée sur une lignée cellulaire non testée. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Utilisation de SC1 (Pluripotin) pour soutenir l’auto-renouvellement des mESC en absence de LIF

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