Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

Bonjour, je m’appelle Brad Hamilton. Je suis un scientifique ici dans le département de recherche et développement ici à STEM Gen. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure sur la façon de reprogrammer les fibroblastes humains à l’aide de facteurs de reprogrammation lentiviraux.

Cette procédure peut être utilisée à la fois pour générer des cellules IPS et étudier le processus de reprogrammation. Les cellules IPS sont similaires aux cellules ES en termes de morphologie, de prolifération et de capacité de différenciation, ainsi qu’à tous les types de tissus du corps. Les cellules IPS humaines ont un avantage certain sur les cellules ES car elles présentent des propriétés clés des cellules ES sans le dilemme éthique de détruire un embryon pour obtenir les cellules.

La génération de cellules IPS spécifiques au patient contourne un obstacle important aux thérapies de médecine régénérative personnalisées en éliminant le potentiel de rejet immunitaire des cellules transplantées non autologues. Alors commençons. À plusieurs reprises dans ce protocole, vous remplacez le milieu de l’IPSC en développement ou des cellules souches pluripotentes induites par un milieu conditionné à la méthamphétamine.

La préparation de ce support prend six jours. Commencez donc au moins une semaine avant de commencer votre expérience. Pour commencer, semez chaque puits d’un six.

Plaque de puits avec deux fois 10 à la cinquième cf une cellule d’alimentation de méthamphétamine dans deux millilitres de croissance de méthamphétamine. Incuber à moyen pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, changez de milieu pour une culture cellulaire humaine E-S-I-P-S.

Incuber à moyen pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Recueillir le surnageant et le remplacer par un milieu frais toutes les 24 heures pendant quatre jours. Filtrez le surnageant à travers un filtre de 0,22 micromètre.

Complétez le surnageant collecté avec 15 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes BFGF basic. Vous vous retrouverez avec environ 16 millilitres de méthamphétamine conditionnée pour stocker chaque jour le surnageant collecté séparément à quatre degrés SIU. Le milieu conditionné à la méthamphétamine peut être stocké pendant une à deux semaines à quatre degrés Celsius ou pendant plusieurs mois à moins 20 degrés Celsius.

Maintenant que vous êtes assuré que votre milieu conditionné à la méthamphétamine sera prêt lorsque vous en aurez besoin, parlons de la préparation des cellules. La première tâche de la génération d’IPSC consiste à utiliser des lentivirus pour transduire, des cellules fibroblastiques du prépuce humain, ou des cellules BJ avec quatre caractéristiques de transcription des cellules souches. Pour préparer la transduction, ensemencer des cellules BJ à une densité de un fois 10 à la cinquième cellules par puits d’une plaque à six puits et d’une culture.

Les cellules en deux millilitres de croissance, moyennes pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le même jour. Commencez à préparer des plaques d’alimentation en méthamphétamine en ajoutant deux millilitres de gélatine à 0,1 % diluée dans de l’eau dans une plaque à six puits et en incubant pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. La gélatine enrobe les puits et sert de matrice à ceux-ci.

Maintenant, les cellules BJ sont prêtes pour la transduction lentivirale afin de préparer le virus à la transduction. Complétez deux millilitres de milieu frais avec six microgrammes par millilitre de poly cerveau et quatre lentivirus exprimant chacun l’un des facteurs de transcription humains. T quatre, SO deux nanog et lin 28, de sorte que chacun est à la même multiplicité d’infection ou MOI.

Ces lentivirus sont tous inclus dans l’ensemble des lentivirus du facteur de reprogrammation humaine. Pour effectuer la transduction, il suffit de remplacer le milieu de croissance des cellules BJ par le milieu contenant le virus. Basculez doucement l’assiette pour que le milieu enrobe uniformément le fond.

Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le même jour. Retirez un flacon de cellules d’alimentation de méthamphétamine de l’azote liquide et décongelez-le. Retirez la solution de gélatine des plaques d’alimentation de méthamphétamine, qui sont maintenant enrobées de gélatine sur chacune d’elles.

Eh bien, ajoutez 0,2 fois 10 aux cinquièmes cellules dans deux millilitres de croissance de méthamphétamine. Douleur moyenne. Incuber le MES pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, détachez les cellules BJ avec 0,05 % de trypsine EDTA et centrifugez-les à 200 G pendant cinq minutes.

Après la centrifugation, aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans le milieu de croissance. Retirez le milieu de la plaque d’alimentation de méthamphétamine et ajoutez deux millilitres par puits de suspension de cellules BJ. La concentration de cellules BJ doit être d’environ cinq fois 10 pour la quatrième cellule par puits.

Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. 24 heures après le recul, les cellules BJ sur la plaque d’alimentation de méthamphétamine remplacent le milieu par E-S-I-P-S humain, c’est-à-dire une culture de cellules souches embryonnaires ou pluripotentes induites. Douleur moyenne. Continuez à changer de support toutes les 24 heures pendant sept jours.

Le septième jour, remplacez le milieu de culture cellulaire ES par deux millilitres de milieu conditionné à la méthamphétamine. Les cellules nourricières de méthamphétamine ont fourni les facteurs solubles nécessaires à la croissance des cellules IPS. Mais maintenant, nous devons ajouter davantage de ces facteurs pour maintenir la culture saine.

milieu conditionné à la méthamphétamine contient tous les facteurs solubles sécrétés par les cellules d’alimentation de méthamphétamine qui incubent pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. En regardant à travers l’oscilloscope, sélectionnez une colonie de cellules. Se distinguant par une petite apparence compacte en forme de dôme dans une plaque fraîche de 24 puits que vous avez précédée 24 heures auparavant avec ccf, une cellule nourricière de méthamphétamine recule la colonie sélectionnée dans la culture humaine E-S-I-P-S.

Milieu complété par 10 molécules souches micromolaires Y 2 7 6 3 2. Un inhibiteur de kinase dépendant. Changer le milieu de culture sans compléter avec la molécule souche Y 2 7 6 3 2 toutes les 24 heures pendant les sept premiers jours.

Après sept jours, changez de médium pour de la méthamphétamine. Condition à moyen continuer à traverser les cellules jusqu’à ce qu’elles présentent une morphologie typique des cellules ES humaines. Recherchez de petites colonies compactes en forme de dôme qui ont un bord tranchant.

Les colonies doivent être uniformes et avoir un rapport élevé entre le noyau et le cytoplasme. À ce stade, vous avez développé des colonies qui ont la morphologie des cellules ES, mais expriment-elles également des gènes caractéristiques des cellules ES ? Pour le savoir, colorez les colonies pour des marqueurs de pluripotence tels que TRA 180 1 TRA un 60 SSEA quatre s, SE, un trois T quatre sox, deux nanog et SSEA un Pour commencer, lavez doucement les cellules trois fois avec du PBS.

Ensuite, fixez les cellules avec 500 microlitres de paraforme, d’aldéhyde ou d’un autre fixateur à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante. Après 20 minutes, lavez les cellules avec du PB S3 plusieurs fois pour éliminer l’excès de fixateur. Ensuite, bloquez la liaison non spécifique en incubant les cellules dans 500 microlitres de tampon de blocage par puits pendant une heure à température ambiante Après l’étape de blocage, ajoutez 250 microlitres d’anticorps primaires dilués de un à 100 dans un tampon de blocage à chacun.

Eh bien, incubez les cellules dans l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pour éliminer l’anticorps primaire non lié. Incuber les cellules avec 250 microlitres d’anticorps secondaires dilués de un à 300 et tampon bloquant pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière pour éviter le photoblanchiment après incubation avec l’anticorps secondaire.

Lavez les cellules trois fois avec du PBS jusqu’au troisième lavage. Ajoutez un DPI à un microgramme par millilitre pour colorer les noyaux. Enfin, analysez l’expression génique de vos cellules IPS.

Sous le microscope, les résultats de la morphologie des cellules de fibroblastes de la peau humaine ont été observés dès le quatrième jour après la transduction, et l’amas de cellules est devenu plus serré au jour 17 de l’expression des marqueurs de puissance plurry. Pour caractériser davantage les colonies de cellules IPS isolées, nous avons recherché la présence de marqueurs de pluripotence communs exprimés dans les cellules ES. Les colonies présentaient une forte activité de phosphatase alcaline.

De plus, l’immunochimie ou ICC a été réalisée sur les colonies de cellules IPS avec un panel d’anticorps spécifiques aux marqueurs de pluripotence, y compris les marqueurs de surface TA 180 1, TRA un 60, SSEA quatre et SS EEA trois, ainsi que les marqueurs nucléaires, T quatre, SOX deux et Nanog. Les colonies isolées de l’IPS étaient positives pour tous les marqueurs. Les résultats de l’ICC montrent que les cellules IPS présentaient le modèle d’expression du marqueur de pluripotence approprié, démontrant que ces cellules IPS ressemblent étroitement aux cellules humaines indifférenciées.

Nous venons de vous montrer comment générer des cellules IPS en reprogrammant des fibroblastes humains avec des gènes souches. Facteur de reprogrammation humaine lentivirus ensemble. Lors de cette procédure, il est important de prendre en compte plusieurs facteurs.

Tout d’abord, il peut être nécessaire de modifier le rapport virus/cible actif au cours de l’étape de transduction primaire pour obtenir une efficacité de transduction optimale. Deuxièmement, l’état de croissance des cellules cibles peut avoir un impact. Les cellules saines et prolifératives sont plus susceptibles d’être reprogrammées.

Troisièmement, lors de la modification du protocole pour différents nombres de cellules, il est recommandé que les numéros de cellules cibles soient ajustés proportionnellement à la surface de la boîte de culture. Enfin, l’application d’inhibiteurs de roche tels que Y 2, 7, 6, 3, 2 devrait être envisagée pour aider à assurer une reprogrammation réussie, car des études récentes ont démontré son utilité pour améliorer la survie des colonies humaines. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.