Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

Bonjour, je m'appelle Brad Hamilton. Je suis scientifique au sein du département Recherche et Développement de STEM Gen. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de reprogrammer des fibroblastes humains à l'aide de facteurs de reprogrammation délivrés par un lentivirus.

Cette procédure peut être utilisée à la fois pour générer des cellules IPS et pour étudier le processus de reprogrammation. Les cellules IPS sont similaires aux cellules ES quant à leur morphologie, leur prolifération et leur capacité à se différencier en tous les types de tissus du corps. Les cellules IPS humaines présentent un avantage distinct par rapport aux cellules ES, car elles possèdent des propriétés clés des cellules ES sans le dilemme éthique lié à la destruction d'un embryon pour obtenir ces cellules.

La génération de cellules IPS spécifiques à chaque patient contourne un obstacle majeur des thérapies de médecine régénérative personnalisée en éliminant le risque de rejet immunitaire des cellules transplantées non autologues. Commençons donc. À plusieurs étapes de ce protocole, vous remplacez le milieu des cellules souches pluripotentes induites (IPSC) en cours de développement par un milieu conditionné au méthylcellulose.

La préparation de ce milieu prend six jours. Commencez donc au moins une semaine avant de vouloir démarrer votre expérience. Pour commencer, ensemencez chaque puits d'une six.

Plaque de culture avec deux fois 10 puissance cinq cellules nourricières de type cf1 en deux millilitres de milieu de croissance pour les cellules meth. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, remplacer le milieu par du milieu de culture pour cellules E-S-I-P-S humaines.

Incuber le milieu toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Recueillir le surnageant et le remplacer par du milieu frais toutes les 24 heures pendant quatre jours. Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 micromètre.

Compléter le surnageant recueilli avec 15 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes basique (BFGF). Vous obtiendrez environ 16 millilitres de milieu conditionné au méth, à conserver chaque jour séparément à quatre degrés SIUs. Le milieu conditionné au méth peut être conservé de une à deux semaines à quatre degrés Celsius ou plusieurs mois à moins 20 degrés Celsius.

Maintenant que vous vous êtes assuré que votre milieu conditionné au méthanol sera prêt au moment voulu, parlons de la préparation des cellules. La première étape dans la génération de cellules iPS consiste à utiliser des lentivirus pour transduire des cellules de fibroblastes de peau humaine, ou cellules BJ, avec quatre facteurs de transcription caractéristiques des cellules souches. Pour préparer la transduction, ensemencez les cellules BJ à une densité de un fois dix puissance cinq cellules par puits d'une plaque de six puits et mettez-les en culture.

Les cellules dans deux millilitres de milieu de croissance, incubées pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le même jour. Commencer à préparer les plaques d'alimentation en méthylcellulose en ajoutant deux millilitres de gélatine à 0,1 % diluée dans de l'eau dans une plaque de six puits et en incubant pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. La gélatine recouvre les puits et sert de matrice pour les cellules.

Les cellules BJ sont désormais prêtes pour la transduction lentivirale afin de préparer le virus pour la transduction. Complétez deux millilitres de milieu frais avec six microgrammes par millilitre de polybrain et quatre lentivirus, chacun exprimant l'un des facteurs de transcription humains T quatre, SO deux nanog et lin 28, de sorte que chacun soit à la même multiplicité d'infection ou MOI.

Ces lentivirus sont tous inclus dans le jeu de lentivirus des facteurs de reprogrammation humains. Pour effectuer la transduction, remplacez simplement le milieu de croissance des cellules BJ par le milieu contenant le virus. Agitez doucement la plaque afin que le milieu recouvre uniformément le fond.

Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le même jour. Retirer un flacon de cellules nourricières cf une méth du nitrogène liquide et décongeler. Retirer la solution de gélatine des plaques de cellules nourricières méth, qui sont maintenant revêtues de gélatine chacune.

Ajouter 0,2 fois 10 à la puissance 5 cellules dans deux millilitres de milieu de croissance MEM. Incuber les cellules MES pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, détacher les cellules BJ avec de la trypsine-EDTA à 0,05 % et centrifuger à 200 g pendant cinq minutes.

Après la centrifugation, aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans le milieu de croissance. Retirez le milieu de la plaque de culture des cellules meth et ajoutez deux millilitres par puits de la suspension de cellules BJ. La concentration des cellules BJ doit être d'environ cinq fois 10 à la puissance quatre cellules par puits.

Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. 24 heures après avoir semé les cellules BJ sur la plaque support contenant du méthotrexate, remplacer le milieu par le milieu E-S-I-P-S humain, destiné à la culture des cellules souches embryonnaires ou des cellules souches pluripotentes induites. Continuer à renouveler le milieu toutes les 24 heures pendant sept jours.

Le septième jour, remplacez le milieu de culture des cellules ES par deux millilitres de milieu conditionné au méthanol. Les cellules nourricières au méthanol ont fourni jusqu'à présent les facteurs solubles nécessaires à la culture des cellules IPS. Mais désormais, nous devons ajouter davantage de ces facteurs afin de maintenir la culture en bon état de santé.

Le milieu conditionné par les cellules nourricières au méth contient tous les facteurs solubles sécrétés par ces cellules après une incubation nocturne à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. En observant au microscope, sélectionnez une colonie cellulaire. Elle se distingue par une apparence compacte en petite coupole dans une plaque 24 puits fraîche que vous avez préparée 24 heures auparavant avec des cellules nourricières ccf un au méth. Recueillez la colonie sélectionnée dans une culture humaine E-S-I-P-S.

Milieu supplémenté avec 10 micromolaire de la molécule souche Y 2 7 6 3 2, un inhibiteur de kinase dépendante. Changer le milieu de culture sans supplémenter avec la molécule souche Y 2 7 6 3 2 toutes les 24 heures pendant les sept premiers jours.

Après sept jours, changer le milieu pour le milieu de conditionnement. Continuer à repiquer les cellules dans ce milieu jusqu'à ce qu'elles présentent une morphologie typique des cellules souches embryonnaires humaines. Rechercher des colonies petites, compactes et en forme de dôme, aux bords bien définis.

Les colonies doivent être uniformes et présenter un rapport élevé entre le noyau et le cytoplasme. À ce stade, vous avez développé des colonies ayant la morphologie de cellules souches embryonnaires (ES), mais expriment-elles également des gènes caractéristiques des cellules ES ? Pour le déterminer, réalisez une coloration des colonies pour des marqueurs de pluripotence tels que TRA 180, TRA 160, SSEA-4, SSEA-3, T4 Sox2, Nanog et SSEA-1. Commencez par laver doucement les cellules trois fois avec du PBS.

Ensuite, fixez les cellules avec 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % ou tout autre fixateur pendant 20 minutes à température ambiante. Après 20 minutes, lavez les cellules avec du PBS 3 fois pour éliminer l'excès de fixateur. Ensuite, bloquez la liaison non spécifique en incubant les cellules dans 500 microlitres de tampon de blocage par puits pendant une heure à température ambiante. Après l'étape de blocage, ajoutez 250 microlitres d'anticorps primaire dilué au 1/100 dans le tampon de blocage à chaque puits.

Incuber correctement les cellules avec l'anticorps primaire toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Rincer les cellules trois fois avec du PBS pour éliminer l'anticorps primaire non lié. Incuber les cellules avec 250 microlitres d'anticorps secondaire dilué au 1/300 dans du tampon de blocage pendant une heure à température ambiante, en protégeant de la lumière pour éviter le photoblanchiment après l'incubation avec l'anticorps secondaire.

Lavez les cellules trois fois avec du PBS jusqu'au troisième lavage. Ajoutez du DPI à une concentration d'un microgramme par millilitre pour colorer les noyaux. Enfin, analysez l'expression génique de vos cellules IPS.

Sous le microscope, les résultats de morphologie montrent quatre cellules de fibroblaste humain transduites conjointement avec T four, SOX two, nanog et lin 28 ; des changements morphologiques ont été observés dès le quatrième jour suivant la transduction, et les cellules formaient des agrégats plus compacts au jour 17. L'expression de marqueurs de pluripotence a été détectée. Afin de caractériser davantage les colonies de cellules IPS isolées, nous avons recherché la présence de marqueurs de pluripotence couramment exprimés dans les cellules ES. Les colonies présentaient une activité élevée de phosphatase alcaline.

En outre, une immunochimie ou une immunocytochimie (ICC) a été réalisée sur les colonies de cellules IPS à l'aide d'un panel d'anticorps spécifiques des marqueurs de pluripotence, incluant les marqueurs membranaires TA 180, TRA 1-60, SSEA-4 et SSEA-3, ainsi que les marqueurs nucléaires T four, SOX two et Nanog. Les colonies IPS isolées étaient positives pour tous ces marqueurs. Les résultats d'ICC montrent que les cellules IPS présentaient un profil d'expression approprié des marqueurs de pluripotence, démontrant ainsi qu'elles ressemblent étroitement aux cellules souches embryonnaires humaines non différenciées.

Nous venons de vous montrer comment générer des cellules IPS en reprogrammant des fibroblastes humains à l'aide du jeu de lentivirus des gènes de cellules souches. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre en compte plusieurs facteurs.

Tout d'abord, le rapport entre le virus actif et la cible pourrait nécessiter d'être modifié lors de l'étape primaire de transduction afin d'obtenir une efficacité optimale de transduction. Deuxièmement, les conditions de croissance des cellules cibles peuvent avoir un impact. Les cellules saines et prolifératives sont plus sensibles à la reprogrammation.

Troisièmement, lors de l'adaptation du protocole à différents nombres de cellules, il est recommandé d'ajuster proportionnellement le nombre cible de cellules à la surface de la boîte de culture. Enfin, l'ajout d'inhibiteurs de ROCK, tels que Y 2 7 6 3 2, devrait être envisagé afin d'assurer un reprogrammation réussie, car des études récentes ont démontré leur utilité pour améliorer la survie des colonies humaines de type yes. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.