Name: Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Apprenez les techniques de congélation et décongélation des cellules souches embryonnaires humaines pour préserver leur viabilité. Ce protocole détaillé guide les chercheurs en culture cellulaire.

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1. La décongélation des cellules hES Pré-montage expérimental <ol><li> Un jour avant la décongélation des cellules hES, plaque une couche nourricière de fibroblastes de souris irradiées embryonnaires (MEF), CF1 souche, sur un puits d&#39;une gélatine à revêtement de 6 puits plaque de culture de tissus dans un milieu de culture MEF (D-MEM complété avec un milieu de base 10% de FBS inactivé à la chaleur et 1% de non-acides aminés essentiels). Incuber une nuit à 37 ° C et CO 2 5%. </li><li> Avant de retirer les cellules hES de l&#39;azote liquide, être sûr d&#39;avoir tout l&#39;équipement nécessaire et les réactifs en place et prêt à utiliser pour assurer un dégel efficace et réussie. </li></ol> La décongélation des cellules hES <ol start="3"><li> Retirer un flacon cryogénique de cellules hES du réservoir de stockage d&#39;azote liquide à l&#39;aide des pinces de métal. </li><li> Faites rouler le flacon entre les mains gantées pour les 3-5 secondes pour enlever le givre. </li><li> Enregistrer les informations sur l&#39;étiquette du flacon. </li><li> En utilisant des pinces métalliques, immerger le flacon dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Agiter le flacon doucement et observer les progrès du dégel souvent (mais rapidement!) En tenant le flacon à la lumière pour voir la taille du cristal de glace. Ne pas plonger le bouchon de la fiole dans le bain d&#39;eau car cela pourrait contaminer les cellules. </li><li> Lorsque seul un cristal de glace petite demeure, immerger le flacon entier dans de l&#39;éthanol à stériliser. </li><li> Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, transférer le contenu de la fiole cryogénique directement au fond d&#39;un tube de 15 ml conique. </li><li> Lentement ajouter 4 ml de milieu de culture cellulaire hES (D-MEM/F-12 milieu basal complété par le remplacement Knockout 20% de sérum, 1% de non-acides aminés essentiels, soit 1% de L-glutamine, 0,2% β-mercaptoéthanol et 4 ng / ml de bFGF) au tube. Secouez délicatement au mélange en permanence les cellules comme le nouveau média est ajouté dans le tube. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 200 x g. </li></ol> Placage des cellules hES <ol start="11"><li> Alors que les cellules hES sont dans la centrifugeuse, préparez la plaque d&#39;alimentation du MEF par un marquage avec les informations hES cellule appropriée: lignée cellulaire, le numéro de passage, et la date de dégel. </li><li> Quand il ya environ 2 minutes sur le temps de spin, aspirer le milieu de culture MEF et ajoutez 1,0 ml de PBS dans le puits. </li><li> Apportez les cellules hES granulés de retour à l&#39;enceinte de sécurité biologique, et soigneusement aspirer le surnageant. Attention à ne pas aspirer le culot cellulaire, mais enlever autant que possible le surnageant, comme cette solution contient du DMSO dans le milieu de congélation. </li><li> Re-suspendre le culot très doucement en ajoutant 2,5 mL de milieu de culture cellulaire hES en utilisant une pipette 5 ml en verre et de pipetage 3-4 fois. </li><li> Aspirer le PBS à partir du chargeur MEF bien et ajouter lentement 2,5 ml toutes les de la suspension de cellules hES au bien préparée de la plaque de 6 puits. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;incubateur à 37 ° C et glissez soigneusement la plaque d&#39;avant en arrière, et latéralement afin de répartir uniformément les cellules à travers le puits. Ne pas remuer le plateau dans un modèle circulaire pour éviter la concentration des colonies dans le centre. </li><li> Laisser les cellules d&#39;attacher à 37 ° C et CO 2 5% durant la nuit. </li><li> Le jour après le dégel, retirez le support (avec toutes les cellules flottantes) et ajoutez 2,5 ml de milieu de culture frais hES cellule pour le bien. </li><li> En option: Le milieu retiré et les cellules peuvent être transférés à une plaque séparée MEF préparés mangeoire. Cette étape génère souvent de nouvelles colonies qui peuvent être cultivées en parallèle avec les cellules du dégel d&#39;origine. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C et CO 2 5% durant la nuit. </li></ol> 2. Congélation des cellules hES <ol><li> Alors que les cellules hES sont dans la centrifugeuse, l&#39;étiquette des flacons cryogéniques à l&#39;intérieur de l&#39;enceinte de sécurité biologique, notamment la lignée cellulaire, le numéro de passage, et la date de congélation. La densité typique de cellules hES congélation est un puits de cellules (à partir d&#39;une plaque à 6 puits) par flacon cryogénique. </li><li> Lorsque les cellules hES sont finis centrifugation, mettre les tubes de retour à l&#39;enceinte de sécurité biologique. Aspirer le surnageant du tube, en faisant attention de ne pas perturber le lâche-emballés culot cellulaire. </li><li> Reprendre le culot cellulaire avec la quantité appropriée de milieu de culture cellulaire hES: 0,5 mL hES milieu de culture cellulaire par flacon cryogénique. Soyez très doux lors du pipetage, comme les cellules hES mieux récupérer quand elle est congelée en morceaux colonie relativement importante. </li><li> Lentement, tout en secouant doucement le tube, ajoutez la quantité appropriée (0,5 ml par cryovial) de 2X milieu de congélation de cellules hES (60% de FBS définis, 20% moyennes de culture de cellules hES, et 20% de DMSO) pour les cellules. Une fois que le milieu de congélation est ajouté, pipette la solution extrême douceur une à deux fois pour mélanger. </li><li> Rapidement mais doucement, ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque flacon cryogénique. </li><li> Transfert des flacons dans un contenant de congélation et les placer dans l&#39;isopropanolune congélateur à -80 ° C la nuit. Les cellules gèle à 1 ° C par minute dans le récipient de congélation isopropanol. </li><li> Le lendemain, transférer rapidement les flacons congelés dans un réservoir de stockage d&#39;azote liquide à l&#39;aide des pinces de métal. </li></ol> Les résultats représentatifs Le premier jour après que les cellules ES humaines sont décongelés, de petites colonies peuvent apparaître transparentes et peuvent être difficiles à voir sous le microscope. Comme les cellules ES nouvellement décongelés ont tendance à proliférer lentement, ils peuvent prendre quelques jours à apparaître comme des colonies établies (figure 1). Figure 1. La récupération et la croissance cellulaire. Cellules hES dégelée de l&#39;azote liquide ont été imagées Jours 1, 7 et 11 après la décongélation.

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique</a>. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
</ol>

La vidéo qui l&#39;accompagne montre une méthode pour la décongélation et la congélation des cellules hES. Cellules congelées dans l&#39;azote liquide doivent être décongelés de bain aussi rapidement que possible afin d&#39;obtenir la meilleure récupération possible. N&#39;oubliez pas d&#39;être extrêmement prudent lors du pipetage cellules dégel: minimiser la manipulation des cellules et la pipette doucement. Un flacon de cellules hES peuvent être étalés sur une ou l&#39;autre puits d&#39;une plaque de 6 puits, ou tous les puits d&#39;une plaque 4-même et immédiatement placés dans l&#39;incubateur. Depuis la culture dans quatre puits séparé réduit la possibilité de perdre toute la culture de la contamination, et il est plus facile de localiser les colonies de cellules hES sur la plus petite surface, la plaque 4-même est recommandé lors de la décongélation des cellules hES pour la première fois. Le premier jour après la décongélation des cellules hES, les colonies sont petites et peuvent être transparents. Reconstituer le support de culture de cellules hES chaque jour, même si les colonies ne sont pas apparents sous le microscope, car il peut prendre quelques jours de culture de cellules hES d&#39;apparaître comme des colonies établies. Il est important d&#39;utiliser une couche fraîchement plaquée MEF alimentation lors de la décongélation des cellules, comme les colonies ne sont souvent pas atteindre une taille appropriée pour repiquage jusqu&#39;au 10 12 jours après le dégel. Lorsque la décongélation d&#39;un flacon passage bas de cellules hES, il est bon d&#39;élargir et de gel des flacons supplémentaires pour maintenir un stock de cellules passage bas pour la culture à venir et des expériences. C&#39;est aussi une bonne idée de geler toute routine &quot;extra&quot; saine cellules hES de maintenir des stocks congelés. Le dégèle plus réussies et les cultures subséquentes ont été gelés en haute qualité, indifférenciée, se divisant activement les colonies de cellules hES. cellules hES récupérer un gel plus efficace s&#39;il est manipulé doucement comme des agrégats de cellules plus grandes. La taille globale finale devrait être similaire à (ou légèrement plus grand que) la taille des agrégats plaqués après un passage de routine.

<table><tbody><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Pour le milieu MEFjavascript:void(0);</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS), certifié</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>Inactivé par la chaleur&lt;br/&gt;Pour le milieu MEF</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Substitut de sérum Knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Pré-cribler pour assurer le soutien des cellules hES</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>Utiliser à [4 ng/mL] final</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100X)&lt;br/&gt;Utiliser à [1X] final</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Sans Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; ou Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Préparer une solution fraîche à 1 mg/mL dans D-MEM/F-12</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Type A, porcine</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2560</td><td>Pour le milieu de congélation</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS), défini</td><td>Hyclone</td><td>SH300.70.01</td><td>Pour le milieu de congélation</td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140675</td><td>Pour la culture générale</td></tr><tr><td>Plaques 4 puits</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td>Pour le décongélation</td></tr><tr><td>Pipettes en verre de 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27E</td><td>Emballées individuellement</td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>En polypropylène</td></tr><tr><td>Flacons cryogéniques</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5000-1020</td><td>Capacité de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Contenant de congélation</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5100-0001</td><td>Mr. Frosty&amp;#8221;</td></tr></tbody></table>

congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Depuis James Thomson<em&gt; Et al</em&gt; A développé une technique en 1998 à isoler et à cultiver hES dans la culture, les cellules de congélation pour une utilisation ultérieure et le dégel et l&#39;expansion des cellules à partir d&#39;un stock congelé sont devenus d&#39;importantes procédures effectuées en culture de cellules hES de routine. Comme les cellules hES sont très sensibles aux contraintes de gel et de dégel, des précautions particulières doivent prendre. Ici nous démontrer la bonne technique pour rapidement dégel cellules hES partir des stocks d&#39;azote liquide, les cellules de souris sur le plaquage d&#39;alimentation embryonnaire, et lentement les congeler pour stockage à long terme.

Ce protocole démontre comment maintenir en bonne santé, indifférencié souches embryonnaires humaines (ES) cellules.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Depuis que James Thomson et al. ont mis au point une technique en 1998 pour isoler et cultiver des hES en culture, la congélation de cellules pour une utilisation ultérieure ainsi que la décongélation et l'expansion cellulaires...

Bonjour, je suis Leah Kent de STEM Gen. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment décongeler et congeler des cellules souches embryonnaires humaines. Commençons donc.Pour décongeler les cellules souches embryonnaires humaines, un flacon cryogénique est prélevé dans l'azote liquide et rapidement décongelé. Dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, la suspension cellulaire est transférée du flacon cryogénique vers un tube conique, diluée avec du milieu de culture pour cellules ES humaines, puis centrifugée. Afin d'obtenir un petit culot cellulaire, le surnageant est ensuite éliminé et le culot cellulaire est resuspendu dans du milieu de culture frais pour cellules ES humaines dans le tube, avant d'être mis en culture dans un puits d'une plaque de culture de cellules à six puits préalablement ensemencée avec une couche de cellules nourricières de fibroblastes embryonnaires de souris irradiées.Un jour avant de décongeler les cellules souches embryonnaires humaines, ensemencer une couche de cellules nourricières constituée de fibroblastes embryonnaires de souris irradiés, ou de cellules mes, dans du milieu de culture meth. Ajouter le milieu dans une cavité d'une plaque de culture tissulaire de six puits revêtue de gélatine. Incuber la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Pour garantir un décongélation efficace et réussie, assurez-vous d'avoir tous les équipements et réactifs nécessaires prêts. Avant de retirer l'ESL humain de l'azote liquide. À l'aide de pinces métalliques, retirez un flacon cryogénique contenant des ESL humaines du réservoir de stockage d'azote liquide.Faites rouler le flacon entre les mains gantées pendant trois à cinq secondes. Pour retirer le givre, enregistrez les informations sur l'étiquette du flacon à l’aide de pinces en métal. Plongez le flacon dans un bain à 37 degrés Celsius.Faire tourner doucement le flacon et observer souvent, mais rapidement, l'avancement du dégel en plaçant le flacon devant la lumière, afin de voir la taille du cristal de glace. Ne pas plonger le bouchon du flacon dans le bain d'eau afin d'éviter toute contamination des cellules.Lorsqu'il ne reste qu'un petit cristal de glace, plongez le flacon dans de l'éthanol pour le stériliser dans une hotte de sécurité biologique stérile, puis transférez le contenu du flacon cryogénique directement au fond d'un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez lentement quatre millilitres de milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines dans le tube.Agitez doucement le tube pour mélanger continuellement les cellules lors de l'ajout du nouveau milieu dans le tube. Centrifugez les cellules E es humaines pendant cinq minutes à 200 G pendant que les cellules sont dans la centrifugeuse. Récupérez la plaque de nourriciers en méthylcellulose préparée auparavant à partir de l'incubateur à 37 degrés Celsius et étiquetez-la avec les informations appropriées sur les cellules ESL humaines, telles que la lignée cellulaire, le numéro de passage et la date de décongélation.Aspirez le milieu de culture des MEF et ajoutez un millilitre de PBS dans le puits. Ramenez le culot d'ESL humaines dans la hotte de sécurité biologique et aspirez soigneusement le surnageant. Veillez à ne pas aspirer le culot cellulaire, mais retirez autant de surnageant que possible, car cette solution contient du DMSO provenant du milieu de congélation.Resus.Resuspendre délicatement le culot en ajoutant 2,5 millilitres de milieu de culture ESL humain. À l’aide d’une pipette en verre de cinq millilitres et en pipetant trois à quatre fois, aspirer le PBS du milieu de culture contenant les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Ajouter lentement et complètement les 2,5 millilitres de la suspension de cellules souches embryonnaires humaines dans le puits préparé de la plaque à six puits.Placer la plaque dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et faire glisser délicatement la plaque d'avant en arrière et de côté à côté afin de répartir uniformément les cellules dans tout le puits. Pour éviter de concentrer les colonies au centre. Ne pas agiter la plaque selon un mouvement circulaire.Laisser les cellules s’attacher à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit, le jour suivant le dégel. Retirer le milieu contenant les cellules en suspension et ajouter 2,5 millilitres de nouveau milieu de culture pour cellules souches humaines dans le puits.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit et poursuivre la culture jusqu'à ce que les colonies soient prêtes à être repiquées. Le protocole de congélation des cellules souches embryonnaires humaines commence avec des colonies de cellules souches embryonnaires humaines de taille moyenne et en bon état, cultivées dans une plaque de six puits. Après incubation de la culture avec l'enzyme collagénase IV, les colonies sont raclées à l'aide d'une pipette en verre de cinq millilitres, recueillies dans un tube conique et centrifugées pour former un culot cellulaire lâche.Après avoir aspiré le surnageant, le culot cellulaire est resuspendu, d'abord dans du milieu de culture pour cellules souches embryonnaires humaines, puis dilué avec deux volumes de milieu de cryoconservation. Les cellules sont réparties uniformément en aliquots d'un millilitre et congelées dans des fioles cryogéniques.Pendant que les cellules sont dans la centrifugeuse, étiquetez les fioles cryogéniques à l'intérieur de la hotte de sécurité avec le numéro de passage de la lignée cellulaire et la date de congélation. La densité typique pour la congélation des cellules souches embryonnaires humaines correspond à une puits de cellules provenant d'une plaque de six puits par fiole cryogénique. Une fois que les cellules souches embryonnaires humaines ont été centrifugées, ramenez le tube dans la hotte de sécurité.Aspirez le surnageant du tube. Prenez soin de ne pas perturber le culot cellulaire lâchement compacté Resus. Suspendez le culot cellulaire avec la quantité appropriée de milieu de culture humain ESL.Prélèver 0,5 millilitre de milieu de culture d'ESL humain. Milieu par fiole cryogénique. Soyez très délicat lors de la pipetage, car les cellules souches embryonnaires humaines se reconforment mieux lorsqu'elles sont congelées en fragments de colonies relativement grands. Ajoutez lentement, tout en agitant doucement le tube, la quantité appropriée de milieu de congélation pour cellules souches embryonnaires humaines 2 x au mélange cellulaire.Une fois le milieu de congélation ajouté, mélangez délicatement la solution en pipetant une à deux fois rapidement, mais doucement, puis ajoutez un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque fiole cryogénique. Transférez les fioles dans un contenant de congélation contenant de l'isopropanol et placez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Les cellules gèleront à raison d'un degré Celsius par minute dans le contenant de congélation à l'isopropanol le jour suivant.Transférez rapidement les cryotubes congelés dans un réservoir d'azote liquide à l'aide de pinces métalliques. Le premier jour suivant la culture, les petites colonies de cellules souches embryonnaires humaines peuvent sembler transparentes et être difficiles à observer au microscope. Étant donné qu'elles viennent d'être mises en culture, les cellules souches embryonnaires humaines ont tendance à proliférer relativement lentement.Elles peuvent mettre quelques jours en culture avant d'apparaître sous forme de colonies établies. Nous venons de vous montrer comment décongeler et congeler des cultures de cellules souches embryonnaires humaines. Voilà, c'est terminé.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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