Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Bonjour, je suis Leah Kent de STEM Gen. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment décongeler et congeler des cellules souches embryonnaires humaines. Commençons donc.

Pour décongeler les cellules souches embryonnaires humaines, un flacon cryogénique est prélevé dans l'azote liquide et rapidement décongelé. Dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, la suspension cellulaire est transférée du flacon cryogénique vers un tube conique, diluée avec du milieu de culture pour cellules ES humaines, puis centrifugée. Afin d'obtenir un petit culot cellulaire, le surnageant est ensuite éliminé et le culot cellulaire est resuspendu dans du milieu de culture frais pour cellules ES humaines dans le tube, avant d'être mis en culture dans un puits d'une plaque de culture de cellules à six puits préalablement ensemencée avec une couche de cellules nourricières de fibroblastes embryonnaires de souris irradiées.

Un jour avant de décongeler les cellules souches embryonnaires humaines, ensemencer une couche de cellules nourricières constituée de fibroblastes embryonnaires de souris irradiés, ou de cellules mes, dans du milieu de culture meth. Ajouter le milieu dans une cavité d'une plaque de culture tissulaire de six puits revêtue de gélatine. Incuber la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Pour garantir un décongélation efficace et réussie, assurez-vous d'avoir tous les équipements et réactifs nécessaires prêts. Avant de retirer l'ESL humain de l'azote liquide. À l'aide de pinces métalliques, retirez un flacon cryogénique contenant des ESL humaines du réservoir de stockage d'azote liquide.

Faites rouler le flacon entre les mains gantées pendant trois à cinq secondes. Pour retirer le givre, enregistrez les informations sur l'étiquette du flacon à l’aide de pinces en métal. Plongez le flacon dans un bain à 37 degrés Celsius.

Faire tourner doucement le flacon et observer souvent, mais rapidement, l'avancement du dégel en plaçant le flacon devant la lumière, afin de voir la taille du cristal de glace. Ne pas plonger le bouchon du flacon dans le bain d'eau afin d'éviter toute contamination des cellules.

Lorsqu'il ne reste qu'un petit cristal de glace, plongez le flacon dans de l'éthanol pour le stériliser dans une hotte de sécurité biologique stérile, puis transférez le contenu du flacon cryogénique directement au fond d'un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez lentement quatre millilitres de milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines dans le tube.

Agitez doucement le tube pour mélanger continuellement les cellules lors de l'ajout du nouveau milieu dans le tube. Centrifugez les cellules E es humaines pendant cinq minutes à 200 G pendant que les cellules sont dans la centrifugeuse. Récupérez la plaque de nourriciers en méthylcellulose préparée auparavant à partir de l'incubateur à 37 degrés Celsius et étiquetez-la avec les informations appropriées sur les cellules ESL humaines, telles que la lignée cellulaire, le numéro de passage et la date de décongélation.

Aspirez le milieu de culture des MEF et ajoutez un millilitre de PBS dans le puits. Ramenez le culot d'ESL humaines dans la hotte de sécurité biologique et aspirez soigneusement le surnageant. Veillez à ne pas aspirer le culot cellulaire, mais retirez autant de surnageant que possible, car cette solution contient du DMSO provenant du milieu de congélation.Resus.

Resuspendre délicatement le culot en ajoutant 2,5 millilitres de milieu de culture ESL humain. À l’aide d’une pipette en verre de cinq millilitres et en pipetant trois à quatre fois, aspirer le PBS du milieu de culture contenant les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Ajouter lentement et complètement les 2,5 millilitres de la suspension de cellules souches embryonnaires humaines dans le puits préparé de la plaque à six puits.

Placer la plaque dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et faire glisser délicatement la plaque d'avant en arrière et de côté à côté afin de répartir uniformément les cellules dans tout le puits. Pour éviter de concentrer les colonies au centre. Ne pas agiter la plaque selon un mouvement circulaire.

Laisser les cellules s’attacher à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit, le jour suivant le dégel. Retirer le milieu contenant les cellules en suspension et ajouter 2,5 millilitres de nouveau milieu de culture pour cellules souches humaines dans le puits.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit et poursuivre la culture jusqu'à ce que les colonies soient prêtes à être repiquées. Le protocole de congélation des cellules souches embryonnaires humaines commence avec des colonies de cellules souches embryonnaires humaines de taille moyenne et en bon état, cultivées dans une plaque de six puits. Après incubation de la culture avec l'enzyme collagénase IV, les colonies sont raclées à l'aide d'une pipette en verre de cinq millilitres, recueillies dans un tube conique et centrifugées pour former un culot cellulaire lâche.

Après avoir aspiré le surnageant, le culot cellulaire est resuspendu, d'abord dans du milieu de culture pour cellules souches embryonnaires humaines, puis dilué avec deux volumes de milieu de cryoconservation. Les cellules sont réparties uniformément en aliquots d'un millilitre et congelées dans des fioles cryogéniques.

Pendant que les cellules sont dans la centrifugeuse, étiquetez les fioles cryogéniques à l'intérieur de la hotte de sécurité avec le numéro de passage de la lignée cellulaire et la date de congélation. La densité typique pour la congélation des cellules souches embryonnaires humaines correspond à une puits de cellules provenant d'une plaque de six puits par fiole cryogénique. Une fois que les cellules souches embryonnaires humaines ont été centrifugées, ramenez le tube dans la hotte de sécurité.

Aspirez le surnageant du tube. Prenez soin de ne pas perturber le culot cellulaire lâchement compacté Resus. Suspendez le culot cellulaire avec la quantité appropriée de milieu de culture humain ESL.

Prélèver 0,5 millilitre de milieu de culture d'ESL humain. Milieu par fiole cryogénique. Soyez très délicat lors de la pipetage, car les cellules souches embryonnaires humaines se reconforment mieux lorsqu'elles sont congelées en fragments de colonies relativement grands. Ajoutez lentement, tout en agitant doucement le tube, la quantité appropriée de milieu de congélation pour cellules souches embryonnaires humaines 2 x au mélange cellulaire.

Une fois le milieu de congélation ajouté, mélangez délicatement la solution en pipetant une à deux fois rapidement, mais doucement, puis ajoutez un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque fiole cryogénique. Transférez les fioles dans un contenant de congélation contenant de l'isopropanol et placez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Les cellules gèleront à raison d'un degré Celsius par minute dans le contenant de congélation à l'isopropanol le jour suivant.

Transférez rapidement les cryotubes congelés dans un réservoir d'azote liquide à l'aide de pinces métalliques. Le premier jour suivant la culture, les petites colonies de cellules souches embryonnaires humaines peuvent sembler transparentes et être difficiles à observer au microscope. Étant donné qu'elles viennent d'être mises en culture, les cellules souches embryonnaires humaines ont tendance à proliférer relativement lentement.

Elles peuvent mettre quelques jours en culture avant d'apparaître sous forme de colonies établies. Nous venons de vous montrer comment décongeler et congeler des cultures de cellules souches embryonnaires humaines. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.