Name: Méthodes pour létude de lBarbel Zebrafish maxillaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez les méthodes d'étude du barbillon maxillaire chez le zebrafish pour la biologie régénérative. Cette vidéo présente le protocole chirurgical d'amputation et l'analyse histologique des spécimens régénérés.

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Ces méthodes ont été développées par EEL pendant un congé de recherche dans le laboratoire du JT appui a été fourni par le Conseil de recherche et de l&#39;Université DePaul une NIH / NIDCR R01 accorder à JT (DE016678). Nous tenons à souligner les efforts de Hunter Caroline, technicien de soins aux animaux dans l&#39;établissement CMRC coeur de poisson zèbre et Paulina Pawluczuk, notre assistant de laboratoire de premier cycle.

Le poisson zèbre élevage Le poisson zèbre sont logés et élevés selon des méthodes standard 1. Passé la période de fin larvaire, le stade de développement d&#39;un poisson zèbre peut être mesurée par sa longueur standard (SL), ou la distance en ligne droite en millimètres du point plus antérieurs de la lèvre supérieure à la base de la nageoire caudale (la plaque posteriormost hypural) 2. A environ un mois après la fécondation (10-12 mm LS), les barbillons nasaux et maxillaires apparaissent comme transparents bourgeons épithéliaux près du puits olfactives et sur les coins postérieurs des maxillaires, respectivement. Comme le poisson zèbre mûrit, les barbillons s&#39;étendent dans étroite, moustache appendices semblables. Parce que le barbillon maxillaire est plus large (2-3 mm) et plus facile à manipuler, notre protocole ne s&#39;applique qu&#39;aux cet appendice particulier; des techniques similaires, cependant, pourrait être adapté aux plus petits le barbeau nasale. Clipping Barbel <ol><li> Anesthésier poisson zèbre adulte au stade désiré (p. ex., De 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 mois après la fécondation) par immersion dans de 0,015% MS-222 (éthyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate) tamponné à pH 7,0 dans de l&#39;eau du système. Observez les mouvements de natation jusqu&#39;à arrêter et ventilation des branchies devient lente et régulière. Selon la taille du poisson, une anesthésie complète prend environ 2-5 minutes. </li><li> Utiliser une résille d&#39;aquarium, le transfert de poissons 1-3 à la fois à un morceau plié de serviette en papier humide dans une boîte de Pétri. En utilisant une spatule, d&#39;orienter le poisson donc ils sont parallèles les uns aux autre côté et latéral gauche en place. Pliez une partie de la serviette en papier humide sur la partie caudale du poisson, couvrant tout le corps jusqu&#39;à l&#39;opercule (opercules) pour garder la peau et les branchies humides pendant la procédure. </li><li> Voir la plaque de Petri sous la loupe binoculaire, en utilisant la lumière incidente à angle faible pour éclairer la région de la tête. Focus sur la base de la gauche barbeau maxillaire, qui fait saillie de l&#39;angle ventral postérieur du maxillaire (Fig. 1). <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. </li><li> Étroitement saisir l&#39;arbre de l&#39;légèrement distale au bord du maxillaire barbeau. Élevez l&#39;arbre barbeau et insérez les mâchoires d&#39;une paire de ciseaux à ressort à pointe fine juste en amont de la pince. Les ciseaux peuvent être touchés à la pince pour la stabilité. Glissez les mâchoires de la paire de ciseaux le long de la tige du barbeau jusqu&#39;à la pointe se rapproche du bord du maxillaire. Fermer les ciseaux pour couper à travers l&#39;arbre barbeau. Le barbeau amputée, toujours serrée dans la pince, peut être enlevé pour la fixation ou observation. </li><li> Immédiatement transférer le poisson à un petit réservoir d&#39;eau potable du système (~ 500 ml) contenant une goutte de bleu de méthylène pour le contrôle superficiels infection fongique. Laisser le poisson à récupérer pendant la nuit. Le lendemain matin, retour le poisson pour le système d&#39;élevage. Barbel régénération est maximale après 2 semaines. </li></ol> Incorporation de gélose de paires appariées Barbel <ol><li> Recueillir les poissons par la technique d&#39;euthanasie appropriées et fixer dans un tube de 50 ml de 4% de paraformaldéhyde-tampon phosphate salin (PBS) avec agitation à 4 ° C pendant la nuit. Le volume fixateur doit être d&#39;au moins dix fois le volume du tissu. Après fixation, d&#39;éliminer les déchets paraformaldéhyde dans un contenant approuvé et rincer le tissu à fond dans plusieurs changements de PBS. </li><li> Préparer dans un flacon en verre de 250 ml 150 ml d&#39;agarose à 2% (T m ~ 37 ° C) dans de l&#39;eau distillée. Chauffer avec un micro-ondes ou plaque chauffante, en agitant périodiquement jusqu&#39;à dissolution complète. Equilibrer la solution fondue dans un bain de 50-60 ° C eau. </li><li> Assemblez un gréement gel standard d&#39;électrophorèse en plaçant un moule gel de petits joints (10 x 10 cm; ~ volume de 100 ml de gel) fermement contre les parois de la chambre tampon. Ajouter 2-4 petit échantillon en dents de peigne (4 x 1,5 mm). </li><li> Sur une surface plane, verser la fondue d&#39;agarose dans le moule pour juste couvrir la base des peignes, formant des puits très peu profond. Immédiatement mis l&#39;agarose restes de nouveau dans le bain d&#39;eau chaude, ce qui sera utilisé plus tard pour intégrer le tissu (étapes 9-12). Mettez une longue pipette Pasteur en verre dans le ballon pour maintenir la pipette à la même température que l&#39;agarose. </li><li> Laisser le gel de durcir pendant 20-30 minutes. Retirer les peignes, puis retirez le moule du gel contenant le gel durci de la chambre tampon. Fermement bandes sur les côtés ouverts du moule avec du ruban de gel en laboratoire alors le gel ne glisse pas. Cette bande doit s&#39;étendre de quelques millimètres sur la surface de l&#39;agarose afin d&#39;agarose supplémentaires peuvent être ajoutés plus tard (étape 13). </li><li> Position le moule du gel sur la scène d&#39;un stéréomicroscope. Magnify un puits vide et rapprocher les bords au point. </li><li> Sur la surface de l&#39;adjacentes au puits d&#39;agarose, une pipette une goutte d&#39;eau ou de tampon contenant les échantillons fixés barbeau (par exemple, se régénérer et de contrôle). Using plié broches insectes, faites glisser les échantillons humides dans le puits et les pousser vers le bas. Orienter le barbeau arbres parallèles les uns aux autres et alignés contre les bords opposés long du bien. La tension de surface va contribuer à maintenir le tissu en position. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à intégrer, utiliser une pipette fine ou au coin d&#39;un tissu de laboratoire pour enlever l&#39;excès de fluides dans le puits. Travaillez rapidement afin de ne pas laisser les tissus se dessèchent. </li><li> Utilisation de la pipette Pasteur en verre réchauffé doucement pipette propre agarose fondu dans et autour des spécimens pour sceller le tissu barbeaux en place. Ne remplissez pas trop. Avant l&#39;agarose durcit, faire ajustements de dernière minute avec les broches d&#39;insectes. </li><li> Placez une étiquette en papier numéroté spécimen à côté du puits et le fixer avec une petite goutte d&#39;agarose. </li><li> Répétez les étapes 6 à 10 pour chacun des puits d&#39;échantillons. </li><li> Si vous le souhaitez pour le calibrage d&#39;image, insérez un morceau de papier avec une échelle micrométrique imprimés (par exemple, <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> ) dans le fond d&#39;un puits vide. Aplatir le papier au fond du puits et recouvrez chaude d&#39;agarose. </li><li> Après tous les spécimens sont intégrés, la surface du gel sera irrégulière, avec des gouttes durcies d&#39;agarose. Placer le gel sur une surface plane et verser doucement supplémentaires fondue agarose jusqu&#39;à la surface supérieure est uniforme. Utilisez la plus petite quantité d&#39;agarose nécessaire pour obtenir une surface lisse, trop d&#39;agarose sera obscure diascopie photographie. Permettre que cette couche supérieure de durcir. </li><li> Le gel peut désormais être photographiés sur la scène d&#39;un stéréomicroscope pour enregistrer la morphologie brute pour chaque paire de barbeau. Calibration des images est obtenue en photographiant l&#39;échelle micrométrique embarqués. </li><li> Le gel complet peut être stocké enveloppé dans des serviettes en papier humide et scellé dans un sac en plastique à 4 ° pendant plusieurs semaines. </li><li> Pour une analyse plus poussée, des blocs de gélose contenant paire de barbillons peuvent être découpées dans du gel avec une lame de scalpel ou un rasoir et traitées pour l&#39;histologie de paraffine ou cryosectioning par des méthodes standard 3,4. Alternativement, barbeaux individuel peut être disséquée de l&#39;agarose avec de fines aiguilles, rincés à l&#39;eau, et traitées à d&#39;autres applications en aval (par exemple, l&#39;ensemble de montage immunohistochimie ou la microscopie confocale). </li></ol>

<ol><li>Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+length%3A+Not+quite+so+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li>
<li>Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+development+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li>
</ol>

Le poisson zèbre barbillon maxillaire est un système de tissu sous-utilisés pour l&#39;étude de la croissance, l&#39;entretien et la régénération de plusieurs types cellulaires chez le poisson zèbre. Bien que l&#39;appendice n&#39;a pas le barbeau analogue humain, les types de cellules qu&#39;il contient sont hautement conservées, ce qui rend possible d&#39;étudier la peau, les glandes, les mélanocytes vaisseaux circulatoires, et les nerfs dans une structure optiquement clair et anatomiquement cylindrique simple. Semblable à la nageoire caudale bien étudiés, le barbeau tissus peut être induite par l&#39;amputation de se régénérer. Utilisation de la frontière du maxillaire comme un repère anatomique, le plan de l&#39;amputation peut être placé précisément, à faciliter la mesure des barbeaux repousse. Pour un opérateur expérimenté, chaque opération ne prend que quelques secondes. La récupération est rapide, et nous avons jusqu&#39;ici détecté aucun effet à court ou à long terme sur le comportement des poissons. Le poisson zèbre avec un barbeau nager maxillaires, manger et se reproduisent aussi efficacement que non-chirurgical des contrôles, et ont de survie comparable à l&#39;époque de la collecte de tissus, jusqu&#39;à 6 mois après la chirurgie. L&#39;impact physiologique de cette chirurgie prédit d&#39;être minime, car 1) les papilles extra réalisé sur le barbeau se retrouvent également sur ​​de nombreuses autres parties de l&#39;épithélium de poissons, y compris les lèvres, les joues et la tête 5, et 2) les papilles de différenciation apparaissent sur le barbeau régénération dans les 72 heures (Leclair et al., données non publiées). Cela rend le barbillon maxillaire un système minimalement invasives pour étudier la cicatrisation des plaies, la revascularisation et une réinnervation dans le cadre d&#39;un vertébré adulte. Après l&#39;induction chirurgicale de la régénération, barbillons peuvent être prélevés à intervalles de mesure morphométrique et / ou l&#39;analyse microscopique des tissus fixés. Idéalement, le barbillon maxillaire est d&#39;environ la longueur (2-3 mm) et diamètre (100-200 mm) d&#39;un embryon de poisson zèbre, de faciliter l&#39;application de plusieurs protocoles standard, y compris histologie paraffine, cryosectioning, toute monture immunohistochimie, et in situ hybridation. Pris ensemble, ces caractéristiques font du barbillon maxillaire hautement réalisable modèle in vivo pour l&#39;étude de la réparation des tissus et la régénération.

Matériel Microscope Un microscope stéréoscopique à disséquer à transmettre et l&#39;incident éclairage par fibre optique est nécessaire pour écrêtage barbeau et intégrant agar. Clipping Barbel <ul><li> Poissons d&#39;eau du système </li><li> 2 réservoirs de poissons zèbres traversant </li><li> MS-222 (éthyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate; Sigma Chemical # E10521-10G) </li><li> stériles de 120 mm boîte de Pétri </li><li> serviettes en papier humide </li><li> spatule en métal émoussée </li><li> Dumont # 55 Bio Inox forceps (Outils Fine Science # 11255-20) </li><li> Des ciseaux à ressort Mini-Vannas (Outils Fine Science # 15000-00) </li><li> agent bleu de méthylène antifongique (Drs Foster &amp; Smith # CD-905781) </li><li> petits aquariums résille </li></ul> Collection de tissus et d&#39;incorporation d&#39;agar <ul><li> 4% en paraformaldéhyde 1x tampon phosphate salin (PBS-PF), jusqu&#39;à aliquotés dans 50 ml tubes coniques et conservés congelés à -20 ° C </li><li> 1x tampon phosphate salin (pH de 7,27 à 6) </li><li> 250 ml flacon en verre </li><li> Agarose à 2% dans de l&#39;eau distillée </li><li> standard de petites agarose rig électrophorèse sur gel (taille de gel = ~ 10 cm carrés) </li><li> petites dents peigne échantillon d&#39;électrophorèse (taille peigne 4 x 1,5 mm) </li><li> bain d&#39;eau tiède (50-60 ° C) </li><li> bandes de laboratoire </li><li> noir émaillé broches d&#39;insectes, de taille 000 (Fine Science Tools # 26000-25) </li><li> 1-2 détenteurs broches (outils Fine Science # 26016-12) </li><li> 9-inch pipette Pasteur en verre </li><li> poire ou la pompe </li><li> tissulaire en laboratoire </li><li> étiquettes en papier petits </li><li> (Optionnel) échelle d&#39;étalonnage imprimée </li><li> serviettes en papier humide </li><li> sac plastique zip de fermeture </li><li> bistouri / lame de rasoir (pour découper des blocs de gélose) </li></ul>

méthodes pour l&#39;étude de l&#39;barbel zebrafish maxillaire

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbillons sont phanères sensorielle trouve dans les poissons, les reptiles et les amphibiens. Le poisson zèbre, Danio rerio, développe deux paires de barbillons-une paire de courte nasale et une paire plus maxillaires. Barbel tissus contient des cellules d&#39;origine ectodermique, mésodermique et l&#39;origine de la crête neurale, y compris les cellules de peau, les glandes, les papilles, les mélanocytes, les navires circulatoires et des nerfs sensoriels. Contrairement à la plupart des tissus adultes, le barbillon maxillaire est optiquement clair, nous permettant de visualiser le développement et la maintenance de ces types de tissus tout au long du cycle de vie. Cette vidéo montre le développement précoce de l&#39;barbillon maxillaire (en commençant un mois environ après la fécondation), et démontre un protocole chirurgical pour favoriser la régénération de l&#39;appendice pour adultes (&gt; 3 mois après la fécondation). Brièvement, le barbeau maxillaire gauche d&#39;un poisson anesthésié est élevée avec une pince stérile juste distal à la face caudale du maxillaire. Une amende, des ciseaux à ressort stérile est positionné contre la pince pour couper l&#39;arbre le barbeau à ce niveau, l&#39;établissement d&#39;un repère anatomique pour le plan de l&#39;amputation. Une croissance régénérative peut être mesurée par rapport à ce plan, et en comparaison à l&#39;controlatéral barbeau. Tissus Barbel régénère rapidement, atteignant la repousse maximale dans les 2 semaines de blessure. Techniques d&#39;analyse de la régénération barbeau comprennent la dissection et l&#39;inclusion des paires de barbillons (se régénérer et de contrôle) dans les puits d&#39;un gel d&#39;électrophorèse d&#39;ADN standard. Spécimens embarqués sont commodément photographié sous un stéréomicroscope pour la morphologie et la morphométrie brute, et peut être stocké pendant des semaines avant d&#39;applications en aval tels que l&#39;histologie de paraffine, cryosectioning, et / ou immunohistochimie monter ensemble. Ces méthodes d&#39;établir le barbeau maxillaires comme un roman dans le système de tissus in vivo pour l&#39;étude de la capacité régénératrice de multiples types de cellules dans le contexte génétique de poisson zèbre.

Le poisson zèbre barbillon maxillaire est un organe des sens tégumentaires contenant ectodermique, mésodermique et dérivés de la crête neurale. Surtout, le barbeau adulte peut se régénérer après une amputation proximale. Cette vidéo présente le développement maxillaire barbeau et démontre un protocole chirurgical pour induire la régénération, suivie par imagerie de collecte, l&#39;intégration et en aval de spécimens barbeau.

Méthodes pour l&#39;étude de l&#39;Barbel Zebrafish maxillaire

Les barbules sont des appendices sensoriels cutanés présents chez les poissons, les reptiles et les amphibiens. Le poisson-zèbre, *Danio rerio*, développe deux paires de barbules : une courte barbule nasale...

Les marbres sont un ensemble hétérogène de structures sensorielles présentes chez les amphibiens, les reptiles et les poissons. Le poisson zèbre développe deux paires de marbres, une paire nasale plus petite et une paire maxillaire plus grande. Ces appendices transparents peuvent être utilisés pour étudier le développement, le maintien et la régénération de plusieurs types cellulaires du poisson zèbre.Ce vidéo présente le développement du marbre maxillaire et démontre un protocole chirurgical permettant d'induire la régénération. Les barbes sont prélevées plusieurs jours ou semaines plus tard, puis les régénérats et les témoins sont disséqués et inclus. Bonjour, je suis Elizabeth LeClair du laboratoire LeClair à l'université DePaul, et je suis Ya Chesky de la faculté de médecine Northwestern University et du Children's Memorial Research Center.Aujourd'hui, nous allons vous montrer certaines procédures permettant d'étudier le marbre maxillaire du poisson zèbre. Nous utilisons ces procédures pour étudier la croissance et le développement du marbre du poisson zèbre. Commençons donc.Vers 30 à 40 jours après la fécondation, le barbillon maxillaire apparaît comme un bourgeon épithélial transparent près du coin ventral postérieur de la maxillaire. Au fur et à mesure que le poisson zèbre mûrit, le barbillon s'allonge pour former un appendice étroit en forme de moustache, mesurant plusieurs millimètres de long. Le barbillon mature contient plusieurs types cellulaires importants, notamment des cellules pigmentaires, des cellules glandulaires, des bourgeons gustatifs, des vaisseaux circulatoires et des nerfs myélinisés.Le meilleur point est que le barbillon est transparent à tous les stades de son développement. Comme d'autres organes du poisson zèbre, le barbillon maxillaire peut régénérer suite à une amputation proximale. Dans cette section, nous démontrons une procédure pour couper le barbillon à la base de la maxillaire.Cela pourrait également être appelé une ectomie unilatérale. Le jour de l'intervention chirurgicale, préparez deux petits récipients d'eau pour poissons, l'un pour l'anesthésie et l'autre pour la récupération. Le récipient d'anesthésie contient du trica à 0,015 % tamponné à un pH de 7,0.Dans l'eau pour poissons, le réservoir de récupération contient des poissons, de l'eau et une goutte de bleu de méthylène pour contrôler les infections fongiques. Anesthésiez un à trois poissons-zèbres adultes par immersion dans le réservoir de trica ; observez jusqu'à l'arrêt des mouvements de nage et jusqu'à ce que la ventilation des branchies devienne lente et régulière. Selon la taille des poissons, l'anesthésie complète peut prendre de deux à cinq minutes.Utilisez un filet à poisson d'aquarium pour transférer les poissons sur une feuille de papier absorbant humide placée dans une boîte de Pétri. À l’aide d’une spatule émoussée, positionnez les poissons parallèlement les uns aux autres. Avec le côté latéral gauche tourné vers le haut, repliez une partie du papier absorbant sur les poissons afin de les maintenir humides.Ensuite, observer la boîte de Pétri au microscope stéréo en utilisant une lumière incidente à faible angle pour éclairer la tête. Faire le point sur la base du méat maxillaire gauche à l’aide de pinces fines. Saisir fermement la tige du méat légèrement en position distale par rapport à la limite de la maxillaire.Soulevez le morceau de marbre et insérez une paire de ciseaux à ressort à pointe fine juste au-dessus de la pince pour assurer la stabilité. Les ciseaux peuvent toucher la pince ou, de manière alternative, le fond de la boîte de Pétri. Faites glisser les mâchoires des ciseaux le long de l'axe du morceau de marbre jusqu'à ce que le bord tranchant approche le bord de la maxillaire.Couper à travers le manche en marbre et retirer le marbre amputé. Ce tissu peut être fixé et analysé séparément. Après la chirurgie, transférer le poisson dans le réservoir de récupération.Laissez les poissons se remettre pendant plusieurs heures, voire toute la nuit, puis remettez-les dans le système d'élevage. Attendez une à deux semaines pour que la régénération des barbillons se produise. Dans la section suivante, nous vous montrerons comment préparer le tissu marbré fixé pour l'analyse.Cette procédure commence par des billes qui ont été collectées et fixées quelques jours, semaines ou mois après la chirurgie. Rincez le tissu fixé dans une solution saline tamponnée et disséquez la bille régénérée du côté gauche de la tête. N'oubliez pas la barbe droite, qui sert de témoin pour le stockage temporaire.Placez à l’aide d’une pipette chaque paire correspondante de billes dans une goutte de solution saline sur une boîte de Pétri. Couvrez avec un couvercle et laissez reposer sur la paillasse pendant que vous poursuivez. Préparez votre gel en chauffant 150 millilitres d’agarose à 2 % jusqu’à dissolution complète.Équilibrez la solution dans un bain-marie à 50 à 60 degrés Celsius. Ensuite, assemblez un dispositif standard d'électrophorèse sur gel et ajoutez de un à quatre petits dents par échantillon. Versez l'agarose fondue dans le moule à gel posé sur une surface plane, en ajoutant juste assez pour former des puits très peu profonds.Remettez immédiatement les aros restants dans le bain-marie chaud. Insérez une longue pipette en verre de type Pasteur afin que celle-ci atteigne la même température que les aros. Une fois que le gel a refroidi, retirez les peignes, puis le moule à gel.Pour fixer fermement le gel, scellez les deux côtés avec du ruban adhésif de laboratoire de votre couleur préférée. Le ruban doit s'étendre de plusieurs millimètres au-dessus de la surface de l'agarose afin qu'on puisse verser ultérieurement de l'agarose supplémentaire. Placez le moule à gel sur la platine d'un microscope stéréo. Agrandissez une cavité vide et mettez les bords au point.À l’aide de poignées équipées d’épingles à insectes courbées, pipetez les billes depuis la boîte de Pétri sur la surface du gel, à proximité du puits. Faites glisser les billes dans le puits et poussez-les jusqu’au fond. Alignez les haltères parallèlement les unes aux autres et le long des bords longs du puits. Avant l’incorporation, utilisez une micropipette fine ou du papier essuie-tout de laboratoire pour éliminer le liquide en excès.À l’aide de la pipette en verre chauffée, ajoutez délicatement de l’agarose fraîche fondue autour du tissu. Effectuez les ajustements de dernière minute avant que l’agarose ne durcisse et ne remplisse pas excessivement la cuvette. Enregistrez le numéro de l’échantillon en ajoutant un petit morceau de papier numéroté à proximité.Une fois tous les échantillons inclus, lissez la surface supérieure du gel en versant une fine couche d'aros sur le dessus. Utilisez le moins possible afin que le gel reste transparent pour la photographie. Une fois le gel durci, il peut être photographié au microscope stéréo afin d'enregistrer la taille et la forme de chaque paire de billes et de recueillir des mesures morphométriques pour des analyses ultérieures.Des blocs d'agar contenant des paires correspondantes de billes peuvent être découpés dans le gel à l'aide d'un scalpel ou d'une lame de rasoir. Ces blocs peuvent ensuite être traités selon des méthodes standards pour de l'histologie en paraffine ou pour de la cryoséctionnement. Alternativement, des billes individuelles peuvent être disséquées à partir de l'agar à l'aide d'aiguilles fines rincées à l'eau, puis traitées pour d'autres applications en aval telles que l'immunohistochimie en montage entier ou la microscopie confocale.Enfin, le gel entier peut être scellé dans un sachet et conservé au frais. Les spécimens se conserveront pendant plusieurs semaines. Nous venons de vous montrer comment observer et analyser le barbillon maxillaire en développement et en régénération.Il s'agit d'un nouveau système chez le poisson zèbre, il reste donc beaucoup à découvrir. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Biology

Biologie

Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants.

Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

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Un test pour ligne latérale de régénération à l&#39;âge adulte de poisson zèbre

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Mesure en temps réel et répétée de la croissance musculaire squelettique chez un poisson-zèbre vivant soumis à une activité électrique altérée

Ce protocole décrit la récolte et la visualisation d’écailles d’élasmoïdes de poisson-zèbre au cours de la régénération in vivo . De plus, la culture ex vivo de ces cochenilles jusqu’à 7 jours après la récolte est présentée.

Régénération d’écailles de poisson-zèbre Culture d’écailles in toto et ex vivo

Le protocole décrit ici présente une procédure simple et facile à suivre pour colorer et disséquer les cartilages craniofaciaux d’une larve de poisson-zèbre âgée de 5 jours. Il peut être utilisé pour étudier l’anatomie, la forme et la taille de ces structures dans diverses conditions de développement.

Dissection des tissus craniofaciaux du poisson-zèbre lors de la coloration au bleu d’Alcian

Ce travail décrit un protocole pour quantifier la forme du cartilage craniofacial à l’aide de logiciels libres (tpsDigs2, MorphoJ et PAST) pour mesurer les changements de structure faciale chez les larves de poisson-zèbre.

Analyses morphométriques de la forme : la boîte à outils logicielle d’analyse pour la quantification de la forme craniofaciale chez le poisson-zèbre

Découvrez les méthodes d'étude du barbillon maxillaire chez le zebrafish pour la biologie régénérative. Cette vidéo présente le protocole chirurgical d'amputation et l'analyse histologique des spécimens régénérés.

Méthodes pour l'étude de l'Barbel Zebrafish maxillaire

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