Une technique pour visualiser simultanément spécifiques du virus de cellules CD8 + T et les cellules infectées In situ

En combinant l’hybridation in situ et la tétracoloration dans une technique connue sous le nom d’ISTH, il est possible de déterminer le nombre relatif et les relations spatiales entre les cellules effectrices immunitaires spécifiques de l’antigène viral et les cellules et tissus infectés par le virus. L’ISTH commence par l’intégration de tissus frais infectés par le VIS dans l’agros. Le tissu est coupé en sections de 200 microns d’épaisseur à l’aide d’un vibrato et coloré pour l’antigène viral.

Huit cellules positives CD spécifiques utilisant des tétramères du CMH marqués au C. Après la congélation, ces sections de coloration sont ensuite coupées en sections de huit micromètres d’épaisseur à l’aide d’un cryostat et une hybridation in situ est effectuée pour localiser les cellules infectées par le virus. La microscopie confocale est utilisée pour imager les sections de double coloration et finalement reconstruire les sections épaisses d’origine afin de révéler la relation entre l’effecteur immunitaire et les cellules cibles.

L’utilisation de cette procédure pour examiner l’infection précoce par le VIS s’est avérée être un bon prédicteur de la gravité de la maladie qui s’ensuit. Bonjour, je m’appelle Chinen Lee et je travaille dans l’arbre de laboratoire d’Ashley HA au Département de microbiologie de l’Université du Minnesota. Je m’appelle Pam Skinner, je suis professeure adjointe au Département des sciences biomédicales vétérinaires de l’Université du Minnesota.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour l’intérieur dans l’institut d’hybridation ou ISTH en abrégé. En plus d’utiliser la coloration inci combinée à l’hybridation inci comme nous le démontrons aujourd’hui, nous utilisons également régulièrement la coloration inci teer combinée à l’immunohistochimie pour déterminer l’emplacement, l’abondance et le profil d’expression protéique des cellules T CD huit spécifiques de l’antigène in situ u. Nous assistons aujourd’hui avec la coloration in situ avec les sections épaisses seront le Dr Heon Kim et Terry Matala et nous assistons avec une préparation de lames minces et une hybridation in situ vous sera, alors commençons.

Pour commencer cette procédure, refroidissez le bain Vibram contenant du PBSH stérile à zéro jusqu’à deux degrés Celsius. Réglez l’angle de la lame du vibromasseur sur 27 degrés. Dans la mesure du possible, conservez les tissus frais au frais sur de la glace et commencez la procédure dans les 24 heures suivant le prélèvement des tissus.

Afin de minimiser la dégradation, le vibram facilite également la coupe d’un tissu frais, enlève le tissu conjonctif et coupe l’échantillon avec un scalpel en petits morceaux et met les morceaux dans une cuve de lactosérum et couvre avec 4 % de faible point de fusion. Agros dans PBS a fondu à environ 40 degrés Celsius. Assurez-vous que le mouchoir est en contact avec le fond du plat et poussez les morceaux de tissu vers le bas s’ils flottent, solidifiez-les sur de la glace pendant trois à cinq minutes.

Ici, le tissu de la rate est utilisé, mais les ganglions lymphatiques, le vagin, le col de l’utérus, l’utérus ou d’autres tissus frais peuvent également être utilisés avec un scalpel. Coupez les agros autour du tissu et, à l’aide d’une pince, transférez soigneusement les tissus incrustés dans les agros dans le bloc de tissus. Poursuivez en enduissant un bloc de tissu Vibram de colle Loctite.

Ne déplacez pas le morceau de tissu une fois qu’il est posé sur le bloc de tissu. Laisser sécher environ 10 minutes sur de la glace. Ensuite, montez le bloc de tissu dans le vibromasseur et coupez le tissu en sections de 200 micromètres d’épaisseur en utilisant une vitesse d’avancement très lente et une amplitude relativement élevée.

À l’aide d’un pinceau, transférez les sections coupées dans une chambre tissulaire spécialisée placée dans le puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits préremplie d’un millilitre de PBSH réfrigéré. Placez jusqu’à quatre sections de tissu dans chaque chambre tissulaire. Étiquetez les échantillons et fixez le couvercle à la plaque à l’aide d’un élastique afin de colorer les sections de tissu pour les lymphocytes T spécifiques viraux.

Les tétramères conjugués ZI sont d’abord dilués dans un tampon de blocage à 0,5 microgramme par millilitre. La solution est pipetée dans une plaque de 24 puits à raison d’un millilitre par puits. Le tissu fraîchement coupé est transféré sur la plaque dans les chambres à tissus et on le laisse basculer pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Gardez un puits vide entre les chambres tissulaires contenant différents échantillons pour éviter la contamination croisée des solutions dans les étapes ultérieures. À cette étape, on peut ajouter des anticorps dirigés contre les protéines extracellulaires ou de surface cellulaire. Pour le lavage, préparez une plaque de culture tissulaire de 24 puits contenant du PBSH réfrigéré après l’incubation primaire.

Lavé deux fois en transférant les chambres tissulaires dans une assiette préremplie pendant 20 minutes à chaque fois, assurez-vous de drainer la majeure partie du liquide des chambres tissulaires avant le transfert. De plus, ne versez pas le contenu d’un échantillon dans un autre lorsque vous déplacez les chambres tissulaires et surveillez les sections des chambres tissulaires pour vous assurer qu’elles ne collent pas sur les côtés. Fixez les sections avec du paraldéhyde frais à 4 % dans du PBS pendant deux heures à température ambiante après la fixation.

Lavé deux fois avec du PBSH froid pendant cinq minutes à chaque fois pour amplifier le signal des tétramères. Incuber les sections avec des anticorps anti-fitzy de lapin dans un rapport de un à 10 000 dans un tampon de blocage pendant un à trois jours. À ce stade, on peut ajouter des anticorps contre les épitopes intracellulaires.

S’assurer de perméabiliser les cellules et de bloquer les sites non spécifiques avant l’ajout de l’anticorps. Une récupération d’antigène peut également être nécessaire après la deuxième longue incubation destinée à amplifier le signal. Lavez les sections dans PBSH trois fois pendant au moins 20 minutes et jusqu’à plusieurs heures à chaque fois.

Effectuez une incubation finale avec des anticorps appropriés marqués par fluorescence. Par exemple, on peut utiliser l’anti-lapin SI trois pour lier les anticorps anti-fitzy du lapin afin de rendre les cellules de coloration tétramère fluorescentes en rouge. Si des anticorps de souris ont été utilisés pour contre-colorer des protéines d’intérêt telles que le CD huit, pour visualiser les lymphocytes T tueurs, on peut utiliser l’anti-US Alexa 488 de chèvre pour se lier aux anticorps de souris et rendre les cellules de coloration des anticorps fluorescentes, les dilutions vertes de chaque anticorps doivent être déterminées empiriquement.

Incuber pendant un à trois jours, garder les sections à l’abri de la lumière en enveloppant les plaques et le papier d’aluminium pendant cette incubation et par la suite lorsque la lumière éteint la flore tombe. Enfin, fixez à nouveau les sections pour fixer les tétramères et les anticorps en place. Laver et monter sur une lame de microscope avec de la gélatine glycérol contenant quatre milligrammes par millilitre de gallate de profil N pour le stockage à moins 20 degrés Celsius jusqu’à la préparation de lames minces pour l’hybridation in situ.

Les coupes de coloration des tétramères in situ peuvent maintenant être analysées avec un microscope confocal afin de déterminer la localisation, l’abondance et le profil d’expression protéique du CD spécifique de l’antigène, huit lymphocytes T positifs dans l’image montrée : des coupes de tissu de rate provenant d’un renfoncement infecté par le SIV ont été colorés avec des tétramères gag pour marquer le CD spécifique du SIV, les anticorps CD huit lymphocytes T positifs au CD, les anticorps CD 20 et les anticorps CD trois. Étant donné que les compteurs de coloration avec des anticorps seront perdus à l’étape suivante. Il est important d’analyser les tétramères in situ avant d’aller de l’avant.

Commencez la procédure de coupe mince en chauffant les sections de 200 microns d’épaisseur à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un bloc de chaleur afin de détacher les sections épaisses de la glissière. Une fois les sections détachées, incrustez-les dans l’OCT sur de la glace carbonique en remplissant d’abord le fond du moule en plastique avec de l’OCT. Placez ensuite le mouchoir sur l’OCT et recouvrez-le d’OCT.

À l’aide d’un cryostat, découpez des sections de huit microns d’épaisseur dans les sections intégrées à l’OCT et collez les sections de huit microns sur des lames cloisonnées. Les lames peuvent ensuite être stockées à moins 80 degrés Celsius dans une boîte scellée pour une hybridation in situ ultérieure. L’hybridation in situ standard est utilisée pour détecter les cellules infectées par le virus via des sondes côtelées spécifiques du virus marquées S 35.

Le procédé comprend également le revêtement de sections avec une émulsion de piste nucléaire et le montage de glissières. Dans un milieu compatible avec les fluorescences, les images confocales sont acquises à l’aide d’un microscope confocal BioRad MRC 1000, équipé d’un dispositif de réflexion bleue en tube épi. La coloration tétra in situ est visualisée à l’aide de l’EPI one 605 pour le tétrafluorochrome rouge et de l’EPI 2 522 DF 32 pour le CD vert 8 fluorochrome pour l’hybridation in situ.

Utilisez la réflexion bleue EPI deux pour les grains d’argent résultant du signal d’hybridation in situ dans les autographes radio développés. Pour commencer l’acquisition d’images, acquérez les images de chaque section de gauche à droite et de haut en bas et assurez-vous de capturer chaque image avec un chevauchement d’environ 20 % avec les images voisines. Pour éviter les lacunes dans l’image de montage reconstruite, nommez chaque image en fonction de son frère et de sa colonne dans un fichier Excel.

Une fois la collecte de données des diapositives terminée, utilisez le logiciel d’assistant confocal pour projeter des images de série Z pour chaque canal en une seule image à l’aide d’une procédure d’action Photoshop à sept disponibles auprès des auteurs, fusionnez automatiquement l’image projetée des trois canaux en une seule image RVB. Ensuite, assemblez les images fusionnées en couches pour générer une image de montage de toute la section. Associez des grains d’argent individuels et une coloration tétramère aux cellules du montage à l’aide de metamorph ou de Photoshop.

Attribuez les coordonnées XY des centres ou des OID des cellules virales positives à l’ARN et aux tétramères. Exportez les données OID dans des fichiers Excel sous forme de nombres numériques pour chaque cellule et utilisez les données collectées dans les fichiers Excel pour déterminer les rapports entre les cellules effectrices immunitaires ou les cellules e et les cibles virales ou les cellules T à partir du nombre total de cellules tétramères positives et de cellules positives à l’ARN viral dans la section afin de capturer les relations spatiales entre les cellules tétramères positives et les cellules positives à ARN positif. Copiez et collez leurs tracés respectifs à partir des fichiers Excel dans un document Photoshop dans Photoshop.

Réduisez l’opacité d’un calque pour aligner et mettre à l’échelle les grilles afin qu’elles coïncident avec la couleur, sélectionnez, puis copiez-collez dans un nouveau calque. Les positions des cellules positives à l’ARN bleu éliminent la couche utilisée pour aligner les grilles et les positions des cellules positives au tétramère et des cellules positives à l’ARN viral seront révélées dans l’image aplatie. En utilisant la méthode ISTH présentée ici, nous sommes en mesure de suivre la réponse immunitaire à l’infection par le VIS après une inoculation intravaginale à cette porte d’entrée et dans les tissus lymphatiques auxquels l’infection se propage.

Il y a un grand nombre de cellules infectées sur ces sites tissulaires 10 jours après l’infection, mais jusqu’à trois jours plus tard, il y a des cellules CD A positives à la coloration verte, mais pas encore. Cellules tétra positives spécifiques du SIV colorées en rouge. La réponse immunitaire est donc trop tardive pour éliminer l’infection.

Cependant, trois semaines après l’infection, une diminution des cellules infectées est clairement visible, en particulier au niveau de la porte d’entrée. Nous avons utilisé ISTH pour montrer que l’ampleur de la réduction était corrélée à la proximité spatiale et au nombre relatif de cellules effectrices immunitaires positives aux tétramères. N-S-I-V-R-N-A cellules cibles positives, nous appelons cela le rapport E à T in vivo.

Les relations spatiales sont facilement visualisées à l’aide de cette méthode avec des cellules effectrices en rouge et des cibles virales en bleu dans ce ganglion lymphatique infecté. De nombreuses cellules effectrices et cibles sont à proximité immédiate et il existe des zones où de nombreuses cellules effectrices entourent une seule cellule positive S-I-V-R-N-A tandis que dans d’autres zones, une cellule positive S-I-V-R-N-A est seule. Le rapport d’ETT est simplement calculé lorsque les positions des cellules sont déterminées et connectées par les numéros de chacune dans le fichier Excel.

Le meilleur contrôle de l’infection virale est corrélé à un grand excès d’effecteurs rouges par rapport aux cibles vertes de 43 contre un. Dans ce cas, dans le col de l’utérus et le vagin où l’infection a commencé, les rapports ETT étaient plus faibles dans les ganglions lymphatiques. La corrélation positive entre des ratios ETT élevés et la réduction de la charge virale à partir du pic indique qu’une réponse immunitaire plus robuste à la porte d’entrée se traduit par un meilleur contrôle de l’infection.

Nous venons de vous montrer comment détecter simultanément les cellules CDAT très spécifiques et la cellule d’infection virale in situ. Cette technique nous permet de visualiser simultanément les lymphocytes T spécifiques de l’antigène et les cellules infectées par le virus dans les tissus. Cette technique peut être appliquée pour évaluer le vaccin à base de lymphocytes T positifs à la CD huit et l’interaction entre l’agent pathogène et l’hôte lors de cette procédure.

Il est important de garder tous les ARN de réactifs libres avant les informations que vous hybridez. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.