Name: Extraction dADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Découvrez une méthode d'extraction d'ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de sols et sédiments. Cette technique permet d'étudier la diversité microbienne et le potentiel métabolique des communautés bactériennes.

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Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, la Colombie-Britannique, de développement des connaissances du Fonds, Génome Colombie-Britannique et la British Columbia Ministry of Forests and Range de soutenir les études en cours sur la productivité des sols forestiers. SL a été soutenu par une bourse de la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution.

Partie I: Extraction d&#39;ADN Procédure 1. 8 heures sont nécessaires, pour le traitement des 6 échantillons excluant la quantification de l&#39;ADN. Avant de commencer l&#39;extraction, vous aurez besoin de pré-froid de mortier, un pilon et une spatule dans un congélateur à -20 ° C ou en utilisant l&#39;azote liquide. En outre, pré-froid des tubes de 50 ml contenant 20 ml de chloroforme alcool isoamylique (24:1) sur la glace. Réglez le four à hybridation à 65 ° C à préchauffer. Vérifiez solution de CTAB, s&#39;il est cristallisé chaude à 60 ° C pour faire fondre les cristaux. Remplissez la solution de dénaturation et de tampon d&#39;extraction en ajoutant les ingrédients dernier juste avant de commencer l&#39;extraction (voir la recette ci-dessous). Effectuer toutes les procédures d&#39;extraction dans une hotte. 2. Préparer le tampon de dénaturation et de tampon d&#39;extraction. Remarque: Afin de maximiser le rendement de l&#39;ADN, il est essentiel de faire des tampons avec précision en suivant les instructions. 3. Placer 2 g de sol dans un mortier pré-réfrigérée. Remarque: Le sol prélevés sur le terrain doivent être congelés sur glace sèche pour le transport et conservés à -80 ° C. Décongeler et le sol en utilisant un tamis tamis de 2 mm avant l&#39;extraction de l&#39;ADN. Vous pouvez augmenter le montant de départ du sol jusqu&#39;à 10 g. 4. Ajouter 1 ml de solution dénaturante sur le sol. 5. Gel et broyer le sol en azote liquide 2 en utilisant un pilon jusqu&#39;à ce que les particules du sol poudreux et chercher homogène. Répétez congélation et broyage à deux reprises. Remarque: Conservez l&#39;échantillon de sol gelé pendant le broyage, en utilisant suffisamment d&#39;azote liquide pour couvrir entièrement l&#39;échantillon de sol. Légère fondre lors du broyage est acceptable. 6. Transfert sol-chaussée d&#39;un tube conique de 50 ml avec une spatule de pré-réfrigérée. Note: L&#39;échantillon de sol au sol peuvent être conservés à -80 ° C à ce point, si nécessaire. 7. Ajouter 9 ml de tampon d&#39;extraction. Pour mélanger la solution et le sol, brièvement au vortex à basse vitesse. Remarque: Pour s&#39;assurer que le tampon est homogène, il chaude à 60 ° C pendant 10-15 minutes avant utilisation. Gardez le reste de tampon à 60 ° C tout au long de l&#39;extraction. Vortex à vitesse 8 (sur une échelle où 10 est le maximum). 8. Incuber pendant 40 min à 65 ° C dans un four à hybridation. Durant l&#39;incubation, les tubes tournent en permanence à la vitesse la plus basse, ou retourner doucement les tubes toutes les 10 min. Remarque: Placer le tube horizontalement dans un four à hybridation pour permettre tampon contact avec le sol sur une grande surface. La solution peut sembler un peu visqueux, pendant l&#39;incubation. 9. Centrifuger à 1800 x g pendant 10 min à 10 - 14 ° C. Transférer le surnageant dans la pré-réfrigérée tube conique de 50 ml contenant 20 ml de chloroforme-alcool isoamylique (24:1), rester sur la glace. Remarque: Lorsque vous transférez surnageant, veillez à ne pas perturber la couche organique (couche inférieure). Laisser 1-2 ml de surnageant si elle est nécessaire afin de recueillir uniquement le surnageant propre. Vous pouvez voir souvent une couche beige (environ 1-3 mm d&#39;épaisseur) sur le dessus du surnageant. Ne pas déranger cette couche lors de la collecte du surnageant. Essayez de faire glisser la pointe le long de la paroi du tube pour éviter les bris de cette couche beige. Si le surnageant est trop trouble, répéter l&#39;extraction d&#39;alcool isoamyle chloroforme-une fois de plus sur le surnageant. Ne pas utiliser les pipettes en plastique jetables lors du transfert de chloroforme, le chloroforme va fondre le plastique. Utiliser une pipette en verre, ou un verre graduée, ou verser directement dans le chloroforme 50 ml tubes coniques. 10. Extrait des pastilles de sol 2 fois plus; 10.1. Ajouter 5 ml d&#39;un tampon d&#39;extraction des granulés du sol, mélanger délicatement à l&#39;aide une astuce ml suivie par vortex brièvement à faible vitesse. Remarque: Agiter et mélanger le tampon avant utilisation. 10.2. Incuber à 65 ° C pendant 10 min dans le four d&#39;hybridation. Centrifuger à 1800 x g pendant 10 min à 10 - 14 ° C. Transférer le surnageant dans le tube à l&#39;étape 9. Gardez le tube avec surnageant recueilli et le chloroforme-alcool isoamylique sur la glace lors de l&#39;extraction. Remarque: Assurez-vous d&#39;ajouter le surnageant dans le même tube sans croix de mélange entre les échantillons. 10.3. Répétez 9.1 et 9.2 une fois de plus. 11. Utiliser une plaque tournante, très doucement le tube de roche qui contient le surnageant recueilli (14-19 ml) et de chloroforme-alcool isoamylique à 1,25 rpm pendant 10 min. Remarque: Fermez le couvercle très serré pour empêcher les fuites. Placez une serviette en papier sur la plaque bascule avant de placer le tube de sorte que toute fuite peut être facilement détectée. 12. Centrifuger à 1800 x g pendant 20 min à 10 - 14 ° C. 13. Transfert phase aqueuse dans un nouveau tube. Note: Ne pas déranger l&#39;interphase entre la phase aqueuse (couche supérieure) et organisationsnique (couche inférieure) lorsque vous transférez le surnageant. Laissez environ 1,5 à 2 ml surnageant afin d&#39;assurer la collecte de seulement surnageant propre. 14. Récupérer l&#39;ADN en utilisant l&#39;alcool isopropylique (étape 15.a - 21.a). Sinon, utilisez Amicon ® Ultra-Centrifuge 15 dispositifs de filtrage (étape 15.b - 21.b) si vous vous attendez très faible quantité de biomasse dans votre échantillon, qui produira à peine visible à granulés par précipitation d&#39;alcool isopropylique qui est difficile à récupérer. 15.a. Placer le surnageant dans un nouveau tube d&#39;ultracentrifugation. 16.a. Ajouter l&#39;alcool isopropylique pour le surnageant recueilli dans un rapport de volume de 0,6:1. Inverser les tubes doucement quelques fois pour mélanger. Incuber 17.a pendant 30 min à température ambiante. 18.a. Centrifuger à 16000 x g, pendant 20 min à 20 - 25 ° C. S&#39;assurer que le poids de tous les tubes sont équilibrés, bien avant l&#39;étape de centrifugation. Remarque: Repérer le sens de la force centrifuge sur le tube, de sorte que vous pouvez détecter le culot d&#39;ADN plus facilement lorsque le rendement en ADN est faible. 19.a. Retirer l&#39;alcool isopropylique par décantation ou aspiration sous vide. Attention à ne pas perturber le culot d&#39;ADN. Remarque: Retirez l&#39;alcool isopropylique, dès que la centrifugation est terminée. Soyez très prudent pour ne pas perdre le culot d&#39;ADN. La taille du culot d&#39;ADN peut varier considérablement selon le type de sol, de façon visible clairement (diamètre ~ 9 mm) pour à peine visible. Il est recommandé d&#39;enlever les résidus d&#39;alcool isopropylique par aspiration le long de la paroi du tube soigneusement afin de ne pas aspirer le culot d&#39;ADN. 20.a. Dry culot d&#39;ADN à température ambiante pendant 5 - 20 min. Note: Ne pas trop sèche culot d&#39;ADN, sinon il sera difficile à redissoudre l&#39;ADN. 21.a. Reprendre le culot d&#39;ADN dans 200 ul de TE. Il Mélanger en tapotant doucement. Transférer la solution d&#39;ADN en tube de 1,5 ml. Garder le tube à 4 ° C pendant la nuit, afin de dissoudre complètement l&#39;ADN. Remarque: Selon la taille des granulés, vous pouvez régler le volume de TE à ajouter. Habituellement de 200 à 400 ul de TE fonctionne bien. * Ou suivez les étapes 15.b - 21.b. 15.b. Pré-lavage Amicon ® Ultra-Centrifuge 15 dispositifs de filtrage, ajouter 15 ml de TE à l&#39;appareil et centrifuger à 3500 x g pendant 10 min. Jeter l&#39;effluent à travers. 16.b. Placer la solution d&#39;ADN de l&#39;étape 13 au filtre Amicon pré-lavés. Centrifuger à 3500 x g jusqu&#39;à ce que le volume ADN est réduite à 200 - 500 pi. Jeter l&#39;effluent à travers. 17.b. Laver l&#39;ADN avec TE deux fois; ajouter 10 ml de TE aux dispositifs Amicon filtre. Centrifuger à 3500 x g jusqu&#39;à ce que le volume ADN est réduite à environ 200 pi. Jeter l&#39;effluent à travers. Répéter une fois de plus. 18.B. Transférer la solution d&#39;ADN sur le filtre à un nouveau tube de 1,5 ml. 19.b. Ajouter 40 ul de TE au filtre Amicon. Lavez les deux côtés de membranes de filtration par aspiration et refoulement, afin de récupérer tout résidu d&#39;ADN sur le filtre. Ajouter cette solution de lavage pour le tube à 18.B. étape 20.b. Si nécessaire, l&#39;ADN peut être davantage concentrés par Microcon ® Ultracel YM-30 Unité de filtre centrifuge; pré-laver le filtre en ajoutant 200 ul de TE et la centrifugation à 10000 xg pendant 7 minutes. Ajouter la solution d&#39;ADN sur le filtre et centrifuger à 5000 x g pendant 1 min. Répétez jusqu&#39;à ce que la centrifugation quantité de solution d&#39;ADN sur le filtre réduit à 50 pi environ. Remarque: Le volume maximal de l&#39;échantillon initial pour Microcon filtre est de 500 pi. Ne pas centrifuger à une vitesse supérieure à 14 000 x g. Ne pas trop centrifugeuse jusqu&#39;à la membrane sèche complètement. Assurez-vous que certains liquides couvre encore le filtre après centrifugation. Si vous plus centrifugé et la membrane est sèche, puis ajouter 15 ul de TE, agiter doucement pendant 30 secondes, et passez à l&#39;étape 21.b. 21.b. Placez l&#39;unité de filtre à l&#39;envers dans un tube et centrifuger Microcon nouvelles à 1000 xg pendant 3 minutes pour récupérer les ADN. 22. Quantifier l&#39;ADN du gel par TAE (0,8%, 0.5xTAE, 50 V pour 4 heures), et par spectrophotomètre Nanodrop ou Pico-vert dosage et lecteur de plaque. Nota: Un montant ADN peut être estimée en comparant la bande de l&#39;échantillon à la bande de marqueur à la concentration connue (Haute marqueur d&#39;ADN moléculaire ou λHindIII) sur le gel. 23. Vérifier l&#39;intégrité de l&#39;ADN de haut poids moléculaire en utilisant électrophorèse en champ pulsé (PFGE) avec 1%, 1xTAE gel (Pour plus de détails, voir l&#39;Étape II, part2 au <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 par Taupp et al 2009).. Note: Vous pouvez utiliser régulièrement un gel d&#39;agarose à cet effet QC lieu de basse température de fusion d&#39;agarose. En bref, électrophorèseconditions résistance sont comme suit: 2-250 ko, 6 volts, initiales temps de commutation: 5 sec, temps final de commutation: 15 sec, une durée de 12 heures à 14 ° C. SYBR Gold coloration pendant une heure pour visualiser l&#39;ADN sur le gel. 24. Si le poids moléculaire de l&#39;ADN extrait sont satisfaisants, puis passez à l&#39;étape suivante de centrifugation en gradient de CsCl. Alternativement, l&#39;ADN peut être conservé à -20 ° C ou -80 ° C avant la centrifugeuse CsCl. La taille médiane de l&#39;ADN devrait être l&#39;égal ou supérieur à 36 Ko, si vous voulez construire une bibliothèque d&#39;insérer grande métagénomique ADN. Partie II. Purification d&#39;ADN à l&#39;aide de césium ultracentrifugation en gradient de chlorure de Préparation de la centrifugeuse: 1,5 - 2 heures Étape de centrifugation: 18 heures Retrait de bromure d&#39;éthidium (BET) et concentre l&#39;ADN après centrifugation: 3 heures Procédure Pour plus de détails, reportez-Wright et al. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 Résultats Représentant / résultat Le montant total de l&#39;ADN génomique isolé à partir de 2 g de forêt organique du sol (O horizon) et horizons minéraux (Ae, AB et Bt horizons) (échantillon de la productivité des sols à long terme (LTSP) site situé à Skulow lac, BC, Canada et gérés par BC Ministry of Forests and Range) variait de 10 mg à 180 mg. La taille médiane de l&#39;ADN isolé a été généralement entre 40 - 60 Ko (figure 1). Le rapport de l&#39;absorbance à 260 nm a été nm/280 entre 1.3 à 1.6 et il y avait un pic à 230 nm, ce qui peut indiquer une contamination acide humique souvent observé dans les échantillons de sol. La centrifugation en gradient de CsCl considérablement réduit cette contamination et a également augmenté le ratio de 260 / 280-1.8 - 1.9 Comme le montre la figure 2a et 2b. <img src="files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. ECP photos de l&#39;ADN génomique extrait avant ultracentrifugation CsCl. lane1: 1 ko marqueur de 100 ng, piste 2: λHind III marqueur de 100 ng, piste 3: λHind III marqueur de 250 ng, piste 4: λHind III marqueur de 500 ng, lane5: fosmide 36 ko marqueur de 100 ng, voies 6 et 7: génomique l&#39;ADN isolé à partir du sol minéral horizon Ae, couloir 8 et 9: l&#39;ADN génomique isolé de l&#39;AB horizon minéral du sol sur le site LTSP situé Skulow Lake, C.-B. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" border="0" /></a> Chromograms Figure 2. De l&#39;ADN génomique détecté par spectrophotomètre avant (A) et après ultracentrifugation CsCl (B). Notez la réduction de la valeur d&#39;absorbance à la longueur d&#39;onde nm 230 après ultracentrifugation CsCl, ce qui indique une amélioration dans la qualité de l&#39;ADN génomique.

<ol><li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22AEM%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+insert+environmental+genomic+library+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Recette * Solution dénaturante 4 M Guanidine isothiocyanate 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) EDTA 1 mM 0,5% de 2-mercaptoéthanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Solution de dénaturation: 10 ml au total </td></tr><tr><td> Isothiocyanate de guanidine (MW 118.16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter de l&#39;eau à 9,95 ml au total. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter 50 ul de 2-mercaptoéthanol juste avant utilisation. (5 ul de 2-mercaptoéthanol par 1 ml Solution dénaturation) Remarque: Conservez la solution dénaturante à 4 ° C. Ne pas utiliser de tampon plus d&#39;une semaine. Si possible, faire tampon frais d&#39;utilisation. </td></tr></table> Tampon d&#39;extraction ** 100 mM de tampon phosphate de sodium [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM d&#39;EDTA [pH 8,0] 1,5 M de NaCl Bromure de Hexadecyltrimethylammonium 1% (CTAB) 2% de SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Tampon d&#39;extraction pour 1 litre au total </td></tr><tr><td> Sodium 1M tampon phosphate [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Tris-HCl 1M [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave et le conserver à température ambiante. </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter 200ml, le bromure Hexadecyltrimethylammonium 5% (CTAB, autoclave) et 100 ml, 20% de SDS (autoclave) juste avant utilisation. Si CTAB a été cristallisé, le faire fondre à 60 ° C. * Buffer phosphate de sodium 1M: 57,7 ml, de sodium 1M phosphate monobasique (NaH 2 PO 4) et 42,3 ml, 1 M phosphate de sodium dibasique (NaH 2 PO 4). Ajuster le pH à 7,0 Note: Ne pas utiliser 20% de SDS si elle a des précipitations. Il est normal de voir la suspension laiteuse quand vous ajoutez à la solution de SDS. Une fois que vous ajoutez SDS, placer le tampon d&#39;extraction à 60 ° C pour assurer la SDD est ainsi suspendu. </td></tr></table>

extraction d&#39;adn de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Le microbiome sol est un réservoir vaste et relativement inexploré de la diversité génomique et l&#39;innovation métabolique qui est intimement associé à des éléments nutritifs et flux d&#39;énergie dans les écosystèmes terrestres. La culture indépendante génomique environnementale, aussi connu comme métagénomique, les approches promets un accès sans précédent à cette information génétique à l&#39;égard de la reconstruction et la voie de criblage fonctionnel à des fins thérapeutiques de grande valeur et des processus de conversion de la biomasse. Toutefois, le microbiome sol reste encore un défi largement dû à la difficulté d&#39;obtenir un ADN de haut poids moléculaire d&#39;une qualité suffisante pour la production d&#39;insérer grande bibliothèque. Ici, nous introduisons un protocole pour l&#39;extraction de haut poids moléculaire, l&#39;ADN génomique microbienne communauté de sols et les sédiments. La qualité de l&#39;ADN génomique isolé est idéal pour la construction de grands insertion environnementale des banques génomiques pour des applications de séquençage et de dépistage en aval. La procédure débute par la lyse cellulaire. Les parois cellulaires et les membranes des microbes sont lysées par les deux forces mécaniques (broyage) et chimiques (β-mercaptoéthanol). L&#39;ADN génomique est ensuite isolé en utilisant un tampon d&#39;extraction, le chloroforme-alcool isoamylique et d&#39;alcool isopropylique. Les tampons utilisés pour la lyse et des étapes d&#39;extraction comprennent isothiocyanate de guanidine et le bromure de hexadécyltriméthylammonium (CTAB) pour préserver l&#39;intégrité de l&#39;ADN génomique de haut poids moléculaire. Selon votre application en aval, l&#39;ADN génomique isolé peut être davantage purifiée en utilisant du chlorure de césium (CsCl) ultracentrifugation en gradient, ce qui réduit les impuretés, notamment des acides humiques. La première procédure, l&#39;extraction, il faut environ 8 heures, à l&#39;exclusion étape quantification de l&#39;ADN. L&#39;ultracentrifugation en gradient de CsCl, est un processus en deux jours. Pendant toute la procédure, l&#39;ADN génomique devrait être traitée en douceur pour éviter le cisaillement, éviter les vortex sévère et répétitif pipetage rudes.

Une méthodologie pour isoler de haut poids moléculaire et de haute qualité à partir de l&#39;ADN génomique des communautés microbiennes du sol est décrite.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

Le microbiome du sol est un vaste réservoir de diversité génomique et d'innovation métabolique, relativement inexploré, qui est intimement associé à ...

Bonjour, je suis San Lee du laboratoire de Stephen Harlem, du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de la Colombie-Britannique. Aujourd'hui, nous vous présentons une procédure d'extraction d'ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de sols forestiers, applicable également à une grande variété de types de sols et de sédiments. Nous utilisons l'ADN génomique de haut poids moléculaire pour construire la bibliothèque métagénomique des communautés microbiennes du sol.Avec ces bibliothèques en main, nous pouvons étudier la diversité et le potentiel métabolique des communautés microbiennes réparties entre différents horizons du sol. Commençons donc. Ce protocole débute par la lyse cellulaire.La première étape consiste à compléter le tampon de dénaturation en ajoutant du bêta-mercaptoéthanol à une concentration de 0,5 %. Pour de meilleurs résultats, préparez la solution dénaturante fraîchement à chaque fois. Sinon, utilisez un tampon âgé de moins d'une semaine et conservé à quatre degrés Celsius. Pour l'étape suivante, vous aurez besoin d'un bain d'azote liquide, d'un autoclave, ainsi que d'un mortier, d'un pilon et d'une spatule prérefroidis.Placez un échantillon de sol congelé de deux grammes dans le mortier prérefroidi. Ajoutez un millilitre de la solution dénaturante. Ensuite, ajoutez de l'azote liquide pour recouvrir complètement le sol.Utilisez un pilon prérefroidi pour broyer l'échantillon jusqu'à ce que les particules de sol apparaissent pulvérulentes et homogènes et que l'échantillon commence à fondre. Ajoutez alors plus d'azote liquide et répétez l'étape de broyage. Ceci achève l'étape de lyse cellulaire à l'aide d'une spatule prérefroidie.Transférez l'échantillon broyé dans un tube conique de 50 millilitres. Conservez l'échantillon sur de la glace pour passer immédiatement à l'étape d'extraction de l'ADN ou stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour une utilisation en litre, juste avant de commencer l'extraction de l'ADN, préparez le tampon d'extraction en ajoutant du bromure d'hexadécyltriméthylammonium ou CTAB et du SDS. D'abord.Vérifiez si le CTAB est cristallisé, et dans l'affirmative, dissolvez-le à 60 degrés Celsius avant de poursuivre. Ajoutez-le ensuite à la solution pour obtenir une concentration finale de 1 %. Puis ajoutez une solution de SDS à 20 % pour atteindre une concentration finale de 2 %. La suspension laiteuse qui se forme est normale.Une fois le SDS ajouté, maintenir l'homogénéité du tampon d'extraction préparé en le conservant à 60 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Une fois que le tampon d'extraction est bien dissous et homogène, ajouter neuf millilitres de tampon d'extraction à l'échantillon de sol et vortexer brièvement à faible vitesse pour mélanger. Incuber l'échantillon avec le tampon d'extraction dans un four d'hybridation à 65 degrés Celsius pendant 40 minutes.Pendant l'incubation, retournez doucement les tubes toutes les 10 minutes ou faites-les tourner en continu à la vitesse minimale du rotor. Pendant l'incubation, la solution peut devenir légèrement visqueuse après l'incubation. L'étape suivante consiste à utiliser un mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique pour purifier l'ADN en le séparant des composants organiques présents dans le mélange de lyse.Commencez par centrifuger l'échantillon pendant 10 minutes à 1800 Gs à environ 10 à 14 degrés Celsius dans la hotte, puis récupérez le surnageant contenant l'ADN en faisant glisser soigneusement la pointe de votre pipette le long de la paroi du tube, en évitant la couche beige en surface et la couche organique au fond. Transférez le surnageant dans un tube de 50 millilitres prérefroidi contenant 20 millilitres d'alcool au chloroforme ISL ou i a a ensuite, répétez le processus d'extraction deux fois supplémentaires sur le même échantillon. Pendant ce temps, maintenez l'extrait d'ADN et le chloroforme i a a sur glace dans la hotte.Pour la deuxième extraction d'ADN, revenir au tube contenant le culot de sol avec le tampon d'extraction résiduel et ajouter cinq millilitres supplémentaires de tampon d'extraction. Mélanger doucement à l’aide d’une pipette de un millilitre et vortexer brièvement pour resuspendre le culot, comme précédemment. Cette fois, incuber à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, centrifuger à 1800 G pendant 10 minutes. Dans la hotte, à environ 10 à 14 degrés Celsius, transférer le surnageant dans le tube contenant le chloroforme, l'alcool isoamylique ou le chloroforme i a a et le surnageant de l'extraction précédente. Répéter l'ensemble du processus d'extraction une fois supplémentaire afin d'extraire autant d'ADN que possible de l'échantillon de sol.Lorsque vous avez effectué un total de trois extractions sur votre échantillon de sol, agitez très doucement le tube contenant le surnageant collecté et le chloroforme i a a sur une plaque tournante à 1,25 tr/min pendant 10 minutes. Après cette étape de mélange, centrifugez le tube à 1800 g pendant 20 minutes à environ 10 à 14 degrés Celsius. Après la centrifugation, transférez soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube d'ultracentrifugation, en laissant un à deux millilitres de SNAT afin d'éviter de perturber l'interface entre les phases aqueuse et organique. Pour précipiter l'ADN, ajoutez maintenant 0,6 millilitre d'alcool isopropylique.Pour chaque millilitre de surnageant recueilli, retourner doucement les tubes plusieurs fois afin de mélanger. À ce stade, vous pourriez être en mesure d'observer le précipité d'ADN sous forme de longs filaments. Incuber ensuite l'ADN avec l'isopropanol pendant 30 minutes à température ambiante.Après l'incubation, il est temps de récupérer l'ADN sous forme de culot par centrifugation : marquez un coin du tube lorsque vous le placez dans la centrifugeuse afin de savoir où s'attendre au culot d'ADN. Centrifuger à 16 000 ×g pendant 20 minutes à une température de 20 à 25 degrés Celsius. Après la centrifugation, éliminer l'alcool isopropylique par décantation ou aspiration sous vide. Veiller à ne pas perdre le culot d'ADN, dont la taille varie de quasi invisible à neuf millimètres de large, selon l'efficacité de l'extraction et la quantité de biomasse présente dans les échantillons de sol. Sécher le culot d'ADN à température ambiante pendant cinq à vingt minutes. Faire attention à ne pas trop sécher le culot une fois qu'il est sec.Resuspendre l'ADN dans 200 à 400 microlitres de te. Mélanger en tapotant doucement. Transférer la solution d'ADN dans un tube de 1,5 millilitre.Conserver l'ADN à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Afin de dissoudre complètement l'ADN une fois qu'il a été extrait de l'échantillon de sol, les étapes restantes pour vérifier la concentration et l'intégrité de l'ADN sont des procédures standard, décrites en détail dans un autre protocole JoVE du laboratoire Hallam. Déterminer la concentration en ADN en utilisant la méthode de votre choix.Vérifiez également l'intégrité de l'ADN de haut poids moléculaire en analysant 10 à 20 microlitres de votre échantillon d'ADN par électrophorèse en champ pulsé, ou PFGE. La taille médiane de l'ADN doit être de 36 kilobases ou plus, selon l'application en aval. Passez ensuite à l'étape suivante de centrifugation sur gradient de chlorure de césium ; alternativement, l'ADN peut être conservé à moins 20 degrés Celsius ou à moins 80 degrés Celsius avant l'ultracentrifugation.L'étape suivante consiste à utiliser une centrifugation sur gradient de chlorure de césium afin de purifier davantage l'ADN en éliminant les impuretés, puis, après la centrifugation sur gradient de chlorure de césium, à concentrer et purifier davantage l'ADN à l'aide de dispositifs de filtration centrifuge AmCon et MicroCon. La centrifugation sur gradient de chlorure de césium est essentielle pour obtenir un ADN de haute qualité et est décrite en détail dans un autre protocole JoVE du laboratoire Hallam. Après avoir effectué les étapes de centrifugation sur gradient de chlorure de césium et de concentration, vérifiez la concentration d'ADN à l'aide de la méthode de votre choix.Ensuite, vérifiez une fois de plus l'intégrité de l'ADN de haut poids moléculaire en analysant un petit échantillon d'ADN par électrophorèse en champ pulsé (PFGE). La quantité totale d'ADN génomique isolée à partir de deux grammes de sol forcé varie de 10 à 180 microgrammes, comme indiqué sur le gel analysé avant et après ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium. La taille de l'ADN isolé se situe généralement entre 40 et 60 kilobases ; ci-dessous figure un chromatogramme d'échantillons d'ADN génomique avant et après ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium.Cette étape améliore la pureté de l'ADN, augmentant le rapport 260 sur 280 de 1,3 à 1,6 avant à 1,8 à 1,9 après. De plus, le pic d'absorbance à 230 nanomètres, qui indique une contamination par l'acide humique, a été réduit avec succès après la centrifugation. Nous venons de vous montrer comment isoler de l'ADN génomique à haut poids moléculaire à partir de communautés microbiennes du sol.Lors de cette procédure, il est important de se souvenir de préparer l'extraction et le tampon de dénaturation en suivant précisément les instructions. Et faites attention à ne pas atteindre votre palette d'ADN après la précipitation par l'alcool isopropylique. Lorsque vous récupérez la bande d'ADN après la centrifugation sur gradient de chlorure.N'oubliez pas de rincer la seringue avec le tampon TE afin de maximiser la récupération de l'ADN. Et enfin, vérifiez la quantité et la qualité de votre ADN isolé à toutes les étapes suggérées. Voilà, c'est terminé.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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