Extraction d'ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

Bonjour, je m’appelle San Lee et je travaille dans le laboratoire de Stephen Harlem au Département de microbiologie et d’immunologie de l’Université de la Colombie-Britannique. Aujourd’hui, nous vous montrons une procédure d’extraction génomique de haut poids moléculaire, d’extraction de l’ADN de la forêt au sol qui s’applique également à une grande variété de types de sols et de sédiments. Nous utilisons de l’ADN génomique de haut poids moléculaire pour construire la bibliothèque de mètres forestiers des communautés microbiennes du sol.

Avec ces bibliothèques en main, nous pouvons étudier la diversité et le potentiel métabolique des communautés microbiennes qui se répartissent entre différents horizons de sol. Alors commençons. Ce protocole commence par la lyse cellulaire.

La première étape consiste à compléter le tampon de dénaturation en ajoutant de l’éthanol de betta mer capto à une concentration de 0,5 %. Vous pouvez également utiliser un tampon de moins d’une semaine qui a été conservé à quatre degrés Celsius. Pour l’étape suivante, vous aurez besoin d’un faiseur d’azote liquide et d’un pilon et d’une spatule à mortier pré-refroidis.

Placez un échantillon de sol congelé de deux grammes dans le mortier pré-refroidi. Ajouter un millilitre de solution dénaturante. Ajoutez ensuite de l’azote liquide pour couvrir complètement le sol.

À l’aide d’un pilon pré-refroidi, broyez l’échantillon jusqu’à ce que les particules de sol aient l’air poudreuses et homogènes et que l’échantillon commence à fondre. Ajoutez ensuite plus d’azote liquide et répétez l’étape de broyage. Celle-ci complète l’étape de lyse cellulaire à l’aide d’une spatule pré-réfrigérée.

Transférez l’échantillon broyé dans un tube conique de 50 millilitres. Conservez l’échantillon sur de la glace pour passer immédiatement à l’étape d’extraction de l’ADN ou stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour une utilisation en litres, juste avant de commencer l’extraction de l’ADN, complétez le tampon d’extraction en ajoutant du bromure de triméthylammonium hexa déco ou CTAB et SDS. Premier.

Vérifiez si le CTAB est cristallisé et, si c’est le cas, dissolvez-le à 60 degrés Celsius avant de continuer. Ensuite, ajoutez-le à la solution pour une concentration totale de 1 %Ensuite, ajoutez 20 % de solution SDS à une concentration finale de 2 %La suspension lactée. C’est normal.

Une fois la FDS ajoutée, conservez l’homogénéité du tampon d’extraction terminé en le stockant à 60 degrés Celsius après 10 à 15 minutes. Une fois que le tampon d’extraction est bien dissous et homogène, ajoutez neuf millilitres de tampon d’extraction à l’échantillon de sol et agitez brièvement à basse vitesse pour mélanger. Incuber l’échantillon avec le tampon d’extraction dans un four d’hybridation à 65 degrés Celsius pendant 40 minutes.

Pendant l’incubation, retournez doucement les tubes toutes les 10 minutes ou faites tourner continuellement les tubes à la vitesse la plus basse du rotor. Pendant l’incubation, la solution peut apparaître légèrement visqueuse après l’incubation. L’étape suivante consiste à utiliser de l’alcool isoamylique de forme chloroforme pour purifier l’ADN de la matière organique dans le mélange de lyse.

Commencez par centrifuger l’échantillon pendant 10 minutes à 1800 Gs à environ 10 à 14 degrés Celsius dans le capot, collectez l’ADN contenant le surnageant en glissant soigneusement la pointe de votre pipette le long du côté du tube, en évitant la couche beige sur le dessus et la couche organique sur le dessous. Transférez le surnageant dans un tube pré-refroidi de 50 millilitres contenant 20 millilitres d’alcool chloroforme ISL ou ensuite, répétez le processus d’extraction deux fois de plus sur le même échantillon. Pendant ce temps, conservez l’extrait d’ADN et le chloroforme i a a sur de la glace dans la capuche.

Pour la deuxième extraction d’ADN, retournez dans le tube contenant la pastille de sol avec le tampon d’extraction résiduel et ajoutez cinq millilitres supplémentaires de tampon d’extraction. Remuez doucement avec un embout d’un millilitre pour mélanger et agitez brièvement pour remettre le granulé en suspension comme auparavant. Incuber à 65 degrés Celsius cette fois pendant 10 minutes.

Puis centrifuger à 1800 Gs pendant 10 minutes. À environ 10 à 14 degrés Celsius dans la hotte, transférez le surnageant dans le tube contenant le chloroforme, l’alcool isoamylique ou le chloroforme i a a a et le surnageant de l’extraction précédente. Répétez l’ensemble du processus d’extraction une fois de plus pour extraire autant d’ADN que possible de l’échantillon de sol.

Lorsque vous avez effectué un total de trois extractions sur votre échantillon de sol, secouez très doucement le tube contenant le supra natant et le chloroforme collectés sur une plaque rotative à 1,25 RRP m pendant 10 minutes Après cette étape de mélange, centrifugez le tube à 1800 Gs pendant 20 minutes à environ 10 à 14 degrés Celsius. Après la centrifugation, transférez soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube d’ultra-centrifugeuse, en laissant un à deux millilitres de SNAT afin d’éviter de perturber l’interface entre les phases aqueuse et organique. Maintenant, pour précipiter l’ADN, ajoutez 0,6 millilitre d’alcool isopropylique.

Pour chaque millilitre de surnageant recueilli, retournez doucement les tubes plusieurs fois pour mélanger. À ce stade, vous pourrez peut-être voir l’ADN se précipiter en longs fils. Ensuite, incubez l’ADN avec l’isopropanol pendant 30 minutes à température ambiante.

Après l’incubation, il est temps de granuler l’ADN par centrifugation, de marquer un coin du tube lorsque vous le placez dans la centrifugeuse afin que vous sachiez où vous attendre la pastille d’ADN Spin à 16 000 GS pendant 20 minutes à 20 à 25 degrés Celsius après la centrifugation, retirez l’alcool isopropylique par décantation et/ou aspiration sous vide. Veillez à ne pas perdre la pastille d’ADN, dont la taille varie de peu visible à neuf millimètres de large, en fonction de l’efficacité de l’extraction et de la biomasse dans les échantillons de sol, séchez la pastille d’ADN à température ambiante pendant cinq à 20 minutes. Attention à ne pas trop sécher lorsque le granulé est sec.

Remettre en suspension l’ADN dans 200 à 400 microlitres de te. Mélangez-le en tapotant doucement. Transférez la solution d’ADN dans un tube de 1,5 millilitre.

Conservez l’ADN à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Afin de dissoudre complètement l’ADN une fois que l’ADN a été extrait de l’échantillon de sol, les étapes restantes pour vérifier la concentration et l’intégrité de l’ADN de l’échantillon sont des procédures standard, qui sont décrites en détail dans un autre protocole JoVE du laboratoire Hallam. Déterminez la concentration d’ADN à l’aide de la méthode de votre choix.

Vérifiez également l’intégrité de l’ADN de haut poids moléculaire en prélevant 10 à 20 microlitres de votre échantillon d’ADN à l’aide de l’électrophorèse sur gel en champ pulsé ou PFGE. La taille médiane de l’ADN doit être de 36 kilobases ou plus selon votre application en aval. Passez à l’étape suivante de la centrifugeuse à gradient de chlorure de césium alternativement, l’ADN peut être stocké à moins 20 degrés Celsius ou moins 80 degrés Celsius avant l’ultracentrifugation.

L’étape suivante consiste à utiliser la centrifugation à gradient de chlorure de césium pour purifier davantage l’ADN en éliminant les impuretés, après un concentré de centrifugation à gradient de chlorure de césium, et à purifier davantage l’ADN à l’aide de dispositifs de filtre centrifuge AmCon et MicroCon. La centrifugation par gradient de chlorure de césium est essentielle pour obtenir un ADN de haute qualité et est décrite en détail dans un autre protocole JoVE du laboratoire Hallam. Après avoir effectué les étapes de centrifugation et de concentration du gradient de chlorure de césium, vérifiez la concentration d’ADN à l’aide de la méthode de votre choix.

Ensuite, vérifiez à nouveau l’intégrité de l’ADN de haut poids moléculaire en prélevant un petit échantillon de l’ADN à l’aide de l’EFP. La quantité totale d’ADN génomique isolée à partir de deux grammes de sol forcé varie de 10 à 180 microgrammes, comme le montre l’analyse sur gel avant et après l’ultracentrifugation au chlorure de césium. La gamme de taille de l’ADN isolé varie généralement entre 40 et 60 kilobases, illustrée ici est un chromatogramme d’échantillons d’ADN génomique avant et après l’ultracentrifugation du chlorure de césium.

Cette étape améliore la pureté de l’ADN, augmentant le rapport deux 60 sur deux 80 de 1,3 à 1,6 avant à 1,8 à 1,9 par la suite. De plus, le pic d’absorbance à 230 nanomètres, ce qui implique que la contamination par l’acide humique, a été réduite avec succès après centrifugation. Nous venons de vous montrer comment isoler de l’ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de communautés microbiennes du sol.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de faire le tampon d’extraction et de dénaturation en suivant précisément les instructions. Et attention à ne pas atteindre votre palais d’ADN après la précipitation d’alcool isopropylique. Lorsque vous récupérez la bande d’ADN après centrification du gradient de chlorure.

N’oubliez pas de rincer la seringue avec le TE pour maximiser la récupération de l’ADN. Et enfin, de vérifier la quantité et la qualité de votre ADN isolé à toutes les étapes suggérées. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.