Extraction d'ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

Bonjour, je suis San Lee du laboratoire de Stephen Harlem, du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de la Colombie-Britannique. Aujourd'hui, nous vous présentons une procédure d'extraction d'ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de sols forestiers, applicable également à une grande variété de types de sols et de sédiments. Nous utilisons l'ADN génomique de haut poids moléculaire pour construire la bibliothèque métagénomique des communautés microbiennes du sol.

Avec ces bibliothèques en main, nous pouvons étudier la diversité et le potentiel métabolique des communautés microbiennes réparties entre différents horizons du sol. Commençons donc. Ce protocole débute par la lyse cellulaire.

La première étape consiste à compléter le tampon de dénaturation en ajoutant du bêta-mercaptoéthanol à une concentration de 0,5 %. Pour de meilleurs résultats, préparez la solution dénaturante fraîchement à chaque fois. Sinon, utilisez un tampon âgé de moins d'une semaine et conservé à quatre degrés Celsius. Pour l'étape suivante, vous aurez besoin d'un bain d'azote liquide, d'un autoclave, ainsi que d'un mortier, d'un pilon et d'une spatule prérefroidis.

Placez un échantillon de sol congelé de deux grammes dans le mortier prérefroidi. Ajoutez un millilitre de la solution dénaturante. Ensuite, ajoutez de l'azote liquide pour recouvrir complètement le sol.

Utilisez un pilon prérefroidi pour broyer l'échantillon jusqu'à ce que les particules de sol apparaissent pulvérulentes et homogènes et que l'échantillon commence à fondre. Ajoutez alors plus d'azote liquide et répétez l'étape de broyage. Ceci achève l'étape de lyse cellulaire à l'aide d'une spatule prérefroidie.

Transférez l'échantillon broyé dans un tube conique de 50 millilitres. Conservez l'échantillon sur de la glace pour passer immédiatement à l'étape d'extraction de l'ADN ou stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour une utilisation en litre, juste avant de commencer l'extraction de l'ADN, préparez le tampon d'extraction en ajoutant du bromure d'hexadécyltriméthylammonium ou CTAB et du SDS. D'abord.

Vérifiez si le CTAB est cristallisé, et dans l'affirmative, dissolvez-le à 60 degrés Celsius avant de poursuivre. Ajoutez-le ensuite à la solution pour obtenir une concentration finale de 1 %. Puis ajoutez une solution de SDS à 20 % pour atteindre une concentration finale de 2 %. La suspension laiteuse qui se forme est normale.

Une fois le SDS ajouté, maintenir l'homogénéité du tampon d'extraction préparé en le conservant à 60 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Une fois que le tampon d'extraction est bien dissous et homogène, ajouter neuf millilitres de tampon d'extraction à l'échantillon de sol et vortexer brièvement à faible vitesse pour mélanger. Incuber l'échantillon avec le tampon d'extraction dans un four d'hybridation à 65 degrés Celsius pendant 40 minutes.

Pendant l'incubation, retournez doucement les tubes toutes les 10 minutes ou faites-les tourner en continu à la vitesse minimale du rotor. Pendant l'incubation, la solution peut devenir légèrement visqueuse après l'incubation. L'étape suivante consiste à utiliser un mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique pour purifier l'ADN en le séparant des composants organiques présents dans le mélange de lyse.

Commencez par centrifuger l'échantillon pendant 10 minutes à 1800 Gs à environ 10 à 14 degrés Celsius dans la hotte, puis récupérez le surnageant contenant l'ADN en faisant glisser soigneusement la pointe de votre pipette le long de la paroi du tube, en évitant la couche beige en surface et la couche organique au fond. Transférez le surnageant dans un tube de 50 millilitres prérefroidi contenant 20 millilitres d'alcool au chloroforme ISL ou i a a ensuite, répétez le processus d'extraction deux fois supplémentaires sur le même échantillon. Pendant ce temps, maintenez l'extrait d'ADN et le chloroforme i a a sur glace dans la hotte.

Pour la deuxième extraction d'ADN, revenir au tube contenant le culot de sol avec le tampon d'extraction résiduel et ajouter cinq millilitres supplémentaires de tampon d'extraction. Mélanger doucement à l’aide d’une pipette de un millilitre et vortexer brièvement pour resuspendre le culot, comme précédemment. Cette fois, incuber à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, centrifuger à 1800 G pendant 10 minutes. Dans la hotte, à environ 10 à 14 degrés Celsius, transférer le surnageant dans le tube contenant le chloroforme, l'alcool isoamylique ou le chloroforme i a a et le surnageant de l'extraction précédente. Répéter l'ensemble du processus d'extraction une fois supplémentaire afin d'extraire autant d'ADN que possible de l'échantillon de sol.

Lorsque vous avez effectué un total de trois extractions sur votre échantillon de sol, agitez très doucement le tube contenant le surnageant collecté et le chloroforme i a a sur une plaque tournante à 1,25 tr/min pendant 10 minutes. Après cette étape de mélange, centrifugez le tube à 1800 g pendant 20 minutes à environ 10 à 14 degrés Celsius. Après la centrifugation, transférez soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube d'ultracentrifugation, en laissant un à deux millilitres de SNAT afin d'éviter de perturber l'interface entre les phases aqueuse et organique. Pour précipiter l'ADN, ajoutez maintenant 0,6 millilitre d'alcool isopropylique.

Pour chaque millilitre de surnageant recueilli, retourner doucement les tubes plusieurs fois afin de mélanger. À ce stade, vous pourriez être en mesure d'observer le précipité d'ADN sous forme de longs filaments. Incuber ensuite l'ADN avec l'isopropanol pendant 30 minutes à température ambiante.

Après l'incubation, il est temps de récupérer l'ADN sous forme de culot par centrifugation : marquez un coin du tube lorsque vous le placez dans la centrifugeuse afin de savoir où s'attendre au culot d'ADN. Centrifuger à 16 000 ×g pendant 20 minutes à une température de 20 à 25 degrés Celsius. Après la centrifugation, éliminer l'alcool isopropylique par décantation ou aspiration sous vide. Veiller à ne pas perdre le culot d'ADN, dont la taille varie de quasi invisible à neuf millimètres de large, selon l'efficacité de l'extraction et la quantité de biomasse présente dans les échantillons de sol. Sécher le culot d'ADN à température ambiante pendant cinq à vingt minutes. Faire attention à ne pas trop sécher le culot une fois qu'il est sec.

Resuspendre l'ADN dans 200 à 400 microlitres de te. Mélanger en tapotant doucement. Transférer la solution d'ADN dans un tube de 1,5 millilitre.

Conserver l'ADN à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Afin de dissoudre complètement l'ADN une fois qu'il a été extrait de l'échantillon de sol, les étapes restantes pour vérifier la concentration et l'intégrité de l'ADN sont des procédures standard, décrites en détail dans un autre protocole JoVE du laboratoire Hallam. Déterminer la concentration en ADN en utilisant la méthode de votre choix.

Vérifiez également l'intégrité de l'ADN de haut poids moléculaire en analysant 10 à 20 microlitres de votre échantillon d'ADN par électrophorèse en champ pulsé, ou PFGE. La taille médiane de l'ADN doit être de 36 kilobases ou plus, selon l'application en aval. Passez ensuite à l'étape suivante de centrifugation sur gradient de chlorure de césium ; alternativement, l'ADN peut être conservé à moins 20 degrés Celsius ou à moins 80 degrés Celsius avant l'ultracentrifugation.

L'étape suivante consiste à utiliser une centrifugation sur gradient de chlorure de césium afin de purifier davantage l'ADN en éliminant les impuretés, puis, après la centrifugation sur gradient de chlorure de césium, à concentrer et purifier davantage l'ADN à l'aide de dispositifs de filtration centrifuge AmCon et MicroCon. La centrifugation sur gradient de chlorure de césium est essentielle pour obtenir un ADN de haute qualité et est décrite en détail dans un autre protocole JoVE du laboratoire Hallam. Après avoir effectué les étapes de centrifugation sur gradient de chlorure de césium et de concentration, vérifiez la concentration d'ADN à l'aide de la méthode de votre choix.

Ensuite, vérifiez une fois de plus l'intégrité de l'ADN de haut poids moléculaire en analysant un petit échantillon d'ADN par électrophorèse en champ pulsé (PFGE). La quantité totale d'ADN génomique isolée à partir de deux grammes de sol forcé varie de 10 à 180 microgrammes, comme indiqué sur le gel analysé avant et après ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium. La taille de l'ADN isolé se situe généralement entre 40 et 60 kilobases ; ci-dessous figure un chromatogramme d'échantillons d'ADN génomique avant et après ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium.

Cette étape améliore la pureté de l'ADN, augmentant le rapport 260 sur 280 de 1,3 à 1,6 avant à 1,8 à 1,9 après. De plus, le pic d'absorbance à 230 nanomètres, qui indique une contamination par l'acide humique, a été réduit avec succès après la centrifugation. Nous venons de vous montrer comment isoler de l'ADN génomique à haut poids moléculaire à partir de communautés microbiennes du sol.

Lors de cette procédure, il est important de se souvenir de préparer l'extraction et le tampon de dénaturation en suivant précisément les instructions. Et faites attention à ne pas atteindre votre palette d'ADN après la précipitation par l'alcool isopropylique. Lorsque vous récupérez la bande d'ADN après la centrifugation sur gradient de chlorure.

N'oubliez pas de rincer la seringue avec le tampon TE afin de maximiser la récupération de l'ADN. Et enfin, vérifiez la quantité et la qualité de votre ADN isolé à toutes les étapes suggérées. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.