Name: Lisolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 38 s
Description: Apprenez la purification et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques chez la souris. Cette méthode permet d'isoler les CSH à long terme et d'étudier leur comportement in vivo pour la recherche sur les thérapies cellulaires.

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<p class="jove_title"> Total préparation de moelle osseuse </p><ol><li> Quatre souris B6 sont sacrifiés et disséqués pour obtenir des tibias, des fémurs, de la hanche et du rachis. </li><li> Pendant les dissections, les membres et les os sont conservés dans du PBS à 2% de FCS inactivé par la chaleur (optionnel EDA 2mm - support de dissection). </li><li> Les os propres sont écrasées au mortier et un pilon dans un milieu de dissection. Une façon efficace de le faire est d&#39;écraser les tibias, fémurs et les hanches de chaque souris, puis 2 épines à la fois. </li><li> Le mélange de cellules issues de chaque souris est séparée et filtrée à travers un filtre 40μm dans un tube de 50ml Falcon. De cette façon, chaque tube contenant le mélange de cellules obtenues sur l&#39;ensemble des os de la jambe d&#39;une souris, et la moitié du mélange obtenu à partir de 2 épines. A ce stade, le filtre est utilisé pour séparer les débris osseux. </li><li> Il est généralement conseillé d&#39;écraser les os de la jambe deux fois pour obtenir du blanc (sans la moelle osseuse) des fragments d&#39;os, et les fragments colonne vertébrale 2 ou 3 fois. </li><li> Remplir les tubes de les avoir équilibré, et de spin 5 min 1200rpm. </li><li> Aspirer le surnageant et desserrer le culot en faisant glisser les tubes sur la grille du tube (cette étape est importante après chaque centrifugation pour minimiser la formation de bouquet et de la perte de cellules). Resuspendre chaque tube dans une FCS ml de PBS à 2% (pas d&#39;EDTA à partir de maintenant) si vous faites l&#39;épuisement lignée, ou dans tout autre volume est pratique pour vous. </li></ol><p class="jove_title"> Déplétion Lineage </p><ol><li> Cette procédure vous permet d&#39;éliminer des cellules hautement différenciées et d&#39;obtenir une population très hétérogène de cellules, enrichies en cellules souches et progénitrices. Si vous êtes le tri HSC, cette étape permet de réduire drastiquement le nombre de cellules qui ont à passer par le tri cellulaire, réduisant ainsi le temps de tri et vous permettant de trier HSC d&#39;un plus grand nombre de souris, de sorte que vous pouvez obtenir un plus grand nombre de HSC dans un tri unique. </li><li> Si vous allez à trier plus tard, sortez du mélange de cellules 50 pl (j&#39;ai l&#39;habitude de prendre un peu de chaque tube) pour le tri des contrôles (sans tache et SCA1, c-Kit, CD48, FLK2 contrôles de couleur unique). </li><li> Ajouter 30ml/tube cocktail de Lin. Cocktail de Lineage contient une variété d&#39;anticorps, ce qui change malheureusement un peu d&#39;un laboratoire à. Dans le laboratoire Scadden, nous utilisons des anticorps contre le biotinilés Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Leur dilution finale de la coloration est 1:700. </li><li> Vortex rapidement pour mélanger, et laisser incuber pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Durant l&#39;incubation, préparer les colonnes sur les aimants et les tubes d&#39;élution 15ml sous les colonnes. Degas certains PBS en utilisant un filtre steriflip (vous devriez voir des bulles d&#39;air peu s&#39;oriente vers la surface de la cause de l&#39;aspiration du PBS), et d&#39;équilibrer les colonnes par l&#39;application de 3ml dégazé PBS dans chaque colonne. </li><li> Le débit de la colonne est d&#39;environ 1ml/5min, donc il faut environ 15 min pour avoir les colonnes prêtes à l&#39;emploi. </li><li> A la fin de l&#39;incubation, ajouter 2% de FCS PBS pour remplir les tubes et centrifuger pendant 5 min à 1200rpm. </li><li> Aspirer le surnageant, desserrez les boulettes et remettre en suspension dans 1 ml / tube dégazé PBS. </li><li> Si vous êtes le tri plus tard, sortez la moelle osseuse totale seule lignée coloration couleurs Ctrl (15ml, un peu de chaque tube). </li><li> Ajouter streptavidine 30ml/tube perles, vortex rapidement pour mélanger, et laisser incuber pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> A la fin de l&#39;incubation, ajouter 2 ml / tube de dégazage du PBS. Mettez les tubes de prélèvement de nouveau sous les colonnes, et d&#39;appliquer chaque suspension d&#39;une colonne, filtrant à travers un filtre 40μm. </li><li> Ajouter une autre de 3 ml d&#39;dégazé PBS dans chaque tube pour le laver. Une fois les colonnes sont vides, appliquer à nouveau en utilisant le même filtre 40μm. </li><li> L&#39;éluat contient le mélange de cellules lignée appauvri, une population hétérogène enrichi pour les cellules souches et progéniteurs. Piscine du contenu des 4 tubes en 2 tubes. Spin pendant 5 min à 1500rpm. </li><li> Aspirer le surnageant. Le culot doit être blanc ou principalement blanc. Desserrer les boulettes et les remettre en suspension ensemble dans 1ml de PBS totale FCS 2% si vous êtes le tri plus tard, sinon remettre en suspension dans tout le volume est pratique pour vous. </li></ol><p class="jove_title"> LKS ou à long terme, le tri HSC </p><ol><li> Sortez la lignée appauvri seule coloration couleurs Ctrl (15ml). Cela vous permettra d&#39;évaluer l&#39;efficacité de votre épuisement lignée. </li><li> Le mélange de cellules à trier est taché dans le tube de 15ml. </li></ol><p class="jove_content"> Ajouter anticorps: </p><p class="jove_content"><table border="0"><tbody><tr><td> Sca PE-Cy5.5 </td><td> 1: 100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> Kit APC </td><td> 1:100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> SA PE-Cy7 </td><td> 1:500 </td><td> 2ml </td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content"> Pour trier à long terme, HSC, ajoutez aussi: </p><p class="jove_content"><table border="0"><tbody><tr><td class="jove_content"> CD48 FITC </td><td class="jove_content"> 1:1000 </td><td class="jove_content"> 1ml </td></tr><tr><td class="jove_content"> FLK2 PE </td><td class="jove_content"> 1:200 </td><td class="jove_content"> 5ml </td></tr&gt; </tbody></table></p><p class="jove_content"> Aussi, préparez coloration simple contrôle à l&#39;aide de la moelle osseuse totale mis de côté après la dissection et l&#39;tachés de moelle osseuse totale de lignage. Ces colorations peuvent être effectuées directement dans les tubes FACS. </p><p> <em class="jove_content">Assurez-vous d&#39;être dans le noir!</em> </p><ol><li> Vortex rapidement pour mélanger et incuber à 4 ° C pendant 20 à 30 minutes, à mi-chemin re-mélange à travers. </li><li> Pour laver l&#39;excès d&#39;anticorps, remplir les tubes avec du PBS à 2% de FCS et de spin pendant 5 min à 1500 rpm. </li><li> Retirer le surnageant, resuspendre toutes les pastilles et les déplacer vers de nouveaux tubes FACS avec des bouchons de filtre. Il pourrait prendre un certain temps pour obtenir des cellules à passer par ces filtres, et il est important d&#39;appliquer un peu plus tard PBS pour laver le filtre et de minimiser la perte de cellules. Cette étape est nécessaire pour éviter le colmatage de la trieuse, qui est le pire cauchemar de tout utilisateur trieur de cellules. </li><li> Lors de la remise sur vos cellules à l&#39;installation de tri cellulaire, assurez-vous également de préparer un tube avec du PBS 10% SVF HI où les cellules seront collectées. </li><li> Si vous êtes le tri des cellules LKS, vous obtiendrez une population hétérogène contenant à long terme et court terme repeupler progéniteurs HSC et multipotentes. Un rendement moyen est de 300 000 LKS de 4 souris. </li><li> Si vous avez également utilisé CD48 et FLK2 anticorps, vous pouvez séparer chaque population de HSC à long terme, HSC à court terme et MPP. LT-HSC sont les populations les plus rares. Un rendement moyen est d&#39;environ 50.000 à 60.000 cellules de 4 souris. </li></ol>

l&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (csh)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

L&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

<p>Je suis Christina Ceso. Je suis postdoctorante dans le laboratoire de David Den et je travaille sur les cellules souches hématopoïétiques. Aujourd'hui, nous allons purifier des cellules souches hématopoïétiques à récupération à long terme et nous les transplanterons dans une souris.</p><p>Nous commençons par pulvériser les souris avec de l'alcool afin que, tout d'abord, l'animal soit stérilisé et que les poils n'entravent pas la dissection. Nous utilisons du PBS contenant 2 % de sérum pour la dissection. Je coupe la peau du dos et j'écarte la peau afin d'exposer le tissu.</p><p>Pour isoler le tibia, je tiens le tibia avec une pince. Je coupe le tendon au-dessus du genou, puis je sectionne les muscles situés sous le genou ; ensuite, je coupe au niveau du genou afin que le tibia ne soit plus relié au reste du membre, et je tire pour l'isoler. Je tiens ensuite le tibia à l'envers et, avec les ciseaux, je sépare le pied du tibia afin d'obtenir le fémur.</p><p>J'ai sectionné les muscles autour du fémur, puis j'ai luxé le fémur de la hanche. Afin d'isoler la hanche, j'ai coupé les muscles autour de l'os de la hanche du côté de la queue de la souris, puis j'ai écarté la hanche du corps de la souris. Pour isol</p>

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Biology

Biologie

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

Le but du présent protocole est d’isoler les primates non-humains CD34+ des cellules de moelle apprêtée, gène-modification de ces cellules avec des vecteurs lentiviraux et de préparer un produit infusion dans l’hôte autologue. La longueur totale de protocole est d’environ 48 h.

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

Ce protocole démontre l'induction d'un programme hémogène dans les fibroblastes dermiques humains par l'expression forcée des facteurs de transcription GATA2, GFI1B et FOS pour produire des cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre.

Reprogrammation hémogénique des fibroblastes humains par expression forcée des facteurs de transcription

Ce protocole permet le maintien des cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes in vitro en imitant le microenvironnement de moelle en utilisant des acides gras abondants, le cholestérol, des concentrations plus faibles de cytokines, et l’hypoxie.

Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Le présent protocole décrit une procédure optimisée de culture de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) pour la greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.

Édition génique CRISPR/Cas9 de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour des applications de thérapie génique

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’isolement des cellules souches hématopoïétiques à long terme (LT-HSC) et des CSH à court terme (ST-HSC) à l’aide du système rapporteur Hoxb5.

PROCÉDÉ D’ISOLEMENT DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES À LONG ET À COURT TERME

On présente ici un protocole pour initier, maintenir et analyser des cultures de cellules souches hématopoïétiques de souris en utilisant une expansion ex vivo à base d’alcool polyvinylique, ainsi que des méthodes pour les manipuler génétiquement par transduction lentivirale et électroporation.

<em>Ex Vivo</em> Expansion et manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques de souris dans des cultures à base d’alcool polyvinylique

Ici, nous avons établi in vivo des ostéo-organoïdes déclenchés par des échafaudages de gélatine chargés de protéine 2 morphogénétique osseuse pour récolter des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques pour la reconstruction d’un système hématopoïétique et immunitaire endommagé. Dans l’ensemble, cette approche peut fournir une source cellulaire prometteuse pour les thérapies cellulaires.

Approche ostéo-organoïde in vivo pour la récolte de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques

Nous présentons ici des protocoles qui permettent d’isoler des cellules stromales de l’os murin, de la moelle osseuse, du thymus et du tissu thymique humain compatibles avec la multiomique unicellulaire.

Isolement de cellules stromales à partir d’organes hématopoïétiques

Les injections intrafémorales permettent la greffe d’un petit nombre de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC), en plaçant les cellules directement dans la cavité de la moelle osseuse. Nous décrivons ici un protocole expérimental d’injection intrafémorale de HSPC humaines chez des souris immunodéficientes.

Injection intrafémorale de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines chez des souris immunodéprimées 

Apprenez la purification et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques chez la souris. Cette méthode permet d'isoler les CSH à long terme et d'étudier leur comportement in vivo pour la recherche sur les thérapies cellulaires.

L'isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

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