Name: Assemblée, Tuning et utilisation dun microscope en champ proche infrarouge pour limagerie Apertureless protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-25T03:33:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Apprenez l'assemblage d'un microscope infrarouge en champ proche pour l'imagerie d'agrégats protéiques. Cette méthode utilise un laser hélium-néon visible pour aligner le faisceau infrarouge invisible et permet l'observation simultanée de la topographie AFM et des signaux de champ proche.

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<ol><li>Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+the+surface+of+self-assembled+polystyrene-b-poly%28methyl+methacrylate%29+diblock+copolymer+films+using+apertureless+near-field+IR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy.</a> Langmuir. 24, 6946-6951 (2008).</li>
<li>Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared-reflection-mode+near-field+microscopy+using+an+apertureless+probe+with+a+resolution+of+lambda%2F600%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600.</a> Opt. Lett. 21, 1315-1317 (1996).</li>
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<li>Kim, Z. H., Leone, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-selective+mapping+of+near-field+intensity+and+phase+around+gold+nanoparticles+using+apertureless+near-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy.</a> Optics Express. 16, 1733-1741 (2008).</li>
<li>Bridger, P. M., McGill, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nanometer-scale+optical+property+discrimination+by+use+of+a+near-field+scanning+apertureless+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope.</a> Opt. Lett. 24, 1005-1007 (1999).</li>
<li>Stebounova, L., Akhremitchev, B. B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+weak+scattered+signal+in+apertureless+near-field+scanning+infrared+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 74, 3670-3674 (2003).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Pollack, S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apertureless+Scanning+Near-Field+Infrared+Microscopy+of+a+Rough+Polymeric+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface.</a> Langmuir. 17, 2774-2781 (2001).</li>
<li>Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D. W., Novotny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facts+and+Artifacts+in+Scanning+Near-Field+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 81, 2492-2498 (1997).</li>
<li>Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact-free+near-field+optical+imaging+by+apertureless+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy.</a> Appl. Phys. Lett. 77, 621-623 (2000).</li>
<li>Palanker, D. V., Simanovskii, D. M., Huie, P., Smith, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Contrast+Parameters+and+Topographic+Artifacts+in+Near-Field+Infrared+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 88, 6808-6814 (2000).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G. C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir. 18, 5325-5328 (2002).</li>
<li>Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+Spectroscopic+Mapping+of+Single+Nanoparticles+and+Viruses+at+Nanoscale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution.</a> Nano Lett. 7, 1307-1310 (2006).</li>
<li>Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nano-chemical+mapping+performed+by+an+AFM-based+%28%22AFMIR%22%29+acousto-optic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique.</a> Ultramicroscopy. 107, 1194-1200 (2007).</li>
<li>Yang, D. S., Yip, C. M., Huang, T. H. J., Chakrabartty, A., Fraser, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+Amyloid-%CE%B2+Aggregation+Pathway+with+Chemical+Chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones.</a> J. Biol. Chem. 274, 32970-32974 (1999).</li>
<li>Meadows, P. Y., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Microscopy+Studies+of+Fibronectin+Adsorption+and+Subsequent+Cellular+Adhesion+to+Substrates+with+Well-Defined+Surface+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries.</a> Langmuir. 21, 4096-4107 (2005).</li>
</ol>

assemblée, tuning et utilisation d&#39;un microscope en champ proche infrarouge pour l&#39;imagerie apertureless protéines

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

Ce document vise à instruire le lecteur dans le montage et le fonctionnement d&#39;un infrarouge microscope en champ proche pour l&#39;imagerie delà de la limite de diffraction. Le apertureless microscope en champ proche est une dispersion de la lumière-type d&#39;instrument qui fournit des spectres infrarouges à une résolution de 20 nm vers. Une liste complète de composants et un protocole étape par étape pour l&#39;utilisation est prévue. Erreurs fréquentes dans l&#39;assemblage et le réglage instrument sont discutées. Un ensemble représentatif de données qui montre la structure secondaire de fibrilles amyloïdes une est présentée.

Le montage d&#39;un microscope à champ proche infrarouge pour l&#39;imagerie des agrégats de protéines est décrite.

Assemblée, Tuning et utilisation d&#39;un microscope en champ proche infrarouge pour l&#39;imagerie Apertureless protéines

Cet article a pour objectif d'instruire le lecteur sur l'assemblage et le fonctionnement d'un microscope infrarouge en champ proche pour l'imagerie au-delà de la limite de diffraction. Le...

L'assemblage initial du dispositif optique est réalisé en configurant le microscope optique et le FM multi-mode. L'alignement du faisceau infrarouge invisible est facilité en procédant d'abord à l'alignement à l'aide d'un laser hélium-néon rouge visible. La ligne continue doit coïncider avec l'infrarouge, représenté par la ligne pointillée, l'objectif étant d'observer la lumière laser frappant l'apex de la pointe du levier et le détecteur infrarouge.L'alignement final du faisceau infrarouge s'effectue en ajustant la position du microscope optique ainsi que celle des miroirs afin d'obtenir un signal F unique avec la forme appropriée lorsque le signal en champ proche souhaité est obtenu. Des images simultanées de topographie en mode FM et de champ proche sont recueillies à l'aide du logiciel nano scope. Bonjour, je suis le professeur Gilbert Walker du Département de chimie de l'Université de Toronto.Bonjour, je suis Melissa Paulite, également du laboratoire de Gilbert Walker. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure d'assemblage et d'alignement initial de la liste d'ouverture du microscope infrarouge à balayage en champ proche. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les agrégats de protéines.Commençons donc. Avant de décrire le montage et le réglage du système d'imagerie, examinons d'abord un bref aperçu de l'ensemble du système. Les composants du système d'imagerie que nous décrirons dans cette vidéo incluent la table optique, la base du microscope à force atomique multimode, ou AFM, le scanner de l'AFM multimode, la platine optique surélevée, les miroirs de guidage, le tube optique avec diaphragme et centre.Bloquez le cube optique avec le réflecteur partiel en séléniure de zinc, le tube optique utilisé pour fixer le dispositif sur la plateforme élévatrice. L'objectif infrarouge, le tube optique pour la lumière rétrodiffusée collectée. Le cube avec un miroir paraboloïde hors axe, le cube destiné à maintenir la plaque de germanium à 45 degrés.L'oculaire du microscope, le trou d'épingle monté sur la platine XY, le détecteur infrarouge au tellurure de mercure cadmium ou MCT. Le préamplificateur du détecteur infrarouge commande la platine XY pour déplacer la position du faisceau, la table élévatrice pour focaliser le faisceau, la platine Z pour positionner le détecteur infrarouge et la platine X pour positionner le détecteur infrarouge. Pour commencer l'assemblage du dispositif optique, utilisez des miroirs de réglage afin de positionner le faisceau hélium-néon parallèlement à la table optique.Ensuite, sans séparateur de faisceau dans le cube et avec le tube optique allongé à l'autre extrémité du cube, dirigez le faisceau d'hélium-néon à travers les diaphragmes fixés aux extrémités des tubes. Retirez maintenant le scanner et fixez le tube optique allongé à la place de l'objectif infrarouge. Insérez le réflecteur partiel en séléniure de zinc pour diriger le faisceau vers l'échantillon.Il doit être monté de telle manière que le faisceau hélium-néon atteigne la surface avant du réflecteur au centre géométrique du cube optique. En tournant le réflecteur partiel, dirigez le faisceau à travers la sortie fermée. Comme le support du réflecteur partiel ne le maintient pas exactement perpendiculaire, nous utilisons deux vis de réglage installées sur place pour permettre un mouvement vertical du faisceau.Ensuite, utilisez des joints toriques en caoutchouc pour fixer le miroir en paraloid en resserrant les vis. Les joints toriques se compriment, permettant ainsi d'ajuster la position du miroir. Utilisez des miroirs supplémentaires pour diriger le faisceau hélium-néon dans la direction opposée, en l'ajustant pour qu'il traverse les diaphragmes précédemment utilisés.Ce faisceau servira à régler le miroir paraboloïde. Le miroir paraboloïde placé dans le cube optique reflète la lumière vers le détecteur, qui sera positionné après le diaphragme. Des vis de réglage permettent de diriger le faisceau à travers le diaphragme placé à la sortie du cube.Une fois le faisceau ajusté à travers le diaphragme, placer le détecteur MCT près du diaphragme. Ajuster la position du détecteur infrarouge de manière à ce que le faisceau d'hélium-néon atteigne l'élément sensible du détecteur. Déplacer le détecteur vers le bas d'environ deux millimètres.Insérez maintenant le support avec la fenêtre en germanium dans le cube optique situé avant le diaphragme. La fenêtre en germanium revêtue pour réfléchir sert de filtre infrarouge et permet d'observer visuellement le levier et l'échantillon. Ensuite, fixez l'oculaire.En tournant l'angle du cube, on peut orienter l'oculaire dans la direction souhaitée en faisant pivoter le support de la fenêtre en germanium. Diriger le faisceau hélium-néon à travers le centre de l'oculaire. Connecter l'objectif infrarouge et un scanner FM, puis fixer le bloqueur de faisceau.Placez un échantillon sur le scanner et dirigez le faisceau hélium-néon à travers le tube optique d'entrée. Assurez-vous que le faisceau est suffisamment large pour déborder sur le faisceau. Arrêtez en ajustant le filetage de l'oculaire.Obtenez une image nette du faisceau focalisé sur l'échantillon. Ensuite, fixez une tête AFM et amorcez la sonde sur l'échantillon. Focalisez le faisceau hélium-néon sur l'extrémité du levier d'imagerie.Si vous procédez ainsi, le faisceau est déplacé du centre du tube optique d'entrée. Répétez les étapes de réglage jusqu'à ce que le faisceau soit centré. Pour commencer les réglages finaux du miroir parabolique, remplacez le trou d'épingle de sortie par un diaphragme à l'emplacement focal du miroir paraboloïde, puis retirez la fenêtre en germanium et le détecteur infrarouge.N'oubliez pas de marquer la position du détecteur infrarouge. Fixez une lentille supplémentaire après le diaphragme à la distance focale approximative de la lentille. Le levier engagé doit maintenant être visible à travers la lentille.Réglez la position du miroir paraboloïde de manière à centrer l'extrémité de la pointe à travers l'iris fermé. Remarquez que lorsque le faisceau hélium-néon est correctement focalisé sur la pointe, un éclat lumineux apparaît entre la pointe et son reflet sur la surface de l'échantillon. Remettez en place la fenêtre en germanium et réglez-la pour permettre une observation visuelle pratique du levier.Remplacez l'iris par le diaphragme à trou d'épingle. N'oubliez pas que le trou d'épingle utilisé pour la détection infrarouge doit être décalé par rapport au centre en raison du déplacement du faisceau infrarouge par la fenêtre en germanium. Placez le détecteur infrarouge à la position précédemment marquée et dirigez le faisceau infrarouge afin qu'il se propage conjointement avec le faisceau visible utilisé pour le réglage.Nous sommes désormais prêts à examiner la procédure de réglage courante. Le dispositif est plus facile à aligner avec le faisceau visible d'hélium-néon qu'avec le faisceau infrarouge invisible. Le trajet du faisceau d'hélium-néon et celui du faisceau infrarouge se rejoignent au niveau du miroir orientable.Si ce miroir est incliné vers le bas, l'hélium-néon peut passer. Si le miroir est en position, l'infrarouge est dirigé vers le champ proche. Configuration pour l'alignement de l'un des faisceaux.Utilisez deux miroirs qui ne sont pas en commun avec l'autre trajet. Si vous observez le faisceau dans le bras homodyne, vous devriez voir un profil de faisceau en couronne. Le module a FM est désormais activé avec rétroaction de force pour un alignement précis à l'aide de la platine en champ proche.Déplacez l'objectif de microscope réfléchissant pour focaliser la lumière sur la pointe où elle est diffusée. Placez la fenêtre en germanium dans le cube optique. Après le miroir paraloïde, le faisceau est focalisé sur ce point par un miroir paraloïde.Déplacez la platine vers l’arrière ou vers l’avant jusqu’à ce que vous puissiez observer une image nette de la pointe et de son reflet sur la surface de l’échantillon à l’aide de la fenêtre en germanium. Regardez ensuite à travers la lunette, où vous pouvez voir le levier et la pointe sans le faisceau hélium-néon. Vous pouvez encore voir une lumière rouge, mais il s’agit d’une lumière interne provenant de la commande de distance du microscope à force atomique.Déplacez la platine vers la droite, la gauche et dans les directions haut et bas jusqu'à l'obtention d'un éclat rouge vif sur la pointe. Pour superposer le champ d'homodyne à la lumière diffusée, ouvrez d'abord le bras d'homodyne, puis regardez à travers l'oculaire.Vous verrez trois taches ou plus alignées avec une intensité décroissante. Déplacez le miroir dans le bras homo dyne de manière à ce que la deuxième tache se superpose à l'image de la pointe, là où la pointe et son reflet se rejoignent. Pour positionner le détecteur, retirez le miroir supplémentaire.Le faisceau hélium-néon ira désormais en direction du détecteur situé derrière le tube. Vous pouvez observer au moins deux taches en forme d'anneau. La deuxième tache en partant de la droite doit traverser le trou dans la feuille de protection thermique située devant le détecteur et atteindre l'élément sensible.La tache présentant l'intensité la plus élevée doit se situer au centre du trou une fois le réglage habituel terminé. Examinons l'alignement du faisceau infrarouge. Pour aligner le faisceau infrarouge, utilisez une ligne laser au monoxyde de carbone dont l'intensité est d'au moins 100 milliwatts.Cela facilitera l'alignement. Commencez par remplir le détecteur avec de l'azote liquide. Relevez le miroir monté sur un support basculant cinématique afin que le faisceau infrarouge soit dirigé vers le microscope.Placer un wattmètre derrière le premier diaphragme et ajuster le miroir situé avant le miroir monté sur un support orientable escamotable. Afin d'obtenir la puissance maximale, maintenir le wattmètre derrière le diaphragme le plus proche de la platine du champ proche et déplacer le miroir inclinable jusqu'à obtenir une puissance maximale. Au cours du processus d'alignement, répéter ces étapes plusieurs fois tout en surveillant le signal F1.Pour vérifier le signal F unique, réglez la référence du verrouillage dans l'amplificateur sur un f égal à la fréquence d'oscillation FM et passez à une taille de balayage Zs de trois mètres en mode de tracé de force. Si l'alignement est mauvais, vous verrez une bosse large à l'échelle de trois mètres. Pour corriger cela, vous devrez répéter continuellement les étapes précédentes jusqu'à ce que l'alignement s'améliore.Si vous avez un alignement moyen, la courbure de la première bosse semblera légèrement concave, bien que la seconde bosse soit plus grande que la première. Ici, vous pouvez essayer de corriger l'alignement en ajustant un ou les deux miroirs d'alignement. Si votre alignement est bon, vous verrez uniquement deux bosses et la première sera plus haute que la seconde.La courbure du côté droit de la première bosse sera négative. Une fois l'alignement correct obtenu, vous pouvez déplacer les miroirs pour augmenter le maximum de la première bosse. Le signal F unique doit se situer entre cinq et douze volts, bien que la forme de la première bosse soit plus critique.Enfin, passez à deux F et essayez d'améliorer légèrement le signal. En ajustant légèrement les miroirs pour modifier la phase, le signal de deux F devrait se situer entre 0,6 et deux volts. Topographie expérimentale et champ proche.Des images de 21 à 31 fibrilles peptidiques sont présentées. L'échelle supérieure indique la hauteur en nanomètres et l'échelle inférieure indique le contraste en champ proche. La tension en mode « lock-in » affichée ici correspond à une image de topographie recueillie simultanément avec l'image de champ proche obtenue à l'aide de 1 631 centimètres inverses de rayonnement. Une image de topographie recueillie simultanément avec l'image de champ proche obtenue à l'aide de 1 691 centimètres inverses.Le rayonnement est représenté. Les étiquettes indiquent des FIs spécifiques et servent à mettre en évidence le type de confirmation secondaire que chaque FI possède. Nous venons de vous montrer comment monter une ligne et utiliser une liste d'ouvertures sur un microscope infrarouge à balayage de champ proche.Souvenez-vous des étapes effectuées lors de l'alignement afin de pouvoir revenir en arrière si votre alignement est incorrect, et surtout, soyez patient. Voilà tout. Merci d'avoir regardé.Bonne chance avec vos expériences.

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