Name: Électrofilage treillis polymères fibreux pour lingénierie tissulaire et de la culture cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez l'électrofilage de polymères photoréactifs pour l'ingénierie tissulaire et la culture cellulaire. Cette méthode permet de créer des échafaudages fibrés mimant la matrice extracellulaire native.

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Ce travail a été soutenu par une bourse de l&#39;American Heart Association prédoctorale à JLI et les National Institutes of Health octroi R01AR056624.

A. seul polymère Électrofilage <ol><li> Avant de préparer la solution électrofilage, faire une solution à 0,5% en poids du photoamorceur, Irgacure 2959 (I2959), dans l&#39;eau déminéralisée en dissolvant à 37 ° C pendant plusieurs jours. Cette étape n&#39;est pas nécessaire si un polymère photoréactif n&#39;est pas utilisé. </li><li> Combinez méthacrylatée acide hyaluronique (Meha, voir Burdick et al. Pour la synthèse), le poly (oxyde d&#39;éthylène) (PEO, 900 kDa), et I2959 dans l&#39;eau désionisée pour préparer une solution avec une concentration finale de 2% en poids Meha, 3% en poids % en poids de PEO, et 0,05 I2959. Utilisez un vortex pour mélanger la solution jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit claire. Le type de polymère et de concentration, ainsi que le solvant utilisé peut être modifié à cette étape, selon les propriétés souhaitées échafaudage. </li><li> Transférer la solution dans une seringue et fixer une jauge de 18, 6 pouces de long, l&#39;aiguille extrémité émoussée à la fin. </li><li> Programme d&#39;une seringue pour éjecter à un taux de 1,2 ml / hr. Insérer la seringue et l&#39;aiguille dans le dispositif. </li><li> Fixez le fil à la terre d&#39;une source d&#39;alimentation haute tension de l&#39;appareil de collecte. Pour collecter les fibres aléatoirement distribués utiliser une plaque de métal plat, ou d&#39;utiliser un mandrin en rotation à ~ 10 m / s pour recueillir des fibres alignées. Fixez la tête chargée positivement à l&#39;aiguille. Voir Figure 1 pour un schéma de l&#39;appareil électrofilage. </li><li> Ajuster l&#39;aiguille ou d&#39;un dispositif de collecte, de telle sorte que il ya une distance de 15 cm entre les deux. </li><li> Démarrer le flux de la pompe à seringue. Lorsque le liquide est visualisée sur la pointe de l&#39;aiguille, tournez sur la source d&#39;alimentation et régler la tension à 22 kV. </li><li> Après la collection est complète (de quelques minutes pour les films minces, jusqu&#39;à 24 heures pour un matelas plus épais), enlever l&#39;échafaud de l&#39;appareil de collecte et de le stocker sous vide pendant une nuit pour assurer l&#39;élimination complète du solvant. </li><li> Visualisez la morphologie des fibres par microscopie électronique à balayage (MEB), un échafaudage représentatif est montré dans la figure 1 pour les deux structures alignées et non-alignés. </li></ol> Remarque: Le débit de l&#39;échantillon, la distance à l&#39;appareil de collecte, et la tension dépend de la combinaison de polymères et de solvants et doivent être optimisés pour chaque système, généralement par l&#39;observation de la morphologie échafaud avec SEM. Photoréticulation B. et Photopatterning <ol><li> Découpez 5mm X 5mm échantillons du tapis échafaud. </li><li> Préparez-vous à réticulation en plaçant chaque échafaudage sur une feuille couverte lame de verre, en plaçant le photomasque directement sur l&#39;échafaud, couvrant avec une lame de verre propre et écrêtage deux extrémités avec pinces pour reliure. Remarque: quatre échantillons qui peut être fait à la fois, et une transparence sans un motif peut être utilisé pour la réticulation si un motif n&#39;est pas souhaitée. </li><li> Purger échafaudage mis en place dans une chambre d&#39;azote. Il est important de garder le concept exempt d&#39;oxygène, qui peuvent inhiber la réticulation. </li><li> Placez échafaudage de configuration dans la chambre de l&#39;azote sous ~ 10 mW / cm 2 de lumière de 365 nm avec un adaptateur collimation pendant 5 minutes. Voir schéma de la figure 2. </li><li> Retirez chaque échafaudage et le placer dans une plaque 12 puits. </li><li> Ajouter 2 mL d&#39;eau déminéralisée dans chaque puits, la plaque de parafilm pour éviter l&#39;évaporation de l&#39;eau et placer à 37 ° C pendant 24 heures. Changez l&#39;eau trois fois. </li><li> Visualisez formation de pores au microscope optique (voir exemple en figure 2). Les échafaudages sont maintenant prêts à utiliser. </li></ol> Remarque: photoréticulation n&#39;est pas nécessaire pour de nombreux types de polymères, cependant photopatterning ne peut être utilisée avec des polymères photoréactifs. C. Double Polymer électrofilage avec fluorescent visualisation fibre <ol><li> Préparer une solution à 5% en poids de PEO (200 kDa) dans l&#39;éthanol à 90%. Incorporer à 700 rpm à 50 ° C pendant au moins 2 heures avant électrofilage. </li><li> Transférer la solution de PEO à une seringue et ajouter DAPI pour une concentration finale de 10 mg / mL dans la solution électrofilage. Enveloppez la seringue dans l&#39;aluminium pour le protéger de la lumière. </li><li> Préparer la même solution décrite dans l&#39;étape A2, à l&#39;exception également ajouter méthacryloxyéthyle thiocarbamoyle rhodamine B (MeRho, 683,24 g / mol) pour une concentration finale de 25 pM dans la solution électrofilage. Enveloppez la seringue dans l&#39;aluminium pour le protéger de la lumière. </li><li> Soigneusement utiliser du scotch pour sécuriser des lamelles en verre méthacrylatée (voir Khademhosseini et al.) À la surface du mandrin. Remarque: les fibres deviennent attachés à lamelles de verre méthacrylatée. </li><li> Fixez une extrémité d&#39;un morceau de 5 mm de long tube en silicone avec des pièces jointes luer lock à l&#39;un des seringues et attacher l&#39;autre extrémité à une aiguille. Insérer la seringue dans le pousse-seringue et mettre l&#39;aiguille à travers le trou dans le paysan. Répétez avec l&#39;autre seringue et paysan sur le site en face du mandrin. Les vanneurs traduire le longueur du mandrin et sont utilisés pour assurer une distribution égale des deux polymères résultant de la échafaud. Voir schéma de la figure 3. </li><li> Ajustez les paramètres décrits dans la Section A de façon appropriée conformément au Tableau 1. S&#39;assurer que les pointes d&#39;aiguille sont centrées sur le mandrin. Tableau 1. Double Polymer Paramètres Électrofilage <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Seringue </td><td> Paysan à la pointe de l&#39;aiguille (cm) </td><td> Pointe de l&#39;aiguille à mandrin (cm) </td><td> Débit (ml / h) </td><td> Tension appliquée (kV) </td></tr><tr><td> Meha </td><td> 6 </td><td> 15 </td><td> 1.2 </td><td> 22 </td></tr><tr><td> PEO </td><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 15 </td></tr></tbody></table> </li><li> Une fois que tout est correctement aligné, éteignez les lumières et tourner sur le mandrin et le pousse-seringues. Retirer le papier d&#39;aluminium à partir des seringues. Lorsque le liquide est visible sur la pointe des deux aiguilles, tournez simultanément sur les blocs d&#39;alimentation et branchez le vanneurs. </li><li> Lorsque la collecte est terminée, éteignez l&#39;alimentation et le mandrin et débranchez le vanneurs. Retirez délicatement les lamelles et le ruban à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir. </li><li> Visualisez les fibres en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres pour la rhodamine et DAPI. Voir l&#39;exemple en figure 3. Remarque: fibres fluorescentes sont les plus clairs pour voir où électrofilé pour de courtes périodes de temps (&lt;3 minutes), cependant, ce processus peut être prolongée pour une durée illimitée afin de créer des constructions plus épais, surtout sans l&#39;utilisation de l&#39;lamelles de verre . </li></ol> Cellules ensemencement D. sur les échafaudages <ol><li> Placez chaque lamelle avec électrofilé polymères attachés à un individu puits d&#39;une plaque de taille appropriée ainsi. Note: les interactions cellulaires avec les fibres sont facilement visibles par électrofilage sur des lamelles de verre méthacrylatée. En outre, MeRho peut à nouveau être utilisé pour la visualisation de la fibre. </li><li> Incuber les échafaudages en PBS nuit pour assurer une élimination complète du solvant et de toute lixiviables éventuels sous-produits. </li><li> Retirez le CPE dans les puits. </li><li> Pour stériliser les échafaudages, les placer sous une lampe germicide dans une hotte à flux laminaire pendant 30 minutes. Si une pleine échafaudage est ensemencé, flip sur l&#39;échafaud et placer sous une lampe germicide pour un autre 30 minutes. </li><li> Effectuer culture cellulaire standard et préparer une suspension cellulaire concentrée à la densité cellulaire désirée (par exemple, 6.000 cellules cm -2). Par exemple, utiliser 100 ml de suspension cellulaire pour une lamelle de 22 mm x 22 mm. Placer dans l&#39;incubateur pendant 1 heure. </li><li> Ajouter la quantité appropriée de milieux de culture cellulaire à chaque puits. Placez les échafaudages de nouveau dans l&#39;incubateur. </li><li> Colorer les cellules en utilisant un kit disponible dans le commerce Live / Dead. Remarque: d&#39;autres types de coloration des cellules, telles que le DAPI (noyaux cellulaires) et marqué par fluorescence phalloïdine (fibres de stress d&#39;actine) peut être appliqué à visualiser les cellules. </li><li> Visualisez les cellules et les fibres en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres pour TRITC et FITC. Voir l&#39;exemple à la figure 4. </li></ol> Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma illustrant la configuration du périphérique pour la formation d&#39;échafaudage non-alignés (en haut) et aligné échafaudage de formation (en bas). Exemple de numérisation d&#39;images en microscopie électronique de chaque type d&#39;échafaudage sont affichés. Barre d&#39;échelle = 5 um. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="Figure 2" /> Figure 2. Schéma de la méthode de structuration. Les motifs sont formés en plaçant un photomasque entre la source de lumière et d&#39;échafaudage lors de photoréticulation puis emportant polymère inaltéré. L&#39;image photomasque et SEM d&#39;échafaudages, après formation de pores et la lyophilisation. Barre d&#39;échelle = 100 pm. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="Figure 3" border="0" /> Figure 3 Schéma de la configuration multi-polymère et les paramètres électrofilage de traitement nécessaires, ainsi qu&#39;une image représentative fluorescente d&#39;un mélange de deux populations de fibres (par exemple: rouge et bleu Meha PEO). Qui ont été simultanément électrofilé pour former un échafaudage multi-polymère . Barre d&#39;échelle = 100 pm. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">cliquez ici</a> pour voir une plus grande version de la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="Figure 4" /> Figure 4. Un exemple d&#39;image coloration Live / Dead de cellules souches mésenchymateuses humaines et leurs interactions avec les fibres électrofilé. Barre d&#39;échelle = 100 pm. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 4.

<ol><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li>
<li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li>
<li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+on+the+Straight+and+Narrow%3A+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+B%22%5BJournal%5D)">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., Von Recum, H. avon <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Électrofilage a été utilisé pour préparer des échafaudages fibreux à partir de polymères. Photoréticulables échafaudages à base d&#39;acide hyaluronique ont été utilisés comme un exemple illustratif, où l&#39;exposition de lumière est nécessaire à la réticulation. Avec l&#39;utilisation de macromères réactives, telles que Meha, les canaux qui ont déjà démontré améliorée distribution cellulaire ont été incorporées dans les échafaudages avec l&#39;utilisation d&#39;un masque pendant photoréticulation pour former échafauda...

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td> Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>I2959</td><td>Réactif</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEO 200 kDa</td><td></td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17503</td><td></td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Méthacryloxéthyl thiocarbamoyl rhodamine B</td><td>Réactif</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>Préparer une solution mère dans le DMSO</td></tr><tr><td>Kit de coloration Viabilité/Apicose</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Contient de la calceine (colore les cellules vivantes en vert) et de l'éthidium homodimère (colore les cellules mortes en rouge)</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Équipement</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td>Deux sont nécessaires pour le filage dual de polymères</td></tr><tr><td>Source d'alimentation</td><td>Équipement</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES30P-5W</td><td>Deux sont nécessaires pour le filage dual de polymères</td></tr><tr><td>Moteur</td><td>Équipement</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Doit être fixé à un mandrin sur mesure</td></tr><tr><td>Tachymètre</td><td>Équipement</td><td>Network Tool Warehouse</td><td>ESI-330</td><td>Utiliser pour surveiller la vitesse du mandrin</td></tr><tr><td>Système de polymérisation UV Omnicure à faisceau focalisé avec adaptateur collimateur</td><td>Équipement</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Tuyau en silicone</td><td>Équipement</td><td>McMaster-Carr</td><td>51135K151</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur femelle Luer Lock</td><td>Équipement</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur mâle Luer Lock</td><td>Équipement</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles</td><td>Équipement</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Lames couvre-objets</td><td>Équipement</td><td>Corning</td><td>2875-22</td><td></td></tr></tbody></table>

Électrofilage treillis polymères fibreux pour l&#39;ingénierie tissulaire et de la culture cellulaire

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Comme le domaine de l&#39;ingénierie tissulaire évolue, il ya une demande énorme pour produire des matériaux plus adaptés et les techniques de transformation afin de répondre aux exigences (par exemple, la mécanique et la vascularisation) des organes plus complexes et les tissus. Électrofilage est une technique populaire pour créer des échafaudages fibreux qui imitent l&#39;architecture et de l&#39;échelle la taille de la matrice extracellulaire native. Ces échafaudages fibreux sont également utiles comme substrats de culture cellulaire, car les fibres peuvent être utilisés pour diriger le comportement cellulaire, y compris la différenciation des cellules souches (voir examens approfondis par des Mauck<em&gt; Et al.</em&gt; Et Sill<em&gt; Et al.</em&gt; Pour plus d&#39;informations). Dans cet article, nous décrivons le processus général de électrofilage de polymères et comme un exemple, un acide hyaluronique electrospin réactif capable de réticulation avec exposition à la lumière (voir Ifkovits<em&gt; Et al.</em&gt; Pour une revue sur les matériaux photoréticulables). Nous introduisons également des capacités de traitement supplémentaires telles que photopatterning et multi-formation de polymères échafaud. Photopatterning peut être utilisé pour créer des échafaudages avec des canaux et multi-échelle pour augmenter la porosité infiltration cellulaire et la distribution des tissus. Multi-polymère échafaudages sont utiles pour mieux ajuster les propriétés (mécanique et de la dégradation) d&#39;un échafaudage, y compris sur mesure porosité pour une infiltration cellulaire. En outre, ces techniques peuvent être étendues pour inclure un large éventail de polymères et de macromères réactive pour créer des échafaudages complexes qui fournissent les repères nécessaires pour le développement de constructions tissus succès d&#39;ingénierie.

Le processus de électrofilage de polymères pour l&#39;ingénierie tissulaire et de culture cellulaire est abordée dans cet article. Plus précisément, l&#39;électrofilage des macromères photoréactif avec des capacités de traitement supplémentaires de photopatterning et multi-polymère électrofilage est décrite.

À mesure que le domaine de l'ingénierie tissulaire évolue, il existe une demande considérable pour la production de matériaux et de techniques de traitement plus appropriés afin de répondre à...

Ce vidéo montre le filage électrostatique de polymères, une technique populaire en ingénierie tissulaire et en culture cellulaire permettant de créer des échafaudages fibreux qui imitent l'architecture et l'échelle dimensionnelle de la matrice extracellulaire native. Ici, nous réalisons le filage électrostatique d'un acide hyaluronique photoréactif capable de s'auto-croiser sous exposition à la lumière, et nous présentons d'autres applications de traitement telles que le photograinage, un procédé permettant de créer des canaux et des échafaudages avec une porosité à plusieurs échelles afin d'augmenter l'infiltration cellulaire et la distribution tissulaire. De plus, nous utilisons une formation d'échafaudage à base de plusieurs polymères, qui permet de filer électrostatiquement deux polymères différents dans un même tapis, offrant ainsi un ajustement des propriétés mécaniques et de la dégradation de l'échafaudage, ainsi qu'une personnalisation de la porosité pour favoriser l'infiltration cellulaire.Bonjour, je suis Jamie Kovi du laboratoire de Jason Burdick au Département de bioingénierie de l'Université de Pennsylvanie. Bonjour, je suis Harini Swin, également du laboratoire Burdick. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de fabrication de supports fibreux par électrofilage pour l'ingénierie tissulaire.Nous présenterons également les capacités supplémentaires de traitement que sont le dessin par photostructuration et la formation de supports multicouche à base de polymères. Nous utilisons ces procédés dans notre laboratoire pour étudier les interactions et les infiltrations des cellules HMSE dans des supports d'acide hyaluronique. Nous employons également ces techniques avec divers autres polymères afin d'étudier des tissus renforcés par fibres, tels que le ménisque et le myocarde.Commençons. Préparez une solution à 0,5 % en poids du photoinitiateur I 2 9 5 9 dans de l'eau déionisée en dissolvant à 37 degrés Celsius pendant plusieurs jours.Une lampe de polymérisation est utilisée lorsqu'un polymère photoréactif est nécessaire pour l'électrofilage. Pour préparer la solution d'électrofilage, combiner dans de l'eau déionisée des concentrations finales de 2 % en poids d'acide hyaluronique méthylé ou MEHA, 3 % en poids de polyoxyéthylène ou PEO, et 0,05 % en poids de la solution I 2 9 5 9 ; vortexer pendant cinq minutes, puis incuber à 37 degrés Celsius toute la nuit. Pour dissoudre la solution, transférer celle-ci dans une seringue et fixer à son extrémité une aiguille de calibre 18, longue de six pouces, à extrémité émoussée.Ensuite, utilisez une pompe à seringue réglée pour éjecter à un débit de 1,2 millilitre par heure. Insérez l'aiguille du moteur de seringue dans la pompe à seringue. Fixez le fil de masse d'une source d'alimentation haute tension à l'appareil de collecte.Dans cette procédure, nous utiliserons un mandrin tournant à environ 10 mètres par seconde. Pour recueillir des fibres alignées, fixez le fil chargé positivement à l'aiguille, puis réglez l'aiguille ou le dispositif de collecte de manière à obtenir une distance de 15 centimètres entre les deux. Démarrez le débit de la pompe à seringue et, lorsque le fluide est visible à l'extrémité de l'aiguille, allumez la source d'alimentation et réglez la tension à 22 kilovolts.Recueillir les fibres sur le support jusqu'à l'obtention de l'épaisseur souhaitée. Le temps de collecte dépend de l'épaisseur souhaitée et du volume de solution utilisée pour l'électrofilage. Pour le photomodèle, nous utilisons des nattes électrofilées obtenues après 16 heures de filage.Retirer la structure du dispositif de collecte une fois la collecte terminée et la conserver sous vide pendant toute une nuit afin d'éliminer complètement le solvant. Découper des échantillons de cinq millimètres sur cinq millimètres dans la nappe de structure à l’aide de ciseaux. Placer chaque structure sur une lame de verre recouverte de papier d’aluminium pour la préparer au réticulation, puis poser directement le masque photolithographique sur la structure, recouvrir d’une lame de verre propre et fixer les deux extrémités de la lame avec des pinces à levier.À l’aide d’une chambre à azote, purger le support pour inhiber la réduction du réticulage due à l’exposition à l’oxygène. Placer le dispositif de support dans la chambre à azote sous une lumière de 365 nanomètres à environ 10 milliwatts par centimètre carré, avec un adaptateur de collimation, pendant cinq minutes. Retirer chaque support et le placer dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits.Ajoutez deux millilitres d'eau déionisée dans chaque puits. Parafinez la plaque pour éviter l'aberration EVA de l'eau et placez-la à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Changez l'eau toutes les huit heures en utilisant une pipette à vide pour aspirer l'eau déionisée du puits entre les lavages.Préparez une solution poids/volume de 5 % de PEO dans 90 % d'éthanol sur un agitateur chauffant. Agitez à 700 tr/min à 50 degrés Celsius pendant au moins deux heures avant la procédure. Après agitation, ajoutez du DPI pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre.Transférez la solution de PEO et de DPI dans une seringue de trois millilitres et enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière. Ensuite, préparez la solution d’électrofilage décrite dans la deuxième section et ajoutez du biocarbonate de méthoxyéthyle, domaine B, pour obtenir une concentration finale de 25 micromolaire. Prélevez la solution à l’aide d’une micropipette et transférez-la dans une seringue de trois millilitres. Enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.Utilisez soigneusement du ruban adhésif transparent pour fixer les bords de lamelles en verre méthylées de 22 millimètres sur 22 millimètres à la surface du mandrin, de sorte que les lamelles s'ajustent autour de la circonférence du mandrin. À l'aide d'un morceau de tube en silicone de cinq millimètres de long, reliez une extrémité à une des seringues équipées d'embouts à verrouillage. Fixez l'autre extrémité à une aiguille, insérez la seringue dans la pompe à seringue et faites passer l'aiguille à travers le trou dans le ventilateur.Les écarteurs traduisent la longueur du mandrin et servent à assurer une distribution égale des deux polymères dans le support obtenu. Veillez à ce que les extrémités des aiguilles soient centrées sur le mandrin pour la seringue contenant MEHA. Placez l'extrémité de l'aiguille à 15 centimètres du mandrin et réglez l'écarteur à une distance de six centimètres de l'extrémité de l'aiguille.Programmez la pompe à seringue pour délivrer 1,2 millilitre par heure et réglez la source d'alimentation à 22 kilovolts. Installez le seringue contenant le PEO exactement de la même manière, mais placez la pointe de l'aiguille à 10 centimètres du mandrin et réglez la source d'alimentation à 15 kilovolts. Ensuite, éteignez les lumières et allumez le mandrin ainsi que les pompes à seringue.Retirez la feuille d'aluminium des seringues lorsque le liquide est visible au bout des deux aiguilles. Allumez simultanément les alimentations et branchez les ventilateurs lorsque la collecte est terminée. Éteignez soigneusement les alimentations et le mandrin, puis débranchez les ventilateurs.Retirez les lamelles et le ruban adhésif à l’aide d’un scalpel. Les fibres peuvent être visualisées au microscope à fluorescence équipé de filtres pour la rhumine et le dpi. Placez chaque lamelle avec le polymère électro-spongreux fixé dans un puits individuel d’une plaque de six.Plaque de culture Incuber les échafaudages dans deux millilitres de PBS pendant toute la nuit pour assurer l'élimination complète du solvant et des contaminants. Après 24 heures, utiliser le vide pour aspirer le PBS de la plaque. Placer les échafaudages sous une lampe UV germicide dans une hotte à flux laminaire pendant 30 minutes. Pour la stérilisation, effectuer une culture cellulaire standard et préparer une suspension cellulaire concentrée à la densité cellulaire souhaitée.Par exemple, utilisez 100 millilitres de suspension cellulaire pour un couvre-objet de 22 par 22 millimètres. Incubez pendant une heure. Ajoutez la quantité appropriée de milieu de culture cellulaire à chacun.Remettez soigneusement les échafaudages dans l'incubateur. Colorer les cellules à l'aide d'un kit vivant-mort disponible dans le commerce fourni par Invitrogen afin de visualiser les cellules et les fibres à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé de filtres pour trissy et fitzy, comme prévu pour les échafaudages recueillis sur une plaque plane mise à la terre. Produire des fibres distribuées aléatoirement tandis que les échafaudages sont recueillis sur un mandrin rotatif.Produire des fibres alignées observables par microscopie électronique à balayage lors de la réticulation photochimique du support : nous plaçons un masque photo entre le support et la source lumineuse après immersion du support dans de l'eau déionisée contenant du ha non réactif. Les zones protégées de la lumière et du PEO sont éliminées, et nous observons la formation de macropores, comme en témoigne la coloration au colorant fluorescent. La électrofilature simultanée des jets de MEHA et de PEO donne un support composite contenant des populations de fibres distinctes constituées des polymères individuels.Les CSM semblent interagir positivement avec les fibres. Non seulement elles restent viables, comme le montre la coloration verte, mais elles semblent également s'orienter de manière à s'aligner le long des fibres rouges. Nous venons de vous montrer comment élaborer par électrofilage des échafaudages fibreux pour l'ingénierie tissulaire.Nous avons également introduit des fonctionnalités supplémentaires telles que le façonnage par lumière et l’électrofilage multi-polymère. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser les paramètres d’électrofilage de chaque polymère afin d’obtenir des fibres uniformes avant d’entreprendre toute autre expérience. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Biologie

Alignés fibres électrofilées diriger la croissance des neurones in vitro et sont un élément potentiel de régénération nerveuse échafaudages. Nous décrivons une procédure pour la préparation des substrats de fibres électrofilé et la culture sans sérum de rat E15 sensorielles primaires (DRG) et les neurones moteurs. Visualisation des neurones par immunocytochimie est également inclus.

La culture de moteur primaire et neurones sensoriels de médias définis sur les échafaudages électrofilées poly-L-lactide nanofibres

Échafaudages électrofilées peuvent être traitées de post-production pour les applications d'ingénierie tissulaire. Nous décrivons ici les méthodes de filature échafaudages complexes (par filage consécutives), pour faire plus épais échafaudages (par le multi-couches en utilisant la chaleur ou de vapeur recuit), pour atteindre la stérilité (production aseptique ou la stérilisation post-production) et pour la réalisation appropriées des propriétés biomécaniques.

Traitement post-production des fibres électrofilées de génie tissulaire

PH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel peuvent être incorporés dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées. Les échafaudages d'auto-déclaration produits peuvent être utilisés pour la surveillance in situ des conditions micro-environnementales dans tout la culture de cellules sur l'échafaud. Cela est bénéfique que la construction cellulaire 3D peut être contrôlé en temps réel sans perturber l'expérience.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Ce protocole combine l’électrofilage et les microsphères pour développer des échafaudages issus de l’ingénierie tissulaire afin de diriger les neurones. Le facteur de croissance nerveuse a été encapsulé dans des microsphères PLGA et électrofilé dans des échafaudages fibreux d’acide hyaluronique (AH).  La bioactivité des protéines a été testée en ensemencant les échafaudages avec des ganglions de la racine dorsale primaires du poussin et en cultivant pendant 4 à 6 jours.

Électrofilage facteur de croissance libération de microsphères en fibre échafaudages

Synthèse et la fabrication de fibres longues électrofilé couvrant une zone de plus grand dépôt par un collecteur nouvellement conçu à partir d'un polymère biodégradable roman nommé poly (glycérol-dodécanoate) (PGD) a été signalé. Les fibres sont capables de soutenir la croissance de cellules dérivées de cellules souches pluripotentes de souris.

Électrofilé Fort échafaudages de poly (glycérol-dodécanedioate) pour l&#39;ingénierie des tissus neuronaux De Souris cellules souches embryonnaires

Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer des échafaudages électrofilé de nanofibres avec l'organisation graduée de fibres et d'explorer leurs applications dans la régulation de la morphologie des cellules / orientation. Dégradés en ce qui concerne les propriétés physiques et chimiques des échafaudages de nanofibres offrent une grande variété d'applications dans le domaine biomédical.

Électrofilées nanofibres échafaudages avec des gradations dans l&#39;organisation fibre

Les progrès des technologies des biomatériaux permettent le développement de constructions tridimensionnelles de type multicellulaire. Nous avons développé des protocoles d’électrofilage pour produire trois échafaudages individuels afin de cultiver les principales cellules structurelles des voies respiratoires afin de fournir un modèle 3D in vitro de la paroi bronchiole des voies respiratoires.

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle du mur Airway

Ce protocole sert de guide complet pour fabriquer par électrofilage avec polymère se fond dans un mode d’écriture directe. Systématiquement, nous décrire le processus et définir les paramètres appropriés pour la réalisation d’architectures ciblées échafaudage.

Faire fondre électrofilage écrit d’échafaudages Poly(ε-caprolactone) en trois dimensions avec des Morphologies contrôlables pour les Applications de génie tissulaire

Cet article illustre la technique d’élargir une natte de nanofibres électrofilées (2D) traditionnel, de deux-dimension en échafaudage tridimensionnels (3D) par le biais de la dépressurisation du sous-critique CO2 fluide. Ces échafaudages augmentés sont en 3D, indices étroitement mimiques nanotopographic cellulaires et préserver les fonctions des molécules biologiques encapsulés dans les nanofibres.

Expansion de nanofibres Électrofilées dimension deux nattes en trois dimensions les échafaudages

Approches expérimentales pour le génie tissulaire

Découvrez l'électrofilage de polymères photoréactifs pour l'ingénierie tissulaire et la culture cellulaire. Cette méthode permet de créer des échafaudages fibrés mimant la matrice extracellulaire native.

Électrofilage treillis polymères fibreux pour l'ingénierie tissulaire et de la culture cellulaire

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