Électrofilage treillis polymères fibreux pour l'ingénierie tissulaire et de la culture cellulaire

Ce vidéo montre le filage électrostatique de polymères, une technique populaire en ingénierie tissulaire et en culture cellulaire permettant de créer des échafaudages fibreux qui imitent l'architecture et l'échelle dimensionnelle de la matrice extracellulaire native. Ici, nous réalisons le filage électrostatique d'un acide hyaluronique photoréactif capable de s'auto-croiser sous exposition à la lumière, et nous présentons d'autres applications de traitement telles que le photograinage, un procédé permettant de créer des canaux et des échafaudages avec une porosité à plusieurs échelles afin d'augmenter l'infiltration cellulaire et la distribution tissulaire. De plus, nous utilisons une formation d'échafaudage à base de plusieurs polymères, qui permet de filer électrostatiquement deux polymères différents dans un même tapis, offrant ainsi un ajustement des propriétés mécaniques et de la dégradation de l'échafaudage, ainsi qu'une personnalisation de la porosité pour favoriser l'infiltration cellulaire.

Bonjour, je suis Jamie Kovi du laboratoire de Jason Burdick au Département de bioingénierie de l'Université de Pennsylvanie. Bonjour, je suis Harini Swin, également du laboratoire Burdick. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de fabrication de supports fibreux par électrofilage pour l'ingénierie tissulaire.

Nous présenterons également les capacités supplémentaires de traitement que sont le dessin par photostructuration et la formation de supports multicouche à base de polymères. Nous utilisons ces procédés dans notre laboratoire pour étudier les interactions et les infiltrations des cellules HMSE dans des supports d'acide hyaluronique. Nous employons également ces techniques avec divers autres polymères afin d'étudier des tissus renforcés par fibres, tels que le ménisque et le myocarde.

Commençons. Préparez une solution à 0,5 % en poids du photoinitiateur I 2 9 5 9 dans de l'eau déionisée en dissolvant à 37 degrés Celsius pendant plusieurs jours.

Une lampe de polymérisation est utilisée lorsqu'un polymère photoréactif est nécessaire pour l'électrofilage. Pour préparer la solution d'électrofilage, combiner dans de l'eau déionisée des concentrations finales de 2 % en poids d'acide hyaluronique méthylé ou MEHA, 3 % en poids de polyoxyéthylène ou PEO, et 0,05 % en poids de la solution I 2 9 5 9 ; vortexer pendant cinq minutes, puis incuber à 37 degrés Celsius toute la nuit. Pour dissoudre la solution, transférer celle-ci dans une seringue et fixer à son extrémité une aiguille de calibre 18, longue de six pouces, à extrémité émoussée.

Ensuite, utilisez une pompe à seringue réglée pour éjecter à un débit de 1,2 millilitre par heure. Insérez l'aiguille du moteur de seringue dans la pompe à seringue. Fixez le fil de masse d'une source d'alimentation haute tension à l'appareil de collecte.

Dans cette procédure, nous utiliserons un mandrin tournant à environ 10 mètres par seconde. Pour recueillir des fibres alignées, fixez le fil chargé positivement à l'aiguille, puis réglez l'aiguille ou le dispositif de collecte de manière à obtenir une distance de 15 centimètres entre les deux. Démarrez le débit de la pompe à seringue et, lorsque le fluide est visible à l'extrémité de l'aiguille, allumez la source d'alimentation et réglez la tension à 22 kilovolts.

Recueillir les fibres sur le support jusqu'à l'obtention de l'épaisseur souhaitée. Le temps de collecte dépend de l'épaisseur souhaitée et du volume de solution utilisée pour l'électrofilage. Pour le photomodèle, nous utilisons des nattes électrofilées obtenues après 16 heures de filage.

Retirer la structure du dispositif de collecte une fois la collecte terminée et la conserver sous vide pendant toute une nuit afin d'éliminer complètement le solvant. Découper des échantillons de cinq millimètres sur cinq millimètres dans la nappe de structure à l’aide de ciseaux. Placer chaque structure sur une lame de verre recouverte de papier d’aluminium pour la préparer au réticulation, puis poser directement le masque photolithographique sur la structure, recouvrir d’une lame de verre propre et fixer les deux extrémités de la lame avec des pinces à levier.

À l’aide d’une chambre à azote, purger le support pour inhiber la réduction du réticulage due à l’exposition à l’oxygène. Placer le dispositif de support dans la chambre à azote sous une lumière de 365 nanomètres à environ 10 milliwatts par centimètre carré, avec un adaptateur de collimation, pendant cinq minutes. Retirer chaque support et le placer dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits.

Ajoutez deux millilitres d'eau déionisée dans chaque puits. Parafinez la plaque pour éviter l'aberration EVA de l'eau et placez-la à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Changez l'eau toutes les huit heures en utilisant une pipette à vide pour aspirer l'eau déionisée du puits entre les lavages.

Préparez une solution poids/volume de 5 % de PEO dans 90 % d'éthanol sur un agitateur chauffant. Agitez à 700 tr/min à 50 degrés Celsius pendant au moins deux heures avant la procédure. Après agitation, ajoutez du DPI pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre.

Transférez la solution de PEO et de DPI dans une seringue de trois millilitres et enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière. Ensuite, préparez la solution d’électrofilage décrite dans la deuxième section et ajoutez du biocarbonate de méthoxyéthyle, domaine B, pour obtenir une concentration finale de 25 micromolaire. Prélevez la solution à l’aide d’une micropipette et transférez-la dans une seringue de trois millilitres. Enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.

Utilisez soigneusement du ruban adhésif transparent pour fixer les bords de lamelles en verre méthylées de 22 millimètres sur 22 millimètres à la surface du mandrin, de sorte que les lamelles s'ajustent autour de la circonférence du mandrin. À l'aide d'un morceau de tube en silicone de cinq millimètres de long, reliez une extrémité à une des seringues équipées d'embouts à verrouillage. Fixez l'autre extrémité à une aiguille, insérez la seringue dans la pompe à seringue et faites passer l'aiguille à travers le trou dans le ventilateur.

Les écarteurs traduisent la longueur du mandrin et servent à assurer une distribution égale des deux polymères dans le support obtenu. Veillez à ce que les extrémités des aiguilles soient centrées sur le mandrin pour la seringue contenant MEHA. Placez l'extrémité de l'aiguille à 15 centimètres du mandrin et réglez l'écarteur à une distance de six centimètres de l'extrémité de l'aiguille.

Programmez la pompe à seringue pour délivrer 1,2 millilitre par heure et réglez la source d'alimentation à 22 kilovolts. Installez le seringue contenant le PEO exactement de la même manière, mais placez la pointe de l'aiguille à 10 centimètres du mandrin et réglez la source d'alimentation à 15 kilovolts. Ensuite, éteignez les lumières et allumez le mandrin ainsi que les pompes à seringue.

Retirez la feuille d'aluminium des seringues lorsque le liquide est visible au bout des deux aiguilles. Allumez simultanément les alimentations et branchez les ventilateurs lorsque la collecte est terminée. Éteignez soigneusement les alimentations et le mandrin, puis débranchez les ventilateurs.

Retirez les lamelles et le ruban adhésif à l’aide d’un scalpel. Les fibres peuvent être visualisées au microscope à fluorescence équipé de filtres pour la rhumine et le dpi. Placez chaque lamelle avec le polymère électro-spongreux fixé dans un puits individuel d’une plaque de six.

Plaque de culture Incuber les échafaudages dans deux millilitres de PBS pendant toute la nuit pour assurer l'élimination complète du solvant et des contaminants. Après 24 heures, utiliser le vide pour aspirer le PBS de la plaque. Placer les échafaudages sous une lampe UV germicide dans une hotte à flux laminaire pendant 30 minutes. Pour la stérilisation, effectuer une culture cellulaire standard et préparer une suspension cellulaire concentrée à la densité cellulaire souhaitée.

Par exemple, utilisez 100 millilitres de suspension cellulaire pour un couvre-objet de 22 par 22 millimètres. Incubez pendant une heure. Ajoutez la quantité appropriée de milieu de culture cellulaire à chacun.

Remettez soigneusement les échafaudages dans l'incubateur. Colorer les cellules à l'aide d'un kit vivant-mort disponible dans le commerce fourni par Invitrogen afin de visualiser les cellules et les fibres à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé de filtres pour trissy et fitzy, comme prévu pour les échafaudages recueillis sur une plaque plane mise à la terre. Produire des fibres distribuées aléatoirement tandis que les échafaudages sont recueillis sur un mandrin rotatif.

Produire des fibres alignées observables par microscopie électronique à balayage lors de la réticulation photochimique du support : nous plaçons un masque photo entre le support et la source lumineuse après immersion du support dans de l'eau déionisée contenant du ha non réactif. Les zones protégées de la lumière et du PEO sont éliminées, et nous observons la formation de macropores, comme en témoigne la coloration au colorant fluorescent. La électrofilature simultanée des jets de MEHA et de PEO donne un support composite contenant des populations de fibres distinctes constituées des polymères individuels.

Les CSM semblent interagir positivement avec les fibres. Non seulement elles restent viables, comme le montre la coloration verte, mais elles semblent également s'orienter de manière à s'aligner le long des fibres rouges. Nous venons de vous montrer comment élaborer par électrofilage des échafaudages fibreux pour l'ingénierie tissulaire.

Nous avons également introduit des fonctionnalités supplémentaires telles que le façonnage par lumière et l’électrofilage multi-polymère. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser les paramètres d’électrofilage de chaque polymère afin d’obtenir des fibres uniformes avant d’entreprendre toute autre expérience. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.