Name: Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Apprenez à isoler et purifier des neurones périphériques de Drosophila par tri magnétique à billes. Cette méthode rapide permet d'obtenir des populations neuronales hautement purifiées pour analyses moléculaires.

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Nous remercions les Drs. Yuh-Nung Jan et Wes Grueber pour fournir des stocks volantes utilisées dans cette étude. Les auteurs remercient F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust pour le soutien de cette recherche (DNC) et le Bureau du l&#39;Université George Mason Provost (EPRI).

Commentaires généraux sur le tri des billes magnétiques neurones périphériques drosophile (Timing Total pour l&#39;achèvement du Protocole: 2.5-3 heures) Procédures de laboratoire standard pour maintenir un environnement propre, RNAse environnement libre doivent être respectées en tout temps pour prévenir la dégradation de l&#39;ARN. Lorsque la cuticule des larves de drosophile est disséqué et placé dans le buffer dissociation cellulaire, les neurones périphériques sont l&#39;une des dernières cellules de se détacher de la cuticule. Nous avons exploité cette propriété et conçu ce protocole pour éliminer la plupart des cellules non spécifiques de la cuticule comme le muscle et la graisse avant l&#39;isolation des neurones DA. Avec la pratique, le protocole de l&#39;ensemble peut être complété avec succès au sein d&#39;environ 2,5 heures. La préparation des billes revêtues d&#39;anticorps doit être rempli avant l&#39;expérience commence. 1. Préparation des billes magnétiques pour les piles à reliure: Cette étape doit être terminée avant le début de l&#39;expérience. Les billes préparées peuvent être préparés et conservés à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. <ol><li> Lavez 100 ul de billes streptavidine Dynabeads M-280 recouvert de trois fois en PBS en le remettant en suspension dans 500 ul de PBS frais et de granulation dans un champ magnétique fort à chaque fois. </li><li> Enfin remettre en suspension les perles directement dans 100 ul d&#39;anticorps biotinylé dilué rat anti-souris-CD8a (concentration d&#39;anticorps est de 100 pg / ml). </li><li> Incuber le mélange pendant 1 heure sur la glace avec des vortex légers occasionnels à empêcher la sédimentation. [1 pl de Dynabeads M-280 peuvent se lier de 0.05 à 0,10 pg d&#39;anticorps biotinylé]. </li><li> Laver le mélange billes-anticorps à trois reprises comme décrit dans l&#39;étape 1.1 de supprimer les excès d&#39;anticorps. Les billes magnétiques sont maintenant recouverts d&#39;anticorps et prêt à être utilisé. Stocker le mélange de perles d&#39;anticorps dans 100 ul de PBS 1X à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Sélection et laver Larves: (10-15 minutes) <ol><li> Choisissez appariés pour l&#39;âge de 30 à 50 larves troisième stade et les placer dans un tube de 1,6 ml avec 1 à 1,2 microcentrifugeuse ml de phosphate 1X saline tamponnée (PBS). (3-5 minutes) </li><li> Fermer le tube et le vortex au réglage maximum trois fois pendant 1 seconde chacun. </li><li> Utiliser un feu poli pipette Pasteur jeter le surnageant complètement. Répéter le lavage (2,1) et le vortex (2,2) étapes 3-4 fois jusqu&#39;à ce que le surnageant est visiblement claire de toutes les particules de nourriture et de débris. </li><li> Brièvement répéter le lavage avec 1 ml d&#39;éthanol à 70% et jeter le surnageant. </li><li> Laver les larves à deux reprises avec 1 ml de ddH2O et jeter le surnageant. </li><li> Brièvement répéter les laver une fois avec 1 ml de RNase-AWAY et jeter le surnageant. </li><li> Laver les larves à trois reprises dans 1 ml de ddH2O pour assurer l&#39;élimination complète de RNase AWAY. </li></ol> 3. Dissection: (10-12 minutes) <ol><li> Placez 10-12 larves sur le centre d&#39;une plaque recouverte Sylgard 35mm de Pétri. Placez-les légèrement à l&#39;écart les uns des autres. [Etape critique: Jeter les larves qui ne semblent pas être au stade approprié de développement] </li><li> Coupez l&#39;extrémité antérieure de la larve à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux de dissection fine pour toutes les larves. </li><li> En utilisant une paire de ternes Dumont n ° 5 pinces à inverser la larve à l&#39;envers. Insérez une pince à l&#39;intérieur de la cuticule des larves tout le chemin à l&#39;extrémité postérieure. Pincez le bout de la pince ensemble pour attraper l&#39;extrémité postérieure de la cuticule (figure 1a) (essayez d&#39;appuyer sur la cuticule sur la surface Sylgard pour le rendre plus facile). Utilisation de la deuxième paire de pinces, poussez la cuticule des larves intérieur. [Etape critique: Essayez de pratiquer cette méthode à quelques reprises avant de tenter l&#39;expérience d&#39;isolement cellulaire. Essayez d&#39;obtenir les larves complètement renversé, pour s&#39;assurer que tous les tissus mous sont exposées à la solution pour faciliter la dissociation.] </li><li> Après dissection des larves 3-4, les transférer immédiatement à frais, PBS glacé (placer le tube sur la glace) dans un tube à centrifuger 1,6 ml. </li><li> Répétez les étapes 3.1 à 3.4 jusqu&#39;à ce que toutes les larves exigées sont recueillies (30-40 larves de ce protocole). [Etape critique:. Anticiper 10-20% de perte lors de la dissection et la dissociation, et planifier en conséquence] </li></ol> 4. Retrait de faiblement adhérentes non spécifiques des cellules: (2-3 minutes) [Cette étape aides de compensation des faiblement adhérentes non spécifiques des tissus tels que les corps gras et du SNC.] <ol><li> Prenez le tube de microcentrifugation 1,6 ml contenant les cuticules larvaires inversé et remplacer le surnageant avec environ 700 à 800 l de frais PBS glacé. </li><li> Pulse-vortex du tube de centrifugeuse 5 fois (3 secondes par impulsion) à pleine vitesse. </li><li> Jeter le surnageant et le remplacer par quelque 700 à 800 ul frais, PBS glacé. </li><li> Répétez les étapes 4.2 et 4.3 à trois reprises. </li><li> Resuspend les cuticules des larves dans 400 ul de frais, PBS glacé </li></ol> 5. Dissociation du tissu dans une suspension cellulaire unique: (18-20 minutes) [Etape critique: Plus-dissociation peut entraîner la perte du marqueur de surface cellulaire menant à rendement cellulaire pauvres et la viabilité cellulaire faible. Le tissu larvaire peut être dissociée ni par dissociation mécanique (sonication, douncing), dissociation enzymatique (trypsine, la collagénase etc) ou une combinaison des deux. Comme ces tissus larvaires sont difficiles à dissocier, nous avons constaté que la combinaison des deux mécaniques et dissociation enzymatique donné les meilleurs résultats.] <ol><li> Ajouter 1,5 l de Libérase 1X Blendzyme 3 (28 W unités nsch / flacon) à la cuticule des larves en suspension dans 400 ul de PBS. </li><li> Vortex la solution 2-3 fois pendant 1 seconde au réglage maximum (Cela devrait éliminer les cellules faiblement adhérentes de la cuticule dans la solution). </li><li> Incuber la solution à température ambiante (22-25 ° C) pendant 5 minutes. [Etape critique: temps d&#39;incubation affecte grandement l&#39;efficacité de cellules finales de tri. Le temps d&#39;incubation recommandée devrait être suffisante pour desserrer le tissu. Ne pas dépasser 15 minutes.] </li><li> Pulse-vortex le tube 20-30 fois au maximum de paramètres pour 2 secondes par impulsion à pleine vitesse. Cela devrait libère les muscles et autres tissus dans la solution. Inspectez un petit échantillon de la solution sous une lampe fluorescente stéréomicroscope à chaque étape. (Avec l&#39;expérience on devrait être capable de déterminer le niveau de dissociation en observant le tube de micro directement sous une fluorescence activée stéréomicroscope) </li><li> Lavez les cuticules larvaires 2-3 fois avec frais, PBS glacé et enfin de les remettre en suspension dans 500 ul de frais, PBS glacé contenant 1% de BSA. </li><li> Pour éviter la cuticule des larves coller à la surface de verre de la broyeur de tissus Kontes 2 ml et un pilon grand dégagement, pré-enduire le broyeur de tissus et d&#39;un pilon avec un BSA à 1% dans une solution PBS et après un bref rinçage jeter la solution de BSA. Par la suite, à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur polie au feu, transférer les cuticules à l&#39;étape 5.5 de la BSA broyeur de tissus enduits. [Etape critique: Pré-refroidir le broyeur de tissus / pilon en le plaçant sur ​​la glace pendant quelques minutes afin de prévenir les dommages cellulaires / lyse]. </li><li> Dounce le tissu avec des coups lente et régulière, en évitant moussage (environ 20-30 coups). [Etape critique:. Dounce lentement et régulièrement, sinon les cellules peuvent lyser] </li><li> Pour évaluer les niveaux de dissociation cellulaire, essuyez la paroi extérieure du broyeur de tissus avec un tissu Kimwipe propre, et l&#39;inspecter sous une lampe fluorescente stéréomicroscope. Les neurones doivent avoir détaché de la cuticule, et peut être vu dans la solution. Si cela s&#39;avère difficile, sinon la pipette sur un petit échantillon de la solution, et l&#39;observer sous une lampe fluorescente stéréomicroscope. Une bonne indication de la dissociation cellulaire est l&#39;absence de neurones à partir de la cuticule larvaire. Toutefois, si l&#39;on observe encore des neurones attaché à la cuticule, ou observe des cellules incomplètement dissocié, Dounce encore jusqu&#39;à ce que la cellules obtenir une suspension cellulaire unique. </li><li> Triturer la solution 5 fois avec une pipette Pasteur polie au feu réduit à environ 50% du diamètre de la pointe standard, suivie par 10 fois avec une pipette Pasteur polie au feu réduit à environ 25% du diamètre de la pointe standard. [Etape critique: la trituration énergique peut endommager les cellules. Surveiller les cellules entre les étapes, et d&#39;ajuster la procédure en conséquence]. </li><li> Filtrer la solution à travers un filtre 30 um cellulaire et recueillir le filtrat de cellules dans un tube à centrifuger 1,6 ml. La solution obtenue doit consister en une suspension cellulaire unique et est maintenant prêt pour le tri magnétique de cellules. </li></ol> 6. Magnétique tri cellulaire perle: (45 - 75 minutes, dépendant de la durée d&#39;incubation d&#39;anticorps) <ol><li> Ajouter 15 ul de billes magnétiques recouvertes d&#39;anticorps à 500 pl de suspension cellulaire (étape 5.10). Les autres anticorps conjugués billes magnétiques peuvent être stockées jusqu&#39;à ce que nécessaire pour les isolements cellulaires ultérieures. </li><li> Incuber les cellules avec des billes magnétiques recouvertes d&#39;anticorps pendant 30-60 minutes sur la glace avec parfois la main de mélange. [Etape critique: Incubation à une température plus élevée ou plus de temps peut entraîner la liaison d&#39;anticorps non spécifiques.] </li><li> Placez le tube de centrifugeuse dans un fort champ magnétique pendant 2 minutes. Toutes les cellules sélectionnés positivement le long avec des perles non liée seront séparés sur le côté du tube. </li><li> Lentement la pipette le surnageant en veillant à ne pas perturber le culot cellulaire. </li><li> Laver les cellules 3-4 fois en eau douce, PBS glacé pour enlever tout reste non spécifique des cellules. </li><li> Resuspendre les cellules dans 30 ul de frais, PBS glacé. </li><li> Pour estimer la pureté et le rendement des cellules, des pipettes de 5 pl de la cellule de suspension sur la surface polie d&#39;un hémocytomètre et compter toutes les cellules visibles fluorescentes sous une lampe fluorescente stéréomicroscope. Vérifiez également la quantité de cellules non fluorescentes et de tout signe d&#39;impuretés. Typiquement, l&#39;échantillon sera hautement enrichi pour les cellules fluorescentes. </li></ol> 7. Isolement d&#39;ARN à partir de billes magnétiques cellules triées: (60 - 75 minutes) <ol><li> Après le dépouillement, un culot cellulaire dans un champ magnétique, éliminer le surnageant et ajouter 20 ul de tampon d&#39;extraction de l&#39;ARN PicoPure ™ Kit d&#39;isolation (Molecular Devices). Selon le nombre de cellules on peut avoir besoin d&#39;ajouter un volume plus élevé de tampon d&#39;extraction. </li><li> Vortexer le tube à la vitesse maximale pour permettre le mélange de culot cellulaire avec un tampon d&#39;extraction. </li><li> Incuber le tube à 42 ° C pendant 30 minutes. </li><li> Pour assurer l&#39;enlèvement des billes magnétiques avant purification sur colonne de l&#39;ARN (voir étape 7.5), le tube est centrifugé à 2000 brièvement (x) g pendant 2 minutes pour sédimenter les billes magnétiques. Le tube est ensuite placé dans un champ magnétique fort pour conserver le culot et le surnageant est transféré à un tube de centrifugeuse nouvelle. </li><li> Extraire et purifier la colonne de l&#39;ARN conformément aux instructions du fabricant de kit d&#39;extraction d&#39;ARN PicoPure est. Traitement à la DNase est facultative et peut être effectuée sur une colonne lors de la purification d&#39;ARN selon l&#39;exigence d&#39;analyse. Enfin, éluer l&#39;ARN lié au total dans un petit volume (11-30 pi) de tampon d&#39;élution et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Si vous le souhaitez une aliquote de 1 ul peuvent être utilisés pour évaluer la qualité totale ARN sur un bioanalyseur 2100 (Agilent Technologies, Inc.) </li></ol> Les résultats représentatifs: Magnétique de tri perle a été utilisée pour isoler des drosophile da neurones (figure 1). Les ARN purifiés à partir de ces neurones isolés da (figure 2a) a été jugée d&#39;excellente qualité, comme indiqué par la présence de 5.8S forte, 18S et 28S du ribosome pics ARN lorsqu&#39;il est analysé sur une bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc) ( Figure 2b). Début avec 30-40 larves du troisième que nous étions capables d&#39;isoler, en moyenne 300 à 500 neurones da classe IV en utilisant le pilote PPK-GAL4, et 1500-2000 neurones DA (classe I, II, III et IV) en utilisant le pan- da spécifique des neurones GAL4 21-7 conducteur. Pour évaluer l&#39;enrichissement neuronaux spécifiques de nos cellules isolées nous avons effectué quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) en utilisant deux gènes spécifiques neuronaux marqueurs (elav et futsch). Ces analyses ont révélé un enrichissement significatif pli de gènes marqueurs indiquant à la fois un enrichissement très spécifiques pour les neurones da par rapport à circuler à travers l&#39;aide de notre protocole (Figure 3). Enfin, l&#39;ARN isolé à la fois pan-da neurones et de classe-IV neurones DA a été utilisé pour effectuer des profils d&#39;expression transcriptionnelle sur Agilent Drosophila melanogaster microarrays oligo génome entier (4 x 44K) (figure 4). Ces analyses identifié de nombreux régulateurs préalablement impliqués de da neurone dendrite morphogenèse en plus à un large éventail de molécules non définies auparavant et putatifs voies de transduction de signal qui pourrait jouer des rôles fonctionnels importants dans les neurones da développement. Des études visant à évaluer le rôle potentiel (s) de ces molécules non définies auparavant dans la médiation da neurone développement, et de la morphogenèse spécifiquement dendrite, sont actuellement en cours. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Figure 1:. Schéma de tri bille magnétique des neurones DA drosophile (a) appariés pour l&#39;âge des larves du troisième stade portant da spécifique des neurones GAL4, journaliste UAS-GFP-mCD8 transgène sont disséqués en inversant la cuticule des larves dedans-dehors, pour exposer les SNP à la dissociation de tampon et stocké dans PBS glacé. (b) la dissociation enzymatique est effectuée en ajoutant Libérase Blendzyme 3 à la solution contenant la cuticule larvaire. (c) Les tissus larvaires sont encore dissociés par une combinaison de vortex, la trituration et douncing pour enlever les tissus non spécifiquement étiquetés comme les graisses des organismes, des intestins et du SNC. (d, e) Les cellules sont alors filtrés en utilisant un filtre de 30 um cellule. La solution contient une suspension cellulaire unique de différents types cellulaires, y compris les épithéliums, les muscles et les neurones. (F) anti-souris CD8a-anticorps revêtement Dynabeads M-280 sont ajoutés à la suspension de cellules et incubé sur glace pendant 30-60 minutes. ( g) Les billes magnétiques se lie à des neurones qui expriment da une souris CD8 marqués protéine de fusion GFP. (h, i) La bille magnétique cellules enrobées sont séparés en plaçant la solution dans un fort champ magnétique. Le surnageant est jeté et les cellules sont lavées trois fois pour éliminer tout résidu non-spécifique des cellules, ce qui entraîne (j) highly purifiée populations de neurones DA. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Figure 2: Image représentant (a) de la sélection positive des neurones, la GFP fluorescente da classe IV isolés par dissociation cellulaire et magnétiques de tri de billes. La population résultant de neurones a été jugée hautement enrichi pour les neurones da classe IV avec peu ou pas d&#39;impuretés de cellules contaminantes. (B) Une bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc) électrophérogramme de l&#39;ARN total isolé à partir bille magnétique neurones da triés , montrant une excellente qualité d&#39;ARN total, comme indiqué par la présence de 5.8S, 18S, 28S et ARNr. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Figure 3: qRT-PCR de l&#39;expression du gène marqueur de neurones isolés dans les neurones da (GAL421-7, SAMU-mCD8-GFP) et le débit à travers fraction a été réalisée en trois exemplaires. Les niveaux d&#39;expression des deux gènes marqueurs neuronaux spécifiques (elav et futsch) ont été évalués par qRT-PCR. Les valeurs obtenues à partir de ces analyses ont été normalisées pour le contrôle endogène (rp49), et les niveaux par rapport à ceux observés dans traversent fraction ont été calculés en utilisant la méthode ΔΔCτ 6. Les deux elav et futsch ont été considérablement enrichie dans la population isolée da neurone par rapport à l&#39;écoulement à travers fraction. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Figure 4: Représentant de classe IV da spécifique des neurones marqués Cy3 fichier image de biopuces. On voit ici une Agilent Drosophila melanogaster génome entier oligo biopuces (4 x 44K) hybridées avec Cy3 labeld ARN total isolé à partir de neurones da classe IV purifié par le tri bille magnétique. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 4.

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

Le protocole présenté ici est optimisé pour l&#39;isolement et la purification des neurones périphériques qui adhèrent fermement à la surface interne de la cuticule drosophile troisième stade larvaire en utilisant une stratégie de billes magnétiques tri cellulaire. Alors que nous avons utilisé ce protocole pour isoler spécifiquement drosophile neurones DA, les applications de ce protocole à l&#39;isolement des autres types de cellules qui adhèrent à la cuticule larvaire ou pupal de développement (par exemple l&#39;épith...

Équipement <ul><li> (10) aimants néodyme de bloc (Magnetics J &amp; K, Inc, Cat. # B444B), alternativement dynamag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) peut être utilisé. </li><li> Grinder Kontes tissu de verre, 2 ml de capacité de travail, avec un pilon grand dégagement (Cat. # 885300-0002) </li><li> Filtres cellulaire, par exemple MACS Pré-Séparation Filtre (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> Pétri de 35 mm-plats revêtus d&#39;Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358-1004) </li><li> Des outils de dissection: deux paires de pinces à Dumont n ° 5 (Outils Fine Science, n ° de cat 11251-20.) </li><li> Vannas printemps micro-dissection ciseaux (Outils Fine Science, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipettes (P-1000, P-100, P-10) avec embouts jetables </li><li> Hémocytomètre standard pour compter les cellules et la pureté devis </li><li> Pipettes Pasteur avec des conseils polies au feu de diamètre standard, réduit à ~ 50% du diamètre standard et réduit à ~ 25% du diamètre standard pour la trituration </li><li> Table top micro-centrifugeuse (1-16,000 (x) g) </li><li> Vortex </li><li> Fluorescent stéréomicroscope (une MZ16FA Leica a été utilisé dans ce protocole) </li></ul>

isolement et purification de drosophile neurones périphériques en triant bille magnétique

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Système nerveux périphérique (SNP) est un modèle puissant pour étudier les processus complexes du développement neuronal et la morphogenèse des dendrites au niveau moléculaire et fonctionnelle. Pour faciliter ces analyses, nous avons développé une stratégie pour l&#39;isolement d&#39;une sous-classe de neurones du SNP appelé arborisation dendritique (bis) les neurones qui ont été largement utilisées pour l&#39;étude de la morphogenèse dendrite<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Ces neurones sont très difficiles à isoler comme une population pure, due en partie à leur occurrence extrêmement faible et leur difficulté à atteindre l&#39;emplacement ci-dessous la cuticule larvaire dure de chitine. Notre méthode nouvellement développée permet de surmonter ces défis, et est basé sur un enrichissement cellulaire rapide et précis à l&#39;aide d&#39;anticorps billes magnétiques recouvertes. Pour nos études de tri magnétique perles, nous avons utilisé appariés selon l&#39;âge des larves troisième stade exprimer une souris CD8 marqués protéine de fusion GFP (<em&gt; UAS-GFP-mCD8</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sous le contrôle de soit l&#39;arborisation dendritique de classe IV (da) spécifique des neurones<em&gt; Pickpocket (PPK)-GAL4</em&gt; Chauffeur<sup&gt; 4</sup&gt; Ou le contrôle de la pan-da spécifique des neurones GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Chauffeur<sup&gt; 5</sup&gt;. Bien que ce protocole a été optimisé pour isoler les cellules du SNP qui sont attachés à la paroi interne de la cuticule des larves, en faisant varier quelques paramètres, le même protocole pourrait être utilisé pour isoler de nombreux types cellulaires différents attaché à la cuticule au stade larvaire ou nymphal des développement (par exemple l&#39;épithélium, le muscle, oenocytes etc), ou d&#39;autres types cellulaires à partir d&#39;organes larvaires en fonction du motif de GAL4-pilote spécifique d&#39;expression. L&#39;ARN isolé par cette méthode est de haute qualité et peut être facilement utilisé pour les analyses génomiques aval telles que les études génétiques biopuces profilage de l&#39;expression. Cette approche offre un nouvel outil puissant pour effectuer des études sur les isolés<em&gt; Drosophile</em&gt; Dendritiques arborisation (da) neurones fournissant ainsi de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la morphogenèse des dendrites.

Dans cette vidéo, article, nous présentons une méthode pour l&#39;isolement et la purification de<em&gt; Drosophile</em&gt; Neurones périphériques en utilisant une bille magnétique rapide stratégie assisté tri cellulaire. ARN obtenu à partir des cellules isolées peuvent être facilement utilisés pour des applications en aval y compris les analyses de biopuces.

Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique

Le système nerveux périphérique (SNP) de Drosophila est un modèle puissant pour étudier les processus complexes du développement neuronal et de la dendrite...

Des larves de Drosophila portant un transgène rapporteur de fusion CD8-GFP spécifique aux neurones sont utilisées pour isoler les neurones DA. Les larves sont disséquées en retournant leur cuticule à l'envers, ce qui expose le système nerveux périphérique. Les larves retournées sont soumises à une dissociation enzymatique, suivie d'une dissociation mécanique par vortexage, ation et downing.Les cellules sont ensuite filtrées afin d'obtenir une suspension monocellulaire contenant principalement des cellules épithéliales, musculaires et des neurones. Des billes magnétiques revêtues d'anticorps sont ajoutées à la suspension cellulaire, où elles se lient aux neurones exprimant la protéine de fusion GFP marquée par le CD huit. Enfin, les neurones revêtus de billes magnétiques sont isolés en plaçant la solution dans un champ magnétique intense, ce qui permet d'obtenir des populations de neurones hautement purifiées.Bonjour, je suis Dan Cox du Département de biologie moléculaire et de microbiologie de l'Institut Krasno pour les études avancées de l'Université George Mason. Bonjour, je suis Ish AER du laboratoire du Dr Dan Cox. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'isolement et de purification de neurones périphériques DLO par tri magnétique à billes.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les mécanismes moléculaires régulant la morphogenèse spécifique à la classe et celle du côté droit. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, sélectionnez 30 à 50 larves âgées de troisième stade appariées par âge et placez-les dans un tube microfuge de 1,6 millilitre contenant de 1 à 1,2 millilitres de PBS 1X.Fermez le tube et faites-le vortexer à puissance maximale trois fois pendant une seconde à chaque fois. À l’aide d’une pipette passée brièvement à la flamme, éliminez complètement le surnageant. Ajoutez un millilitre de PBS et répétez les étapes de lavage et de vortexage trois fois, jusqu’à ce que le surnageant soit visiblement débarrassé de toute particule alimentaire et de débris.Répétez brièvement le lavage avec un millilitre d’éthanol à 70 %. Lavez ensuite les larves deux fois avec un millilitre d’eau doublement distillée. Enfin, effectuez un nouveau lavage avec un millilitre de R nase away, puis trois fois avec un millilitre d’eau doublement distillée afin d’éliminer complètement le R nase away. Les larves sont désormais prêtes pour la dissection.Placer 10 à 12 larves au centre d'une boîte de Pétri de 35 millimètres recouverte d'une protection de seuil. Les positionner légèrement écartées les unes des autres et éliminer les larves qui ne semblent pas être au stade de développement approprié. Ensuite, utiliser une paire de ciseaux de dissection fins pour ouvrir l'extrémité antérieure des larves à l'aide d'une pince émoussée de type Dumont.Numéro cinq, une pince. Retournez les larves à l’envers. Commencez par insérer une pince à l’intérieur de la cuticule larvaire jusqu’à l’extrémité postérieure.Pincez les extrémités de la pince ensemble pour saisir l'extrémité postérieure de la cuticule. Appuyer la cuticule contre la surface du protecteur en syl rend l'opération plus facile. À l'aide d'une deuxième paire de pinces, poussez la cuticule larvaire à l'envers.Veillez à ce que les larves soient complètement retournées afin que tous les tissus mous soient exposés à la solution pour une dissociation facile. Entraînez-vous à cette manipulation plusieurs fois avant de tenter de dissocier les cellules. Après la dissection de trois à quatre larves, transférez-les immédiatement dans du PBS frais refroidi sur glace, dans un tube microfuge.Répétez jusqu'à ce que les 30 à 40 larves requises soient collectées avant de procéder à l'élimination des cellules non spécifiques. Gardez à l'esprit qu'une perte de 10 à 20 % est attendue durant la dissection et l'association, maintenant que toutes les larves ont été disséquées. Éliminez les tissus non spécifiques faiblement adhérents, tels que les corps gras et les cellules du système nerveux central.En remplaçant le surnageant du tube contenant les cuticules larvaires inversées par 700 à 800 microlitres de PBS frais glacé. Enfin, effectuez une courte agitation. Vortexez le tube microfuge cinq fois pendant trois secondes par impulsion à vitesse maximale.Ensuite, jetez le surnageant et remplacez-le par environ 700 à 800 microlitres de PBS frais glacé. Répétez cette étape trois fois, puis redisperser finalement les cuticules larvaires dans 400 microlitres de PBS frais glacé.PBS froid avant de passer à la dissociation des cellules pour isoler les neurones larvaires à arborisation dendritique ou da. Utilisez une combinaison de dissociation enzymatique et mécanique. Veillez à ne pas trop dissocier, ce qui pourrait entraîner la perte du marqueur de surface cellulaire, conduisant à un faible rendement cellulaire et à une faible viabilité cellulaire.Commencer la dissociation en ajoutant 1,5 microlitres d'une unité de liase zyme trois à 28 unités par flacon aux cuticules larvaires suspendues dans 400 microlitres de PBS. Vortexer la solution deux à trois fois pendant une seconde chaque fois, au réglage maximal, afin de détacher les cellules faiblement adhérentes des cuticules et de les mettre en suspension.Incuber ensuite la solution à température ambiante pendant cinq minutes. Le temps d'incubation influant fortement sur l'efficacité finale du tri cellulaire, ne pas dépasser 15 minutes à la fin de l'incubation.Vortexez le tube de 20 à 30 fois à pleine vitesse pendant deux secondes par impulsion. Cette étape devrait libérer le muscle et les autres tissus non spécifiques en solution. Examinez l'échantillon périodiquement au microscope stéréo équipé de fluorescence pour déterminer si les neurones périphériques sont encore attachés à la cuticule.Examinez un petit échantillon de la solution en observant directement le tube microfuge sous un stéréomicroscope à fluorescence pour déterminer le degré de dissociation. Répétez cette opération à chaque étape de la dissociation, en arrêtant le vortex avant que les neurones périphériques ne commencent à se dissocier de la cuticule et à passer en solution. Rincez brièvement les cuticules larvaires avec deux à trois changements d’un millilitre chacun de PBS frais glacé.Et enfin, la resuspension. Suspendez-les dans 500 microlitres de PBS frais glacé contenant 1 % de BSA afin de poursuivre la dissociation mécanique des cellules. Utilisez un homogénéisateur de tissus de deux millilitres avec un piston à large jeu et une solution de BSA à 1 % dans du PBS. Après un rinçage rapide, jetez la solution de BSA.Cela empêchera les cuticules larvaires de coller aux surfaces en verre. Ensuite, prérefroidissez le broyeur de tissus et son pilon en les plaçant sur de la glace pendant quelques minutes afin d'éviter les dommages cellulaires ou la lyse. Puis utilisez une pipette dont l'extrémité a été lissée à la flamme pour transférer les cuticules dans le broyeur de tissus.Maintenant, homogénéisez le tissu avec des mouvements lents et réguliers en évitant de faire mousser pendant environ 20 à 30 mouvements. Assurez-vous d'homogénéiser lentement et régulièrement. Sinon, les cellules pourraient lyser.Pour évaluer les niveaux de dissociation cellulaire, essuyez la paroi du broyeur tissulaire avec un essuie-tout propre et examinez au microscope stéréo à fluorescence. Les neurones doivent s'être détachés de la cuticule et être visibles dans la solution. Un bon indicateur de dissociation cellulaire est l'absence de neurones sur la cuticule larvaire.Cependant, si l'on observe encore des neurones attachés à la cuticule ou si l'on observe, dans les cellules complètement dissociées, des agrégats persistants, poursuivre la dissociation jusqu'à ce que les cellules forment une suspension monocellulaire. Poursuivre la dissociation mécanique à l'aide d'une pipette à embout flammé. Rétrécir l'embout à environ 50 % du diamètre standard de la pointe, puis passer la solution cinq fois à travers cette pipette, suivie de dix passages supplémentaires avec une pipette à embout flammé.Resserrez jusqu'à environ 25 % du diamètre standard de la pointe. Remarquez que des manipulations trop brusques peuvent endommager les cellules. Surveillez les cellules entre chaque étape et ajustez la procédure en conséquence.Terminer en filtrant la solution à travers un filtre à cellules de 30 micromètres et recueillir le filtrat cellulaire dans un tube microfuge de 1,6 millilitre. La solution obtenue doit constituer une suspension de cellules uniques et est désormais prête pour le tri magnétique des cellules. Billes magnétiques revêtues d’un anticorps anti-CD8.Ont été préparés comme décrit dans le protocole écrit accompagnant et les neurones DA expriment une protéine de fusion CD huit GFP ciblée par l'anticorps. Commencez le tri cellulaire en ajoutant 15 microlitres de billes magnétiques revêtues d'anticorps à 500 microlitres de suspension cellulaire. Incubez les cellules avec les billes magnétiques revêtues d'anticorps pendant 30 à 60 minutes sur de la glace avec un mélange manuel occasionnel ; une incubation à une température plus élevée ou pendant une durée plus longue peut entraîner une liaison non spécifique de l'anticorps.Placez ensuite le microtube dans un champ magnétique puissant pendant deux minutes. Toutes les cellules positivement sélectionnées ainsi que les billes non liées adhéreront sur le côté du tube ; aspirez lentement le surnageant sans perturber le culot cellulaire, puis lavez les cellules trois à quatre fois dans du PBS frais glacé. Cette étape élimine toutes les cellules restantes non spécifiques.Enfin, resuspendre les cellules dans 30 microlitres de PBS frais glacé pour estimer la pureté et le rendement cellulaire. Prélever cinq microlitres de la suspension cellulaire et les déposer sur la surface polie d'un hémo-cytomètre, puis compter toutes les cellules fluorescentes visibles au microscope stéréo à fluorescence. Vérifier également la quantité de cellules non fluorescentes ainsi que tout signe d'impuretés.Typiquement, l'échantillon sera fortement enrichi en cellules fluorescentes. Enfin, utilisez le kit d'isolement d'ARN Pico Pure pour isoler l'ARN des cellules liées aux billes. Ajoutez le tampon d'extraction aux cellules triées, mais retirez les billes à l'aide d'un aimant avant l'étape de purification sur colonne ; utilisez un microlitre de l'ARN extrait pour évaluer la qualité totale de l'ARN sur un Agilent Bioanalyzer 2100.L'ARN purifié à partir des neurones DA isolés est d'excellente qualité, comme en témoigne la présence de pics nets d'ARN ribosomique 5,8 s et 28 s lors de l'analyse sur un bioanalyseur Agilent 2100. À partir de larves au stade 30 à 43, nous avons pu isoler en moyenne de 300 à 500 neurones DA de classe quatre à l'aide du conducteur PPK gal4, et de 1500 à 2000 neurones DA appartenant aux classes 1, 2, 3 et 4. En utilisant un conducteur gal4 spécifique aux neurones PANDA, une RT-PCR quantitative avec L11 fch, marqueurs spécifiques aux neurones, a révélé un enrichissement significatif en facteurs exprimés, indiquant un enrichissement hautement spécifique des neurones DA grâce au protocole que nous avons mis en œuvre, par rapport au flux passant. Enfin, l'ARN isolé à partir des neurones PANDA et des neurones DA de classe quatre a été utilisé pour réaliser un profilage d'expression transcriptionnelle sur des puces à oligonucléotides Agilent Drosophila melanogaster couvrant tout le génome, permettant d'identifier de nombreux facteurs impliqués dans la morphogenèse des neurones DA.Nous vous avons montré comment isoler et purifier les neurones périphériques de drosophile par tri magnétique à partir du stade larvaire de troisième instar. Lors de cette procédure, il est important d'équilibrer les étapes de dissociation enzymatique et mécanique. Une dissociation enzymatique excessive peut entraîner la dégradation des marqueurs de surface cellulaire CD8, conduisant à un tri cellulaire inefficace ou à son échec.Il est également essentiel de maintenir des conditions exemptes d'ARN tout au long de la procédure afin de préserver l'intégrité de l'ARN purifié provenant des neurones isolés. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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