Dissection de 6,5 embryons de souris DPC

Je m'appelle Kelly Shea et je suis responsable du laboratoire ainsi que technicienne de recherche dans le laboratoire de Neilsen. C'est difficile parce que beaucoup de gens ne savent pas distinguer les différentes couches tissulaires. Vous devez donc essentiellement décoller toutes les couches de tissu afin d'exposer l'embryon sous-jacent, qui à ce stade n'est pas très vascularisé. Il est donc très transparent et difficile à distinguer.

Prenez des pinces et des ciseaux assez robustes. La première chose à faire est de pincer l'animal exactement au niveau de la ligne médiane, puis d'effectuer une première incision. À partir de ce point, vous pouvez simplement écarter la peau pour exposer l'abdomen de l'animal.

Il y a une fine couche du péritoine que vous allez soulever avec la pince, puis inciser avec des ciseaux et rabattre simplement. Vous devez inciser le long de la ligne médiane de l'animal et séparer les deux cornes utérines, qui sont reliées au milieu. Vous pouvez couper directement à la base.

Vous allez probablement obtenir beaucoup de tissu adipeux en même temps. Prélevez tout le cornet utérin de l'animal. Placez-le directement dans le PBS.

Donc, ceci se trouve dans la corne. Ce sont les sites d'implantation, 1, 2, 3, 4, 5. Ce que vous devez faire, c'est simplement les séparer.

Vous pouvez essentiellement couper entre les sites d'implantation juste ici. Il suffit de saisir l'embryon sur le côté et de le séparer mécaniquement. À ce stade, vous exposez le deum, un tissu plus spongieux situé en dessous.

Ainsi, l'embryon doit être bien au centre, juste ici. C'est l'apex du feuillu. Vous devez l'orienter vers le haut avec l'apex.

Ce que vous allez finir par faire, c'est couper environ un cinquième du chemin à partir de l'apex. L'embryon doit être positionné exactement au milieu ici. Ce que je fais en pratique, c'est de l'orienter sur le côté, de prendre une paire de forceps et de le saisir légèrement, de le maintenir vers le bas avec l'autre, de couper l'extrémité, puis de le séparer.

Donc, une fois que le bouchon est retiré, placez l'embryon sur son bord. Et comme vous pouvez le voir, il y a une ouverture exactement à l'endroit où vous retirez le bouchon. Il suffit d'insérer la pince à cette ouverture. Oui.

À ce stade, l'embryon est très lâchement situé dans le deum. Une fois que vous avez ouvert le deum, vous pouvez pratiquement l'extraire assez facilement, à condition de passer sous sa base. Il est donc très petit.

Il y a également certains tissus encore attachés à l'embryon. Vous avez le cône ecto-placentaire, qui se trouve juste ici à l'apex de l'embryon. Et vous avez aussi d'autres tissus encore attachés.

Donc, je prends simplement une pipette et je l'aspire. À ce stade, vous souhaitez fixer les embryons. J'ai donc juste une boîte contenant du PFA.

Nous souhaitions examiner des gènes candidats. Fondamentalement, nous utilisons des techniques d'hybridation in situ sur des embryons entiers à partir d'ARN pour visualiser la production d'acides nucléiques in situ au sein d'un embryon. Ces gènes spécifiques nous intéressent particulièrement car ils codent des marqueurs putatifs de précurseurs des cellules germinales, et ils sont également prédits pour être exprimés dans l'embryon de souris à un moment précis qui favorise le développement et la maturation des cellules germinales à partir de précurseurs putatifs des cellules germinales.

Un facteur qui nous intéresse tout particulièrement, et qui est le premier facteur pour lequel nous avons effectué une hybridation in situ sur des embryons de 6,5 jours, est la protéine morphogénétique osseuse, ou BMP-4. Elle appartient à la superfamille des TGF-bêta. Elle joue un rôle très important et est absolument indispensable à la maturation des cellules germinales.

Et il est également nécessaire que les cellules germinales migrent à travers l'embryon et s'installent près de la ligne primitive de l'embryon. La protéine BMP4 joue un rôle essentiel à la fois dans la signalisation et dans la maturation que les cellules germinales doivent traverser afin de s'établir dans la ligne primitive. Vous devez donc, premièrement, vous assurer de savoir ce que vous recherchez, de connaître leur petite taille, l'échelle à laquelle vous travaillez, et également prendre le temps de planifier très soigneusement.

La technique, en particulier le type de microscope stéréoscopique que vous allez utiliser. L'une des difficultés techniques réside dans le fait qu'elle implique de nombreuses manipulations et des mouvements de main très, très précis afin de ne pas endommager l'embryon. Vous devez donc disposer d'un microscope stéréoscopique offrant suffisamment d'espace pour effectuer les manipulations, et vous assurer que tout le matériel nécessaire à l'expérience est préalablement mis en place, afin de limiter au strict nécessaire les interventions durant la dissection.

Donc, à part cela, vous devez procéder très lentement et décoller les couches de tissu individuelles très progressivement afin de savoir avec quoi vous travaillez. Assurez-vous également de connaître la position de l'embryon.