Name: Un journaliste Roman DP pour faciliter la visualisation du disque Eye Imaginal au Drosophile /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Découvrez la dissection du disque imaginal oculaire chez Drosophila avec un rapporteur RFP rouge. Cette méthode permet d'identifier et d'étiqueter les types cellulaires spécifiques lors du développement de l'œil.

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Ce travail a été financé par King College de Londres et la Royal Society.

<ol&gt;<li&gt; Première place une goutte de PBS sur un plat Sylgard sous un microscope à dissection.</li&gt;<liSuivant&gt; supprimer plusieurs larves errer troisième stade larvaire à partir d&#39;un flacon ou une bouteille à l&#39;aide d&#39;une spatule et les placer dans le PBS.</li&gt;<li&gt; Pour commencer la dissection d&#39;utiliser votre main gauche une pince à épiler (si vous êtes droitier) de saisir une larve des deux tiers de la voie vers le postérieur et ensuite utiliser l&#39;autre paire de tenir les crochets colorés sombres bouche à l&#39;extrémité antérieure.</li&gt;<li&gt; Maintenant, tirez doucement la larve part en déplaçant les deux paires de pinces loin les uns des autres. Les pièces buccales devraient venir loin du reste du corps avec le complexe des yeux / du cerveau ci-joint.</li&gt;<li&gt; Pour les disques tache oeil pour corriger immunofluorescence les disques à ce point en les plaçant dans du paraformaldéhyde à 4% / solution PBS pendant 30-45 minutes sur la glace. Puis laver les disques à quatre reprises avec PBST et aux taches, puis avec des anticorps appropriés.</li&gt;<li&gt; Il est plus facile à décortiquer les disques oeil directement sur une diapositive. Déposer une goutte de PBS sur une lame et déplacer les disques à la baisse de PBS en tenant l&#39;appareil buccal.</li&gt;<li&gt; Les tissus imaginaux sont translucides et donc au premier abord l&#39;oeil disques sont difficiles à identifier. Pour le rendre plus facile d&#39;identifier les utiliser un microscope à dissection avec la capacité de fluorescence. Utilisation de l&#39;oeil-DP en ligne Reporter les disques œil peut être clairement perçue comme le tissu rouge fluorescent recouvrant les lobes optiques sphériques (figure 1).</li&gt;<li&gt; Si vous utilisez une source de fibres optiques à lumière froide de diriger la lumière à un angle oblique par rapport à la diapositive, comme cela vous donnera des disques plus grand contraste. Les disques des yeux / du antennaires sont attachés à des lobes optiques via le pédoncule optique à l&#39;arrière et à travers les pièces buccales d&#39;une tige à venir à partir du disque antennaire à l&#39;antérieur.</li&gt;<li&gt; Pour disséquer les disques oeil maintenir les pièces buccales en utilisant une paire de pinces et d&#39;utiliser l&#39;autre paire de séparer les disques oeil du cerveau larvaire. Suivant séparer les disques oeil du rostre. Enfin retirer le rostre de la diapositive, car ils peuvent empêcher la lamelle de la position couchée à plat.</li&gt;<li&gt; Quand vous avez disséqué tous les disques yeux délicatement basculer la lame et sécher l&#39;excès de PBS. Puis ajoutez une goutte de Vectashield et placez doucement une lamelle sur le dessus.</li&gt;<li&gt; Les disques sont maintenant prêts à être imagé soit par microscopie à épifluorescence ou confocale (figure 2).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"Résultats représentative&gt;</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Quand disséqué correctement le disque yeux / antennaire doit être à plat sur la lame libre de tout tissu étranger comme le cerveau. Les pôles dorsale et ventrale du disque yeux sont courbées et tendent ainsi à se plier, mais cela peut être évité en prenant une série Z sur un microscope confocal et en omettant ces sections de la projection. Bien que le disque est un épithélium monocouche des positions variables des noyaux nécessitent une projection de la série Z pour obtenir une image globale du disque. Une projection d&#39;un typique oeil-oeil DP / disque antennaire prises sur un microscope confocal est montré dans la figure 2. Nous prennent habituellement une des sections um à travers le disque en utilisant une lentille 20x ou 40x. Le journaliste oeil-DP est localisée nucléaire et donc la tendance observée dans la figure 2 représente les noyaux des cellules exprimant la DP.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig1.jpg" alt="figure 1" /<br /<strong&gt; Figure 1. Dissection initiale de l&#39;œil / cerveau de complexes une larve de l&#39;œil-DP troisième stade drosophile.</strong&gt; L&#39;œil / disque antennaire imaginale (décrites) peut être vu attaché à l&#39;appareil buccal (MP) et en superposant le lobe optique (LO) du cerveau. L&#39;image a été prise en utilisant un microscope à fluorescence dissection de montrer l&#39;expression DP dans le disque oculaire. Antérieure est à gauche. Barre d&#39;échelle: 300 um.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig2.jpg" alt="figure 2" /<br /<strong&gt; Figure 2. Expression de la journaliste yeux DP dans le disque imaginal des yeux.</strong&gt; Un œil troisième stade (ED) / disque antennaire (AD) disséqué par une larve d&#39;oeil-DP DP montrant l&#39;expression (en rouge). Le disque a été coloré avec la phalloïdine (vert), qui colore la surface des cellules apicales et montre le sillon morphogénétique (flèche). DP est exprimée dans les cellules précurseurs dans le MF, dans les photorécepteurs 1,6,7 et dans les cellules de cône. Antérieure est à gauche. Barre d&#39;échelle: 25 um.</p

<ol><li>Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).</li>
<li>Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).</li>
</ol>

Dissection du disque imaginal des yeux chez la drosophile est simple, mais peut prendre du temps à maîtriser. Les étapes essentielles sont l&#39;identification du disque oeil et sa dissection loin du cerveau larvaire. Identification du disque œil est rendue plus facile en utilisant la ligne de l&#39;œil-DP décrites ici. Les modifications éventuelles sont à retirer le disque antennaire ou la membrane peripodial, ou de quitter le lobe optique attaché à visualiser les axones PR entrant dans le cerveau. <p clas...

un journaliste roman dp pour faciliter la visualisation du disque eye imaginal au drosophile</em

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

L&#39;<em&gt; Drosophile</emOeil&gt; est un système puissant modèle pour étudier des domaines tels que la neurogenèse, la transduction du signal et la neurodégénérescence. Beaucoup de découvertes faites en utilisant ce système ont profité de la nature spatio-temporelle de la différenciation des photorécepteurs dans le disque imaginal des yeux de développement. Pour utiliser ce système, il est d&#39;abord nécessaire pour le chercheur d&#39;apprendre à identifier et disséquer le disque oculaire. Nous décrivons un journaliste roman DP afin d&#39;aider à l&#39;identification du disque oeil et la visualisation de types de cellules spécifiques dans l&#39;œil en développement. Nous détaillons une méthodologie pour la dissection du disque imaginal des yeux du stade larvaire troisième et décrire comment le journaliste oeil-DP peut aider à cette dissection. Ce journaliste oeil-DP est exprimé uniquement dans les yeux et peuvent être visualisées en utilisant la microscopie à fluorescence, soit dans les tissus vivants ou après fixation sans la nécessité d&#39;amplification du signal. Nous montrons aussi comment ce journaliste peut être utilisé pour identifier les types spécifiques de cellules à l&#39;intérieur du disque oeil. Ce protocole et l&#39;utilisation de la journaliste oeil-DP aidera les chercheurs utilisant le<em&gt; Drosophile</em&gt; Œil à l&#39;adresse d&#39;une importance fondamentale des questions biologiques.

Nous décrivons une nouvelle protéine fluorescente rouge (RFP) journaliste qui est exprimé spécifiquement dans le<em&gt; Drosophile</emOeil&gt;. Nous détaillons une méthodologie pour la dissection du disque imaginal des yeux et comment ce journaliste peut être utilisé pour aider à la dissection et l&#39;identification des types cellulaires spécifiques dans les yeux en développement.

Un journaliste Roman DP pour faciliter la visualisation du disque Eye Imaginal au Drosophile</em

L'œil de la Drosophila est un système modèle puissant pour étudier des domaines tels que la neurogenèse, la transduction du signal et la neurodégénérescence. Bon nombre des découvertes...

La nouvelle lignée transgénique de Drosophile, IRFP Reporter, exprime une protéine fluorescente rouge ou RFP dans des cellules spécifiques du disque imaginal I. Cette lignée transgénique peut faciliter l'identification, la dissection et le marquage de types cellulaires spécifiques dans l'œil en développement. Pour disséquer le disque imaginal de l'œil, des larves en stade de troisième instar errantes sont prélevées sur le côté d'un flacon à l'aide d'une spatule.Les larves sont ensuite placées dans une goutte de PBS sur une boîte de culture. Les pièces buccales auxquelles sont attachés les disques oculaires sont retirées du reste de la larve à l’aide de pinces, puis les disques oculaires sont transférés sur une lame où ils sont disséqués séparément des pièces buccales et du cerveau. Bonjour, je suis Amna Cole du laboratoire de Joseph Bateman au Wolfson Center for age related diseases, King's College London.Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de disséquer des disques imaginaux oculaires de Drosophile. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les gènes impliqués dans la neurogenèse. Commençons donc.Pour commencer la dissection des disques imaginaux oculaires, déposez une goutte de PBS sur une boîte de Pétri revêtue de Syl Guard. Sous un microscope stéréoscopique, le revêtement Syl Guard aidera à protéger les pinces contre les dommages pendant la dissection. Ensuite, à l’aide d’une spatule, prenez une larve en phase de troisième stade errant et placez-la dans la goutte de PBS. Tenez une paire de pinces dans chaque main, saisissez la larve aux deux tiers de sa longueur en partant de l’extrémité postérieure avec l’une des pinces. Utilisez ensuite l’autre paire de pinces pour maintenir les pièces buccales de couleur foncée situées à l’extrémité antérieure de la larve.Séparez délicatement la lave en écartant les pinces. Les pièces buccales doivent se détacher du reste du corps avec le complexe œil-cerveau attaché. Ensuite, déposez une goutte de PBS sur une lame et transférez les disques dans la goutte de PBS en tenant les pièces buccales.Passer maintenant en mode fluorescence sur le microscope stéréo, car seuls les disques imaginaux oculaires expriment la RFP ; ils peuvent ainsi être facilement identifiés comme un tissu fluorescent rouge recouvrant les lobes optiques sphériques afin d'augmenter le contraste des disques. Orienter la source lumineuse froide à fibre optique selon un angle oblique par rapport à la lame. Les disques imaginaux oculaires sont attachés aux lobes optiques par le pédoncule optique à l'arrière et aux pièces buccales par un pédoncule provenant du disque antennaire à l'avant.Pour disséquer les disques imaginaux de l'œil, maintenez les pièces à l'aide d'une paire de pinces et utilisez l'autre paire pour séparer les disques imaginaux de l'encéphale larvaire. Ensuite, séparez les disques imaginaux de l'œil des pièces buccales. Une fois que les pièces buccales ont été séparées des disques imaginaux de l'œil, retirez-les de la lame.Les disques imaginaux de l'œil doivent maintenant être à plat sur leur lame et débarrassés de tout tissu accessoire, y compris du tissu cérébral. Poursuivez la dissection des disques imaginaux I restants. Une fois que tous les disques imaginaux de l'œil ont été disséqués, inclinez doucement la lame et utilisez un petit morceau de papier absorbant pour éliminer l'excès de PBS.Ajoutez maintenant une goutte de milieu de montage Vector Shield et placez délicatement une lame couvre-objet par-dessus. Les préparations sont désormais prêtes à être observées en microscopie à épifluorescence ou en microscopie confocale. Si l'observation doit avoir lieu ultérieurement, conservez la lame à quatre degrés Celsius.L'ARFP restera visible pendant au moins un an. Lors de l'acquisition d'images de la série Z, celles-ci doivent être obtenues sur un microscope confocal ou un microscope Zeiss aome avec un espacement d'un micromètre, en utilisant un objectif 20 x ou 40 x ; des images projetées peuvent ensuite être générées à l'aide du logiciel du microscope. Des disques imaginaux provenant de mouches exprimant l'IRFP ont été disséqués et colorés avec Phin. L'imagerie a ensuite été réalisée sur un microscope zes aome avec un espacement d'un micromètre, en utilisant un objectif 20 x. Les cellules du disque oculaire, qui expriment l'ARFP, apparaissent en rouge.La sillonne morphogénétique est visualisée par foid et coloration et apparaît en vert. Les pôles dorso-ventraux du disque oculaire sont courbés et ont tendance à se replier. Ces sections peuvent être exclues de l'image projetée finale.Bien que le disque soit un épithélium monocouche, les positions variables des noyaux nécessitent une projection en série Z pour obtenir une vue d'ensemble du disque. Étant donné que le rapporteur IRFP est localisé dans le noyau, le motif observé ici représente l'expression nucléaire de RFP. Nous venons de vous montrer comment effectuer la procédure de dissection des disques oculaires vaginaux chez la drosophile.Lorsque vous utilisez cette procédure, il est préférable d'utiliser une pince fine et il serait sans doute judicieux d'éviter le café également. Merci d'avoir regardé et bon courage pour toutes vos expériences.

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Nous décrivons ici un protocole visant à étudier la migration des cellules gliales dans le développement de l'œil de drosophile en utilisant l'analyse microscopique direct couplé à la GFP taggés cellules gliales.

Imagerie de la migration en direct des cellules gliales dans le disque Eye drosophile Imaginal

Une approche standard pour préparer les...

Préparation des adultes Drosophile Yeux pour la coupe mince et analyse microscopique

Source : Hellerman, M. B., et al. Imagerie en direct de l’œil de la drosophile nymphale. J. Vis. Exp. (2015)La vidéo montre une technique d’imagerie en direct pour étudier les motifs oculaires d’une chrysalide de Drosophila melanogaster. Les marqueurs marqués à la protéine fluorescente verte (GFP) permettent de visualiser l’organisation cellulaire et la différenciation pendant la formation de la structure oculaire en développement.

Imagerie en direct de l’œil de la chrysalide de la drosophile à l’aide de la microscopie à fluorescence

La méthode de tomate / GFP-FLP / FRT implique visualiser les cellules photoréceptrices de la mosaïque à vivre la drosophile. Il peut être utilisé pour suivre le destin des cellules individuelles des photorécepteurs dans la rétine pendant des jours ou des semaines. Ce procédé est idéal pour l'étude de la dégénérescence rétinienne et les maladies neurodégénératives ou le développement des cellules de photorécepteur.

Le / GFP-FLP Méthode tomate / FRT pour l&#39;imagerie en direct de mosaïque adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; cellules photoréceptrices

Les structures adultes de la drosophile sont dérivées de structures en forme de sac appelées disques imaginaux. L’analyse de ces disques donne un aperçu de nombreux processus de développement, notamment la détermination des tissus, l’établissement des limites des compartiments, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire et la polarité cellulaire planaire. Ce protocole est utilisé pour préparer des disques imaginaux pour la microscopie optique/fluorescente.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de Drosophila melanogaster

Ce protocole présente une méthode efficace pour l’imagerie du neuroépithélium de l’œil nymphal vivant de la drosophile. Cette méthode compense le mouvement des tissus et la topologie inégale, améliore la visualisation des limites cellulaires grâce à l’utilisation de plusieurs protéines de jonction marquées GFP et utilise un banc d’imagerie facile à assembler.

Live-imagerie de la Drosophila Nymphe yeux

L’objectif de cette technique est de permettre aux chercheurs d’effectuer la dissection, l’immunocoloration et le montage de disques oculaires nymphaux de Drosophila melanogaster de tout âge.

Dissection et de montage de<em&gt; Drosophila</em&gt; pupes disques yeux

Ce protocole montre comment générer des tumeurs clonales marquée par fluorescence, génétiquement définis dans l'œil de Drosophila / disques imaginaux antennaires (EAD). Il décrit comment disséquer l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et comment les traiter pour visualiser et quantifier les changements d'expression des gènes et l'invasivité des tumeurs.

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Ce protocole décrit un procédé détaillé pour la culture ex vivo à long terme et de l' imagerie en temps réel d'un disque de Drosophila imagée. Elle démontre la différenciation des photorécepteurs et la rotation ommatidial dans les 10 h de l'imagerie en direct du disque des yeux. Le protocole est simple et ne nécessite pas l'installation coûteuse.

À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Le moment de l'exposition aux ligands peut avoir une incidence sur leurs conséquences sur le développement. Ici, nous montrons comment la libération d'image d'une protéine morphogène osseuse Drosophila (BMP) appelée Dpp à partir de cellules du disque d'aile.

Sortie d'imagerie Dpp d'un disque d'aile de Drosophila

Cet article décrit un protocole efficace de dissection imaginaire des disques et de coloration par anticorps, économique en matière de réactifs et facilitant la manipulation de disques imaginaux en petites quantités.

Dissection à petite échelle et coloration par anticorps des disques imaginaux oculaires-antennaux et des ailes provenant de Drosophila melanogaster

Découvrez la dissection du disque imaginal oculaire chez Drosophila avec un rapporteur RFP rouge. Cette méthode permet d'identifier et d'étiqueter les types cellulaires spécifiques lors du développement de l'œil.

Un journaliste Roman DP pour faciliter la visualisation du disque Eye Imaginal au Drosophile

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