Poussin Ovo ex Culture et Ovo ex CAM Test: Comment il fonctionne vraiment

Bonjour, je suis Susan Paa. Je travaille à l'Institut de chimie physiologique, département d'Endocrinologie biochimique à l'Université de Burg Esen en Allemagne. Bonjour, je suis Daniel Ze Basian Dole.

Je viens de la même institution que Susan. Bonjour, je suis Mann de l'Institut d'anatomie, département de neuro, à l'Université de Burg. Nous allons vous montrer comment les cultures CH X et les essais de membrane co fonctionnent réellement.

Alors, rendons-nous au laboratoire. Dans la plupart des études expérimentales récentes, le CAM, c'est-à-dire la membrane chorioallantoïdienne, était mis à nu par la création d'une fenêtre dans la coquille, et les expériences étaient réalisées in ovo, ce qui entraînait des limitations importantes quant à l'accès au CAM ainsi qu'aux possibilités d'observation et de documentation photographique des effets. Les cultures ex ovo d'embryons de poulet facilitent considérablement l'accès au CAM et à l'embryon de poulet.

Veuillez observer le cœur battant, qui permet une documentation facile in vivo des effets et une manipulation expérimentale de l'embryon. Dans notre article vidéo, nous fournirons une démonstration étape par étape de l'application réussie de la culture ex ovo à un grand nombre de questions scientifiques. Les œufs sont incubés dans un incubateur équipé d'un plateau mobile.

Ici, vous pouvez voir l'élément chauffant et le dispositif de rotation qui fait tourner les œufs 12 fois par jour de manière continue. L'humidité est maintenue à 60 % en ajoutant de l'eau dans des récipients en plastique placés au fond de l'incubateur, et la température d'incubation est réglée à 37,5 degrés Celsius avant le début de l'incubation. La saleté, les plumes et les excréments sont soigneusement éliminés des coquilles d'œufs ; toutefois, le nettoyage mécanique des œufs à l'aide d'éthanol ou d'un désinfectant réduit significativement les taux de survie des embryons.

Les œufs sont placés horizontalement sur le plateau mobile de l'incubateur. Veillez à maintenir une distance suffisante entre les œufs individuels afin de permettre une rotation libre. Après une incubation de 72 heures, les œufs sont retirés de l'incubateur et le côté supérieur des œufs, où se trouve l'embryon, est marqué au crayon.

Étant donné que l'embryon oppose une certaine résistance à la rotation et reste situé à cet endroit, aucun gant ne doit être utilisé pour casser les œufs, mais les mains doivent être désinfectées avec de l'éthanol à 70 %. L'œuf est maintenu horizontalement avec une marque au crayon vers le haut et cassé sur le bord d'une barre d'agitation magnétique triangulaire. Pour un contrôle maximal de la force pendant le cassage, les coudes ne doivent pas reposer sur le plan de travail. Il est important que la coquille ainsi que la membrane de l'œuf soient ouvertes lors du cassage ; l'écoulement d'albumen constitue un signe certain que la membrane de l'œuf a été perforée.

L'œuf est maintenu près du fond de la boîte de Pétri. Afin d'éviter toute fuite supplémentaire de blanc d'œuf pendant cette première étape d'ouverture, il est important que le blanc d'œuf au fond de la boîte de Pétri reste connecté au reste à l'intérieur de l'œuf. Ce phénomène crée un vide à l'intérieur de l'œuf, maintenant le jaune en place ; en exerçant délicatement une pression sur le méridien passant par la fente et l'équateur de l'œuf à l'aide du pouce et du majeur, il est possible de réguler le vide et l'expulsion du contenu de l'œuf.

Le contenu de l'œuf peut ensuite être transféré dans la boîte de Pétri sans endommager le jaune. Si l'œuf est soulevé délicatement et que les deux moitiés de la coquille sont soigneusement séparées, les cultures ex ovo sont alors placées sur un plateau, remises dans un incubateur et maintenues à une température de 37,5 à 38,2 degrés Celsius et à une humidité de 70 %. Un apport en dioxyde de carbone ou en oxygène n'est pas nécessaire.

Si des boîtes de Pétri spéciales munies d'espacements entre le couvercle et la boîte, ainsi que des incubateurs équipés d'une grille de ventilation, sont utilisées, la grille de ventilation doit être maintenue à moitié ouverte. Des papiers filtres stérilisés à l'autoclave sont utilisés comme matériau de support pour les substances liquides appliquées sur le cam, car ils semblent provoquer le moins d'irritation possible du cam. Le site d'application doit se situer à mi-chemin entre l'embryon et la bordure du cam, car sinon l'embryon gêne l'observation microscopique des effets en lumière transmise.

Le liquide atropine doit être appliqué immédiatement après que le filtre ait été placé sur l'œil de poulet afin d'éviter le dessèchement. Soit des doses supplémentaires, soit du tampon doivent être réappliqués chaque jour. Lorsque l'œil de poulet est complètement développé, jusqu'à six échantillons différents peuvent être appliqués et leurs effets comparés sur un même œil de poulet. Des anneaux découpés dans une pointe de pipette d'un millilitre doivent être coupés aussi finement que possible afin de minimiser le poids et d'éviter l'indentation de l'œil de poulet.

L'anneau est ensuite appliqué sur le cam et les cellules sont pipetées dans l'anneau. Une seringue microlitrique Hamilton est rincée plusieurs fois avec de l'éthanol à 70 %, puis finalement avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile ou PBS. La microseringue est remplie avec une suspension cellulaire préparée, puis on pénètre soigneusement mais rapidement le cam et les couches de l'œil avec l'aiguille de la seringue, en injectant continuellement la suspension cellulaire. L'aiguille doit rester quelques secondes à l'intérieur de l'œil afin d'éviter une perte de la suspension cellulaire injectée par fuite. Vérifier à l'œuf X.

Des cultures d'œufs incubés pendant trois jours sont utilisées comme donneurs de bourgeons limbiques. L'embryon est disséqué à partir des vaisseaux vitellins connectés. En découpant un cercle, l'embryon est transféré dans une boîte de Pétri remplie de PBS stérile et froid à l’aide d’une petite cuillère égouttoir et lavé par agitation.

L'embryon est ensuite transféré dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de PBS stérile et libéré des membranes environnantes en les déchirant soigneusement à l’aide d’une pince fine. Les bourgeons des membres sont détachés à l’aide de la pince aussi près que possible du corps, saisis puis transférés sur l’albumen chorioallantoïque d’un poulet hôte âgé de huit à dix jours. Au site d’application souhaité, l’albumen chorioallantoïque est traumatrisé sélectivement par un léger raclage effectué avec une branche de la pince.

Ensuite, la greffe est saisie et disposée en couches sur la came avec l'autre morceau de la pince. La souris femelle sacrifiée est fixée sur une planche. La paroi abdominale est humidifiée avec de l'éthanol à 70 %, incisée le long de la ligne médiane et les lambeaux cutanés sont fixés latéralement à l'aide d'épingles.

L'utérus est retiré de l'abdomen, détaché et transféré dans un bécher contenant du PBS froid. Les membranes embryonnaires sont soigneusement retirées à l'aide de forceps à des fins de démonstration.

Un embryon de souris âgé de 16 jours est montré ici pour une meilleure visibilité des bourgeons des membres. Des résultats de greffe optimaux sont uniquement obtenus. Toutefois, si des bourgeons de membres provenant d'embryons âgés de 10 à 13 jours sont utilisés, les bourgeons des membres sont sectionnés ou l'utilisation de pinces fines est effectuée le plus près possible du corps.

Au site d'application souhaité, la membrane chorioallantoïdienne est traumatique sélectivement par un léger raclage avec une pince. Ensuite, les bourgeons des membres sont saisis et transférés sur la membrane chorioallantoïdienne d'un poulet hôte âgé de huit à dix jours. La greffe est placée une ou deux fois sur un côté de la membrane où aucune greffe définitive n'est prévue, afin d'éliminer l'excès de PBS.

Les greffons sont idéalement placés sur le cam près d'une bifurcation en Y d'un vaisseau sanguin tumoral. Les biopsies sont découpées en morceaux d'un à deux millimètres cubes à l'aide de scalpels stériles. Prélever du matériel à la surface de la biopsie augmente le risque de contamination par du muscle ou du tissu conjonctif.

Sur le site d'application souhaité, la membrane chorioallantoïque est traumatique de manière sélective par raclage doux. Un fragment prélevé au cœur de l'échantillon biopsique est greffé sur la membrane chorioallantoïque d'un poulet hôte âgé de huit à dix jours. Les greffons sont idéalement placés sur la membrane près d'une bifurcation en Y d'un vaisseau sanguin.

Le greffon est ensuite transféré sur la membrane chorioallantoïque avec un minimum de PBS. Une légère pression peut être appliquée pour positionner le greffon dans l'indentation résultante de la membrane chorioallantoïque. L'embryon de poulet hôte est sacrifié par décapitation.

Le CAM avec la greffe attachée est retiré par une incision circulaire et transféré dans une boîte de Pétri remplie de PBS. Le CAM excédentaire est coupé autour de la greffe, sauf au niveau du site d'ancrage initial. À nouveau au site d'application souhaité.

Le CAM d'un nouvel embryon de poussin hôte est traumatise sélectivement par un léger raclage, et la greffe est transférée sur le CAM du second hôte avec un minimum de PBS attaché. Nous venons de démontrer comment la culture CH X fonctionne réellement. Je vous ai montré les avantages par rapport aux expériences in ovo et je vous ai donné quelques exemples de ses applications.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.