Préparation d'embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

Cette vidéo explique comment effectuer la microscopie électronique à transmission, également connue sous le nom de TEM sur le chariot embryonnaire de drosophile. Le cœur est devenu un système modèle précieux pour l’étude de la migration cellulaire, de l’adhésion cellulaire et des changements de forme cellulaire. Cette technique permet de visualiser la forme de la lumière cardiaque, ainsi que des composants ultra-structurels tels que les membranes cellulaires, les jonctions cellulaires et la membrane basale.

Pour commencer cette procédure, une solution de fixation appropriée pour la microscopie électronique à transmission d’embryons de drosophile est préparée. Ensuite, une collection de 0 à 20 heures d’embryons enrobés est placée dans la solution de fixation. Une fois terminés, les embryons sont retirés de la solution de fixation et maintenus à portée de main tout en étant attachés à du ruban adhésif double face.

Dans une boîte de Pétri contenant un tampon, des embryons désionisés flottent dans le tampon et sont récupérés à l’aide d’une pipette. Ensuite, les embryons sont postfixés et subissent un gradient de déshydratation. Une fois infiltrés de résine, ils sont transférés dans un moule d’enrobage où ils sont alignés.

Le bloc résultant est coupé avec un couteau diamanté. Les sections sont prélevées sur des grilles de cuivre, colorées et examinées. Bonjour, je m’appelle Nadine Lop et je travaille dans le laboratoire de Sunita Kramer au Département de pathologie et de médecine de laboratoire de l’Université de médecine et de dentisterie du New Jersey à la Robert Wood Johnson Medical School.

Je m’appelle Raj Patel. Je suis le microscopiste électronique également de la pathologie PON. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de préparation et d’imagerie des embryons oph pour la microscopie électronique à transmission.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la morphogenèse cardiaque de la drosophile. Alors, commençons. Démarrer.

Avant de manipuler les embryons de drosophile, préparez fraîchement une solution fixatrice pour la méthode de perméation de l’heptane. Dans une hotte, pipetez deux millilitres d’une solution fraîchement préparée contenant 12,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon Cate dans un flacon à scintillation en verre. Ajoutez huit millilitres d’heptane ADA et agitez vigoureusement.

Attendez ensuite une minute. En permettant aux deux phases de se séparer, la phase supérieure contient l’heptane ADA, saturé de glutaraldéhyde, qui est la solution fixatrice. Pipetez la phase supérieure dans un flacon propre et mettez-le de côté Pour recueillir des embryons de zéro à 20 heures, utilisez une chambre de collecte d’embryons, qui est un petit panier avec un insert en maille amovible.

Commencez par retirer la plaque de jus de raisin contenant les embryons et retirez les mouches mortes. Puis à l’aide d’eau et d’un pinceau. Détachez les embryons de la plaque de jus de raisin, transférez les embryons dans la chambre de collecte des embryons à l’aide d’une bouteille carrée contenant de l’eau.

Rincez les embryons de tout excès de levure de la plaque de jus de raisin. Retirez la membrane externe en trempant les embryons dans une solution d’eau de Javel à 50 % pendant deux à trois minutes ou jusqu’à ce que les embryons flottent à la surface. Rincez abondamment à l’eau distillée et floraison les embryons sur une serviette en papier.

À l’aide d’une pince, ramassez l’insert en maille, qui doit maintenant être recouvert d’embryons enrobés. Placez l’insert dans le fixateur, permettant aux embryons de tomber du filet. Laissez les embryons se fixer pendant une heure et demie à quatre degrés Celsius tout en les mélangeant sur une bascule orbitale.

Une fois l’incubation terminée, placez les embryons dans une boîte de Pétri recouverte de ruban adhésif double face en prenant le moins de fixateur possible. Secouez le plat pour étaler les embryons en une seule couche, puis placez-le dans le capot chimique pour permettre à l’heptane de s’évaporer. Une fois les embryons secs, recouvrez les embryons d’un tampon contenant 0,1 % de vis à la main.

16 embryons à un stade avancé sous un microscope de dissection avec une aiguille de tungstène émoussée. Les embryons qui ont été séchés, flottent et peuvent être récupérés à l’aide d’une pipette de pâturage et transfèrent les embryons dans un tube de micro-fuge de 1,5 millilitre. Rincer les embryons dans un tampon de 0,1 molaire, puis postfixer dans du tétroxyde d’osmium à 1 % pendant une heure à température ambiante.

Après l’incubation, rincez les embryons avec le tampon Cate. Encore une fois, déshydratez les embryons dans une série de grades d’éthanol et d’acétone. Commencez avec 50 % d’éthanol pendant 10 minutes, puis avec 70 % d’éthanol pendant 10 minutes, puis déshydratez avec de l’acétone à 90 % pendant 10 minutes, et enfin par étapes de 10 % d’acétone de 10 minutes chacune.

Retirez l’acétone. Commencez le processus d’infiltration en ajoutant un mélange individuel de résine ein spray et d’acétone. Assurez-vous que l’échantillon est sous pression sous vide et passez au micro-ondes pendant trois minutes.

Maintenez la pression de vide pendant cinq minutes supplémentaires. Remplacez le mélange de résine acétone par 100 % de résine et passez à nouveau au micro-ondes sous pression sous vide. Remplacez la résine et le micro-ondes sous pression.

Une dernière fois pour un total de trois étapes d’infiltration. Transférez les embryons du tube de micro-fuge dans un moule d’enrobage en silicone. Alignez les embryons en une rangée de sorte que l’extrémité postérieure de l’embryon s’aligne avec le bord effilé du moule.

Le bacon est à 70 degrés Celsius au four pendant la nuit. Retirez ensuite le bloc résultant pour le sectionnement. Utilisez un microtome pour couper des sections d’un micromètre dans les embryons.

Une fois que le bloc a été sectionné et que l’embryon a été atteint, utilisez une boucle pour déplacer une seule section sur une lame de verre afin de déterminer si la profondeur appropriée pour visualiser le cœur a été atteinte avant la visualisation. Chauffez brièvement la section sur une plaque chauffante et teignez la section avec du bleu de méthylène en ajoutant d’abord une goutte à la lame. Et puis brièvement le chauffage.

Encore une fois, rincez à l’eau déminéralisée et examinez la section au microscope à la profondeur de coupe souhaitée. La lumière du cœur doit être reconnaissable au microscope optique pour répondre aux contraintes d’espace. Coupez à nouveau le bloc pour inclure un maximum de cinq embryons en coupe transversale qui montrent le cœur embryonnaire.

Coupez des sections de 90 nanomètres à l’aide du microtome. Prélevez plusieurs sections sur une grille en cuivre. Teignez la grille avec de l’acétate à 3 % d’aluminium pendant 10 minutes, puis rincez trois fois à l’eau distillée.

Maintenant, colorez la grille avec du citrate de plomb pendant deux minutes et demie dans une chambre contenant des pastilles d’hydroxyde de sodium pour créer un environnement sans dioxyde de carbone. Après l’incubation, rincez trois fois à l’eau distillée. Examinez les sections avec un microscope électronique à 80 kilovolts et photographiez avec une caméra CCD.

Afin de déterminer si la profondeur de la section et la stadification ont été correctement effectuées, il devrait être évident qu’une lumière cardiaque mature s’est formée entre les deux blastes cardio de la ligne médiane dorsale pour déterminer si les membranes cellulaires sont intactes, examiner la lumière cardiaque pour détecter la présence de matrice extracellulaire et rechercher la présence de Christie et de mitochondries. Nous venons donc de vous montrer comment déterminer l’ultra structure du cœur embryonnaire de la drosophile. Lors de cette procédure.

Il est important de se rappeler de bien stadifier les embryons de drosophile et de mesurer avec précision les composants de la résine et de bien les mélanger. Alors merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.