Préparation d'embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

Ce vidéo explique comment réaliser une microscopie électronique en transmission, également connue sous le nom de MET, sur le cartilage embryonnaire de drosophile. Le cœur s'est imposé comme un système modèle précieux pour l'étude de la migration cellulaire, de l'adhésion entre cellules et des changements de forme cellulaire. Cette technique permet de visualiser la morphologie de la lumière cardiaque ainsi que des composants ultrastructuraux tels que les membranes cellulaires, les jonctions intercellulaires et la membrane basale.

Pour commencer cette procédure, on prépare une solution de fixation adaptée à la microscopie électronique en transmission d'embryons de drosophile. Ensuite, une collecte d'embryons recouverts âgés de zéro à 20 heures est placée dans la solution de fixation. Une fois terminée, les embryons sont retirés de la solution de fixation et manipulés tout en restant fixés sur du ruban adhésif double face.

Dans une boîte de Pétri contenant un tampon, les embryons déionisés flottent dans le tampon et sont récupérés à l’aide d’une pipette. Ensuite, les embryons sont post-fixés et subissent un gradient de déshydratation. Une fois infiltrés avec de la résine, ils sont transférés dans un moule d’inclusion où ils sont alignés.

Le bloc obtenu est coupé avec un couteau en diamant. Les sections sont prélevées sur des grilles en cuivre, colorées et examinées. Bonjour, je suis Nadine Lop du laboratoire de Sunita Kramer, Département d'anatomie pathologique et de médecine de laboratoire à l'Université de médecine et de dentisterie du New Jersey à l'École de médecine Robert Wood Johnson.

Je suis Raj Patel. Je suis microscopiste électronicien, également issu de la pathologie PON. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour préparer et imager des embryons oph pour la microscopie électronique en transmission.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la morphogenèse cardiaque de Drosophila. Commençons donc. Commençons.

Avant de manipuler les embryons de drosophile, préparez fraîchement la solution de fixateur pour la méthode de fixation des embryons par perméabilisation à l'heptane. Dans une hotte, pipetez deux millilitres d'une solution fraîchement préparée contenant 12,5 % de glutaraldéhyde dans du tampon Cate dans un flacon en verre pour scintillation. Ajoutez huit millilitres d'heptane ADA et agitez vigoureusement.

Ensuite, attendez une minute. Laissez les deux phases se séparer ; la phase supérieure contient l'ADA heptane, saturée en glutaraldéhyde, qui constitue la solution fixative. Prélevez la phase supérieure à l’aide d’une pipette et mettez-la de côté. Pour collecter des embryons âgés de zéro à 20 heures, utilisez une chambre de collecte d’embryons, constituée d’un petit panier muni d’un insert amovible en maille.

Commencez par retirer la plaque de jus de raisin contenant les embryons et éliminer toutes les mouches mortes. Ensuite, à l'aide d'eau et d'un pinceau, détachez délicatement les embryons de la plaque de jus de raisin, puis transférez-les dans la chambre de collecte des embryons à l'aide d'une bouteille carrée contenant de l'eau.

Rincez les embryons pour éliminer toute levure excédentaire provenant de la plaque de jus de raisin. Retirez la membrane chorion externe en faisant tremper les embryons dans une solution d'eau de Javel à 50 % pendant deux à trois minutes, ou jusqu'à ce que les embryons remontent à la surface. Rincez soigneusement à l'eau distillée et déposez les embryons sur une serviette en papier.

À l’aide de pinces, prendre le support en treillis, qui doit maintenant être recouvert d’embryons enrobés. Placer le support dans le fixateur, en permettant aux embryons de tomber du treillis. Laisser fixer les embryons pendant une heure et demie à quatre degrés Celsius, sous agitation sur un berceau orbital.

Une fois l'incubation terminée, placer les embryons dans une boîte de Pétri recouverte de ruban adhésif double face en prenant le moins possible de fixatif. Agiter la boîte pour répartir les embryons en une seule couche, puis la placer sous la hotte chimique afin de laisser l'heptane s'évaporer. Une fois les embryons séchés, les recouvrir de tampon contenant du Tween 0,1 %.

Des embryons au stade tardif 16 sous un microscope stéréoscopique avec une aiguille en tungstène émoussée. Les embryons qui ont été fixés flottent et peuvent être récupérés avec une pipette Pasteur ; transférer les embryons dans un tube microfuge de 1,5 millilitre. Rincer les embryons dans un tampon au catéchol 0,1 molaire, puis les postfixer dans du tétraoxyde d'osmium à 1 % pendant une heure à température ambiante.

Après l'incubation, rincez les embryons avec du tampon Cate. Déshydratez à nouveau les embryons selon une série progressive d'éthanol et d'acétone. Commencez par 50 % d'éthanol pendant 10 minutes, suivi de 70 % d'éthanol pendant 10 minutes, puis déshydratez dans 90 % d'acétone pendant 10 minutes, et enfin dans deux bains d'acétone à 100 % de 10 minutes chacun.

Éliminer l'acétone. Commencer le processus d'infiltration en ajoutant un mélange un-à-un de résine ein spray et d'acétone. S'assurer que l'échantillon est sous pression de vide et faire chauffer au micro-ondes pendant trois minutes.

Conserver la pression sous vide pendant cinq minutes supplémentaires. Remplacer le mélange de résine et d'acétone par de la résine à 100 % et appliquer de nouveau un traitement au micro-ondes sous pression réduite. Effectuer un nouvel échange de la résine et appliquer un traitement au micro-ondes sous pression.

Une dernière fois, pour un total de trois étapes d'infiltration. Transférez les embryons du tube microfuge vers un moule d'encapsulation en silicone. Alignez les embryons en une rangée de sorte que l'extrémité postérieure de l'embryon soit alignée avec le bord effilé du moule.

Faites cuire le bacon à 70 degrés Celsius au four pendant toute la nuit. Ensuite, retirez le bloc obtenu pour la sectionnement. Utilisez un microtome pour découper des sections d'un micromètre dans les embryons.

Une fois que le bloc a été sectionné et que l'embryon a été atteint, utilisez une anse pour déplacer une section unique sur une lame de verre afin de déterminer si la profondeur adéquate pour visualiser le cœur a été obtenue avant la visualisation. Chauffez brièvement la section sur un bloc chauffant et coloriez-la au bleu de méthylène en ajoutant d'abord une goutte sur la lame, puis en chauffant brièvement.

De nouveau, rincez à l’eau déionisée et examinez la coupe au microscope à la profondeur de sectionnement souhaitée. La lumière cardiaque doit être reconnaissable au microscope optique afin de respecter les contraintes d’espace. Recoupez à nouveau le bloc pour inclure au maximum cinq embryons en coupe transversale montrant le cœur embryonnaire.

Coupez des sections de 90 nanomètres à l'aide du microtome. Ramassez plusieurs sections sur une grille en cuivre. Faites mariner la grille dans de l'acétate à 3 % pendant 10 minutes, puis rincez trois fois à l'eau distillée.

Colorer maintenant la grille avec du citrate de plomb pendant deux minutes et demie dans une chambre contenant des pastilles d'hydroxyde de sodium afin de créer un environnement exempt de dioxyde de carbone. Après l'incubation, rincer trois fois avec de l'eau distillée. Examiner les sections au microscope électronique à 80 kilovolts et prendre des photographies à l'aide d'une caméra CCD.

Afin de déterminer si la profondeur de sectionnement et le positionnement étaient correctement réalisés, il doit être évident qu'une lumière cardiaque mature s'est formée entre les deux cardioblastes de la ligne médiane dorsale. Pour déterminer si les membranes cellulaires sont intactes, examiner la lumière cardiaque à la recherche de matrice extracellulaire et rechercher la présence de corps de Christie et de mitochondries. Ainsi, nous venons de vous montrer comment déterminer l'ultrastructure du cœur embryonnaire de drosophile. Lorsque vous effectuez cette procédure.

Il est important de bien stager les embryons de drosophile et de mesurer précisément les composants de la résine en les mélangeant soigneusement. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.