Mesure des coefficients de diffusion par deux photons de récupération de fluorescence après photoblanchiment

La fluorescence multiphotonique. La récupération après la procédure de photoblanchiment est facilement démontrée avec un échantillon de molécules de colorant fluorescent en diffusion libre. Tout d’abord, un faisceau laser de faible intensité est envoyé dans l’échantillon pour générer un niveau de référence de fluorescence à partir des molécules D dans le volume focal du laser.

Ensuite, un bref flash laser de haute intensité est envoyé dans le photoblanchiment d’une partie des molécules de colorant dans le volume focal. Enfin, le faisceau laser est atténué au niveau de faible intensité précédent et la fluorescence est surveillée à mesure que les molécules photoblanchies diffusent vers l’extérieur et sont remplacées par des molécules encore fluorescentes provenant de l’extérieur du volume focal. La fluorescence résultante en fonction de la courbe de temps est analysée pour obtenir le coefficient de diffusion.

Bonjour, je m’appelle Kelly Sullivan et je travaille au laboratoire d’Edward Brown au département de génie biomédical de l’Université de Rochester. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment effectuer une récupération de fluorescence multiphotonique après un photoblanchiment. Nous utilisons cette technique dans notre laboratoire pour étudier la diffusion dans des systèmes biologiques in vitro et in vivo.

Alors commençons. Pour commencer, réglez la longueur d’onde laser souhaitée et insérez le filtre approprié devant le tube photomultiplicateur ou le PMT. Ensuite, pour éviter d’endommager la cellule pcal, ajustez la puissance du laser à 200 milliwatts ou moins.

Il y a deux miroirs orientés en forme de quatre en amont de la cellule pcal. Ces miroirs sont nécessaires et suffisants pour aligner le faisceau laser à travers la cellule pcal. Réglez le décalage de tension sur le contrôleur de polarisation de la cellule pcal sur zéro, ajustez le chemin du laser à travers la cellule pcal de sorte que le laser soit centré dans les fenêtres avant et arrière.

Utilisez le miroir en amont sur la figure quatre pour centrer le faisceau dans la fenêtre avant et le miroir en aval sur la figure quatre pour centrer le faisceau sur la fenêtre arrière. Réglez maintenant la tension aux bornes du cristal de la cellule pcal à la valeur maximale. La valeur appropriée dépend des longueurs d’onde et se trouve dans le manuel d’instructions de la pile pcal.

Ajustez les miroirs de la figure quatre en amont de la cellule pcal jusqu’à ce que la puissance de sortie de la cellule pcal soit maximisée. Maintenant, mettez la tension aux bornes du cristal à zéro et ajustez le décalage de tension sur le contrôleur de polarisation pour minimiser la puissance de sortie de la cellule pcal. Ramener la puissance laser incidente sur la cellule pcal à la valeur requise pour l’expérience.

Passons maintenant au microscope, obtenez une bonne mise au point visuelle sur un échantillon fluorescent standardisé. Ici, nous utilisons des grains de pollen fluorescents fixes. Une fois focalisé, scellez le microscope, ajustez la puissance laser à un niveau approprié pour l’imagerie de l’échantillon en modifiant la tension aux bornes du cristal de la cellule pcal.

Enfin, éteignez les lumières et allumez le PMT. Démarrez un balayage d’image répété de l’échantillon standardisé et ajustez les miroirs en aval de la cellule pcal jusqu’à ce qu’une image nette de l’échantillon soit obtenue. Voyons maintenant déterminer les puissances de moniteur sûres au sein de l’échantillon.

Pour les besoins de cette vidéo, nous utiliserons un échantillon de colorant aqueux maintenu dans une dépression dans une lame de verre et recouvert d’un lamelle. Atténuez le laser à une puissance faible mais raisonnable pour générer de la fluorescence dans l’échantillon. Scellez le microscope, déviez la sortie du PMT vers le compteur de photons.

Éteignez les lumières, allumez le PMT et lancez un balayage ponctuel sur le logiciel du microscope. Réglez le compteur de photons pour qu’il s’intègre sur une échelle de temps beaucoup plus longue que le temps de récupération de fluorescence prévu et enregistrez un nombre raisonnable de points de données. Augmentez la puissance et prenez une autre série de données de comptage de photons.

Continuez à augmenter la puissance jusqu’à ce que l’augmentation du nombre de photons semble diminuer de manière significative. Par rapport au graphique d’augmentation de puissance, le logarithme des photons compte en fonction du logarithme de puissance. Tout écart par rapport à une pente de deux indique un blanchiment.

Pendant le moniteur, sélectionnez une puissance de moniteur raisonnable qui est inférieure à cette coupure. Déterminez maintenant les paramètres d’entrée du scaler multicanal et du générateur d’impulsions. Sur le générateur d’impulsions.

Réglez le temps de pré-apprentissage pour qu’il soit une à deux fois plus grand que le temps de demi-récupération prévu et le temps de blanchiment pour qu’il soit un 10e du temps de demi-récupération prévu sur le détartreur. Réglez la largeur du bac à environ la moitié de la durée de l’eau de Javel et définissez le nombre de cellules par enregistrement, de sorte que le produit de la largeur de la cellule sélectionnée et des cellules par enregistrement soit supérieur à votre temps de récupération complet prévu. De plus, les temps de préble et de javellisation retournent au générateur d’impulsions et définissent la fréquence de la séquence de préble et d’eau de Javel égale à une valeur légèrement inférieure à l’inverse du produit de la largeur du bac multiplié par le nombre de bacs par enregistrement.

Enfin, définissez le nombre d’enregistrements par balayage sur le scaler en fonction de l’intensité du signal à la puissance du moniteur choisie. Réglez maintenant la puissance du moniteur à un niveau sûr et réglez la puissance de blanchiment à environ 200 milliwatts au-dessus de la limite de blanchiment déterminée lors du test de blanchiment du moniteur. Ces puissances sont toutes deux réglées comme des tensions différentes à travers le sceau cristallin de la cellule ale, le microscope éteint les lumières.

Allumez le PMT. Lancez un balayage ponctuel sur le logiciel d’imagerie. Démarrez ensuite le générateur d’impulsions et le détartreur.

Pour analyser la courbe de récupération qui en résulte, marquez trois points importants. La fluorescence préble, la fluorescence immédiatement après l’eau de Javel et la fluorescence à la fin de l’ensemble de données. Utilisez les valeurs de fluorescence avant et immédiatement après l’eau de Javel pour mieux estimer le temps de demi-récupération.

Maintenant, utilisez les règles décrites dans les étapes précédentes pour mettre à jour les valeurs de l’eau de Javel préliminaire et commencer les durées de largeur. Prenez une nouvelle courbe et continuez à ajuster les paramètres jusqu’à ce que la courbe résultante présente un fort blanchiment et une récupération en douceur. Vérifiez la saturation d’excitation en traçant le logarithme du paramètre de profondeur de blanchiment en fonction du logarithme de puissance.

Tout écart par rapport à une pente de deux indique une saturation d’excitation. Choisissez une puissance d’eau de Javel qui donne un javellisant fort mais ne provoque pas de saturation. Enfin, une fois les paramètres appropriés déterminés, continuez à prendre la récupération de fluorescence multiphotonique après photoblanchiment ou les courbes MP FP de votre échantillon d’intérêt.

Nous allons maintenant montrer des résultats représentatifs des deux données brutes de FRAP MP à une courbe d’enroulement MP F normalisée qui a été ajustée, le coefficient de diffusion, les données brutes de FRAP MP F, un fort blanchiment et une récupération en douceur. La récupération complète étant signalée pour la seconde moitié des données pour s’adapter aux données. Nous normalisons d’abord la récupération à la fluorescence préble moyenne, puis nous effectuons un ajustement non linéaire des carrés loués.

En ce qui concerne le modèle approprié. Les deux ensembles de données ont été pris dans la fluorescéine aqueuse et donnent des coefficients de diffusion. Conformément à la littérature, nous venons de vous montrer comment effectuer une récupération de fluorescence multiphotonique après une expérience de photoblanchiment.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de faire attention et de régler vos paramètres expérimentaux, en particulier la durée de l’eau de Javel et les pouvoirs de blanchiment et de surveillance aux limites de sécurité définies dans le protocole. Alors merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos expériences.