Dissection en direct de Drosophile Embryons: méthodes simplifiées pour le dépistage de collections de mutants par immunofluorescence

Nous voyons ici la procédure de collecte des embryons. Transférez les mouches des flacons dans les tubes d’une chambre de collecte à cinq barils. Ensuite, placez une assiette agricole de raisin sur le dessus de la chambre et laissez les mouches pondre des œufs pendant quelques heures.

Lorsque les embryons sont au bon stade, transférez-les de l’aate de raisin sur du ruban adhésif double avec un pinceau. Maintenant, roulez les embryons hors de leurs rangs et alignez-les sur un bloc de gélose avec leurs côtés ventraux. Au milieu, nous voyons une diapositive avec un rectangle de cire et un morceau de ruban adhésif double À une extrémité, retournez le ruban adhésif double sur le bloc avec les embryons alignés et touchez-le aux embryons pour les transférer sur la lame.

Ils seront maintenant immédiatement côté dorsal vers le haut. Ajoutez du PBS à la zone de la lame délimitée par le rectangle de cire de manière à couvrir les embryons. Le haut montre une vue latérale de la diapositive et le bas montre une vue de dessus.

Découpez une fente le long de la membrane vielle avec une aiguille de dissection en verre. Piquez les embryons dans la région du cerveau, soulevez-les et déplacez-les en rangées sur le verre. Disséquez ensuite chaque embryon pour en faire un filet.

À la fin de la procédure, vous aurez une lame avec des rangées d’embryons de filet. Il est maintenant prêt à être réparé. Bonjour, je suis Peter Lee, je suis un poster dans le laboratoire Kaizens de la division de biologie de Caltech.

Bonjour, je suis Ashley Wright, étudiante diplômée de Caltech au Kaizens Lab. Je m’appelle Kaizen, je suis professeur à Caltech, et mon groupe de recherche travaille sur le développement du système nerveux chez les mouches des fruits. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de dissection d’embryons d’opale vivants.

Nous avons utilisé ces méthodes pour rechercher des ligands de récepteurs orphelins. Pour ce faire, nous criblons des collections de lignées exprimant des protéines de surface cellulaire par coloration en direct d’embryons avec des protéines de fusion de récepteurs. Nous utilisons également cette procédure en laboratoire pour étudier les phénotypes embryonnaires et effectuer des dépistages génétiques.

J’ai effectué un dépistage de déficience pour les actes moteurs sur les phénotypes de guidage. Alors commençons. Peter va vous montrer comment faire.

Pour commencer, à l’aide d’une spatule, placez un point de pâte de levure sur une plaque de collecte d’œufs de raisin correspondant à chacun des fûts d’une chambre de collecte d’embryons. Ensuite, injectez du dioxyde de carbone dans les flacons de mouches pour endormir les mouches. Transférez quelques centaines de mouches directement dans la chambre de collecte.

Ensuite, couvrez la chambre avec la plaque de collecte des œufs et appuyez à l’aide d’une bande de ruban adhésif d’étiquetage de 20 pouces de long, attachez la chambre et la plaque ensemble en commençant par le milieu de la plaque de gélose. Le ruban se chevauchera sur la plaque de collecte des œufs. Après le réveil des mouches, incubez à température ambiante dans l’obscurité pendant deux ou trois heures en position horizontale après l’incubation, tapotez les mouches et replacez la plaque de collecte.

Si moins de 100 embryons sont présents sur chaque secteur de la plaque retirée. Continuez à effectuer des prélèvements de deux heures jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’embryons aient été collectés. Les embryons collectés peuvent être regroupés selon les spécifications du protocole écrit qui l’accompagne.

Pour faire vieillir les embryons, placez un morceau humide de papier filtre circulaire de 90 millimètres dans le couvercle d’une boîte de Pétri et placez la plaque de collecte avec les embryons à l’envers dessus. Incuber la plaque pendant la durée et à la température souhaitées, préparer une lame pour la stadification et le tri des embryons en plaçant du ruban adhésif double face sur une lame. Placez ensuite une plaque rectangulaire de gélose à raisin sur la lame en S.

L’œuf doit être assez grand pour contenir cinq à 10 rangées de 10 à 15 embryons. Une fois que les embryons ont atteint le stade souhaité, retirez-les de l’incubateur. Transférez les embryons âgés de la plaque de collecte sur le ruban adhésif double face.

À l’aide d’un pinceau humide, répartissez uniformément les embryons sur le ruban. Sous un microscope de dissection GFP, SOAR des embryons pour une expression GFP appropriée, ce qui indique le génotype. Dans cette expérience, le génotypage est effectué en sélectionnant des embryons qui n’expriment pas le bras bouclé équilibreur, GFP.

Étant donné que le génotypage de l’embryon varie en fonction de l’équilibreur utilisé, veuillez vous référer au protocole écrit ci-joint pour plus d’informations sur la réalisation de cette opération. Pas. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de dissection émoussée, enrobez les embryons en les faisant rouler doucement sur le ruban adhésif double face. Au stade 16, l’intestin s’est divisé en trois bandes.

Après cela, l’intestin commence à développer des bandes diagonales près de la queue, puis s’enroule et l’embryon devient plus clair. Ensuite, utilisez l’aiguille de dissection pour rouler chaque embryon sur le corion ou d’autres embryons. En évitant tout contact avec le ruban, soulevez l’embryon et transférez-le sur la plaque de gélose de raisin.

Alignez les embryons enrobés sur cette dalle avec leurs côtés dorsaux contre la plaque de gélose et les extrémités postérieures vers le bas. Placez ensuite la lame dans une boîte de Pétri avec du papier filtre humide et incubez les embryons à température ambiante jusqu’à ce qu’ils atteignent l’âge souhaité. Pour la dissection, préparez une lame pour la dissection en direct en coupant un petit morceau rectangulaire de ruban adhésif double face. Placez le ruban près d’une extrémité d’une diapositive super frost plus à l’aide d’un stylo à cire.

Dessinez un rectangle de la largeur de la diapositive et de 30 à 40 millimètres de long autour du ruban. Il doit y avoir environ trois millimètres d’espace entre la cire et le ruban. Transférez ensuite les embryons de la grande plaque sur le ruban en inversant la lame et en l’abaissant doucement sur les embryons alignés afin que le ruban entre en contact avec eux.

Les embryons doivent être orientés avec les extrémités postérieures vers le bas. Après le transfert, les embryons seront positionnés côté dorsal vers le haut sur la lame, ajoutez immédiatement un XPBS sur les embryons pour remplir le rectangle de cire à l’aide d’une aiguille de dissection en verre, qui est faite sur un extracteur d’aiguille comme une aiguille d’injection. Coupez le long de la ligne médiane dorsale à partir de l’extrémité postérieure de l’embryon.

Maintenant, piquez l’extrémité antérieure de l’embryon et soulevez-le. En commençant par le bas, transférez l’embryon à droite de la bande de ruban, en le gardant dans le tampon. Continuez à disséquer et à transférer les embryons, en faisant une rangée ordonnée d’embryons sur la lame qui correspond à chaque rangée de la dalle agricole.

À l’aide de l’aiguille de dissection, enfoncez doucement les rabats de la paroi corporelle sur la lame. Éviter d’étirer ou d’enlever de la matière de leur surface. L’aiguille ne doit entrer en contact qu’avec les coins antérieurs et postérieurs des bords dorsaux de la paroi corporelle.

Puisque les axones moteurs ne s’étendent pas aussi loin. Sur le plan dorsal, évitez de toucher les aiguilles de la lame car elle se brisera une fois que tous les embryons auront été transférés et fixés sur la lame. Retirez l’intestin de chaque embryon en séparant les quatre intestins de la zone du cerveau et en retirant tout l’intestin de l’embryon.

Déplacez l’intestin postérieur sur la glissière. Une fois toutes les dissections terminées, utilisez deux pipettes passées pour administrer simultanément du formaldéhyde à température ambiante à 5 % dans un coin de la cire, un rectangle et prélever la solution dans le coin opposé. Remplacez la solution fixatrice trois fois en utilisant un volume total d’environ six millilitres.

Incuber les embryons dans la solution fixatrice pendant 45 minutes. Il est très important de ne pas laisser le ménisque entrer en contact avec les embryons car cela les détruirait. Utilisez un passage de votre pipette pour retirer la majeure partie de la solution fixatrice.

Laver avec PB S3 fois à l’aide de la méthode de la pipette à deux pâturages. Ensuite, lavez trois fois avec du PBT pour perme les embryons. Cette étape rend également les embryons moins sensibles au ménisque.

Après le lavage final, retirez délicatement le PBT en inclinant la lame et touchez brièvement une lingette Kim sur le coin de la zone délimitée par la cire pour éliminer l’excès de solution. À l’aide d’un manchon de pipette préchargé, ajoutez immédiatement 200 microlitres de bloc de solution de blocage pendant 10 à 30 minutes. À température ambiante, retirez la solution de blocage à l’aide d’une lingette Kim

Ajoutez ensuite immédiatement 200 microlitres de l’anticorps primaire souhaité dilué dans une solution bloquante. Placez la lame dans une plaque humidifiée et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Dans cette expérience, l’anticorps monoclonal 1D four est utilisé pour marquer les axones moteurs.

Le lendemain, retirez la vaisselle à quatre degrés Celsius et lavez les embryons trois fois sur une plate-forme à bascule avec PBT pendant au moins 15 minutes par lavage. Pour toutes les étapes de lavage, assurez-vous qu’il y a suffisamment de PBT pour immerger complètement la diapositive pendant le balancement. Une fois les embryons lavés, bloquez la lame comme précédemment.

Après le blocage, ajoutez immédiatement 200 microlitres d’anticorps secondaires et de solution bloquante et incubez deux heures à température ambiante ici un Alexa 4 88 aller anti-US. Le secondaire est utilisé en conjonction avec Rodine Phin pour marquer les fibres musculaires. Encore une fois, lavez trois fois avec du PBT sur la plate-forme à bascule pendant au moins 15 minutes par lavage.

Transférez les lames dans un autre plateau pour éliminer les résidus de détergent. Ensuite, lavez deux fois avec du PBS pendant cinq minutes. Retirez la lame du graphique PBS, la majeure partie du PBS restant du puits avec une lingette chimique, et ajoutez immédiatement 500 microlitres de glycérol à 70 %.

Étant donné que le glycérol a le même indice de réfraction que l’embryon, effectuer cette étape rendra la coloration plus visible, nettoyez les embryons pendant deux heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Retirez ensuite le glycérol avec une lingette kim. L’élimination de presque tout le glycérol aplatira les embryons, tandis que l’élimination de moins de glycérol entraînera une structure plus tridimensionnelle.

Une fois le glycérol éliminé, mettez une gaine numéro un. Les embryons sont prêts pour l’imagerie, les embryons disséqués et colorés peuvent être visualisés par microscopie d’immunofluorescence. Ici, un embryon disséqué a été coloré avec l’anticorps de marquage de l’axone moteur 1D quatre.

Cette image est similaire en apparence aux images plus courantes dans lesquelles l’immunohistochimie HRP a été utilisée pour la visualisation à l’aide de l’immunofluorescence. Il est possible d’obtenir des images de meilleure qualité dans lesquelles les détails des branches de l’axone moteur sont plus clairement visibles. La coloration avec du phin marqué rho domine, qui lie l’actine, permet une visualisation simultanée des muscles.

Cela donne une image plus claire de la stratification et de l’organisation musculaires qui peuvent être obtenues avec la coloration HRP Ici, 1D quatre ou axones moteurs sont représentés en vert Fein ou le muscle est représenté en rouge. Nous venons de démontrer comment disséquer des embryons de drosophile vivants à partir de collections de lignées mutantes. Lorsque vous effectuez ces procédures, il est important de commencer avec des lignes faciles comme le lio, le tatou, le GFP, les actions équilibrées, et de faire quelques lignes à la fois.

Au fur et à mesure que vous devenez plus expert et plus rapide avec les dissections, vous pouvez faire jusqu’à 10 lignes par jour, ce qui vous permettra de dépister une collection d’environ 200 lignes mutantes sur une période d’environ 20 jours. Il s’agit donc d’une procédure très efficace une fois que vous devenez expert dans l’exécution de toutes les étapes. Voilà, et merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos expériences.