Name: Lensless sur puce imagerie de cellules fournit un nouvel outil pour le haut débit de biologie cellulaire et le diagnostic médical (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Découvrez l'imagerie sans lentille sur puce avec la plateforme Lucas pour la biologie cellulaire à haut débit et le diagnostic médical. Cette méthode compacte et économique capture des hologrammes numériques de cellules sans objectif microscopique.

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Ici, nous discutons des procédures expérimentales qui sont impliqués dans LUCAS [1-3]. Pour illustrer la preuve de concept de LUCAS, nous allons décrire le processus d'imagerie pour un échantillon de sang total. A. Mise en place d'imagerie La plate-forme d'imagerie LUCAS présente des avantages significatifs pour fournir une alternative rentable et compacte pour les systèmes point-of-care cytométrie et instruments de diagnostic médical, notamment pour les ressources limitées. Plutôt que de détecter l'image des cellules, LUCAS capture au lieu d'hologrammes numériques des cellules qui sont créés par l'interférence de la lumière diffusée à partir de chaque cellule avec la lumière de fond. Un contrôle minutieux de la cohérence spatiale partielle de l'éclairage est essentiel pour permettre l'enregistrement holographique. 1. Réseau de capteurs numériques La plateforme utilise un tableau LUCAS capteurs optoélectroniques à enregistrer numériquement des hologrammes cellule individuelle. À cette fin, chargé des dispositifs couple (CCD; Sample Models: KAI-11002, KAF-39000, de Kodak) ou Complementary metal-oxyde-semiconducteur puces (CMOS, modèle de l'échantillon: MT9P031, Micron) peuvent être utilisés. Les tailles des pixels pour les appareils Kodak chargée couple, KAI-11002, KAF-39000, et les capteurs d'image CMOS Micron sont 9 um, um 6,8 et 2,2 um, avec un actif FOV de 10 cm2, 18 cm2, et 24,4 mm2, respectivement. [1-2]. 2. Source de lumière Contrairement à la plupart des autres modalités d'imagerie microscopique, LUCAS n'a pas besoin d'un laser, et donc même une simple diode électroluminescente (DEL) peut être utilisé pour l'éclairage. Afin de permettre l'éclairage de longueur d'onde accordable, nous pouvons aussi utiliser un monochromateur avec une lampe au xénon (Cornerstone T260, Newport Corp) avec une fibre en silice fondue de qualité standard qui se compose d'un faisceau de fibres (77 564, Newport) et sténopé de ~ 100 pm de diamètre situé à ~ 5-10 cm au-dessus de la surface du capteur. Cette configuration longueur d'onde accordable l'éclairage fournit une plateforme flexible où les signatures holographique des cellules peut être ajusté, et les signatures numériques hybrides peuvent être synthétisés afin d'améliorer le rapport signal sur bruit pour une meilleure précision de la caractérisation et la spécificité. [3] Préparation d'échantillons B. et imagerie Une preuve de concept de LUCAS basée sur la puce d'imagerie sera démontrée en utilisant une solution hétérogène tel que décrit ci-dessous. Un protocole similaire pourrait être appliquée pour divers autres types de cellules [1-3]. 1. Dilution de sang total et de préparation de la solution hétérogène <ol><li> Pour commencer le processus, d'obtenir un échantillon de sang total et les microbilles de polystyrène de différents diamètres (um 5, 10 et 20. Duke Scientific), et amener tous à température ambiante. </li><li> Ajouter 2 mL de milieu RPMI 1640 liquides classiques (Fisher Scientific) comme diluant dans un tube en polypropylène stériles de 5 ml. </li><li> Après une incubation de l'échantillon de sang total pendant 30 minutes, une pipette en hausse de 10 uL d'échantillon des érythrocytes sédimentés et le transférer dans la solution RPMI. </li><li> Ajouter un volume total de 20 microbilles en polystyrène uL dans du RPMI de dilution des érythrocytes, et agiter la solution de cellules par pipetage douceur ou en utilisant un agitateur magnétique avec un agitateur. </li><li> Placer un volume total de 5-15 uL solution hétérogène sur une lamelle et placer une seconde lamelle identique sur la solution en utilisant une pince. L'échantillon doit être pris en sandwich entre les deux lamelles uniformément. </li><li> Puis, en utilisant un stylo vide (NT57-636, Edmund Optics) charge l'échantillon dans la région active du réseau de capteurs pour l'imagerie. </li></ol> 2. Coloration du sang total <ol><li> En commençant par la préparation d'un mélange de 0,1% tamponné éosine Y et une solution diluée de méthylène Nouveau en utilisant la puissance type pur éosine Y (MW = 691,85, Acros Organics), sans zinc pur Nouveau Bleu de Méthylène colorant (MW = 347,90, Acros Organics), et oxalate de potassium (ACS Réactif 99,0%, Acros Organics), chaque solution est purifiée avec une taille de pores 0,45 pm Syringless filtre (Whatman) pour coloration aqueuse de globules blancs. </li><li> Ensuite, incorporer délicatement un réactif dissous coloration aqueuse à l'échantillon de sang total à un rapport de volume de 1:1 dans un bécher en polypropylène en utilisant un agitateur magnétique pendant 2 minutes et laisser incuber pendant 10 minutes. </li><li> Transfert d'une solution tachés de sang de 50 uL dans un tube en polypropylène 5 ml et diluer avec du RPMI 1640 solution liquide classique (Fisher Scientific) de 1,95 mL d'acquérir un rapport de volume de 1:200. Puis, la dilution de vortex pendant 30 secondes. Un taux de dilution différents peuvent également être introduits à ce stade. </li><li> Pipeter une solution cellulaire teinté de 10-100 uL entre les lamelles ou dans un réservoir microfluidique. Puis, en utilisant un stylo vide (NT57-636, Edmund Optics), placer l'échantillon sur la zone active de la matrice de capteurs. </li></ol> Les résultats représentatifs ve_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: LUCAS permet un comptage précis et la différenciation des cellules numériques diverses et les micro-objets en fonction de leurs signatures 2D holographique sans utiliser de lentilles, de lasers ou d'autres composants optiques encombrants. Caractéristique signatures LUCAS de divers micro-objets sont illustrés dans cette figure et sont comparées à une image au microscope classique obtenu avec un objectif 40X. S'il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1650/1650Fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: (gauche) Image brute d'un mélange hétérogène contenant des globules rouges, 10um, 5um et 3 particules um. (Droite) entièrement automatisée des résultats de caractérisation LUCAS pour le même champ de vue sont illustrés. Notez que l'algorithme de décision est robuste dans la caractérisation des régions à haute densité ainsi que des particules de faible rapport signal à bruit tel que les perles 3um. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig3tmb.jpg" alt="Figure 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: L'interface personnalisée LUCAS est illustré. Basé sur Java LUCAS logiciel permet des entrées pour différentes conditions expérimentales telles que la taille des pixels du capteur ou de la longueur d'onde de la lumière. Sélection d'un champ de vue spécifique sur l'image peut également être faite et les modèles de cellules cibles peuvent être définies par l'utilisateur de construire une bibliothèque de cellules statistiques ombre. L'image acquise LUCAS peut alors être caractérisée basées sur ces données de formation (par exemple, la bibliothèque de cellules d'ombre) et la marque (comptés) l'image est affichée à l'utilisateur. Statistiques des résultats de comptage sont également stockés dans un fichier XML pour une analyse ultérieure.

<ol><li>Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Lensfree+Holographic+Imaging+for+On-Chip+Cytometry+and+Diagnostics%22%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">"Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics".</a> Lab Chip. , (2009).</li>
<li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22High-throughput+Imaging+and+Characterization+of+a+Heterogeneous+Cell+Solution+on+a+Chip%22+%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">"High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" .</a> Biotechnology and Bioengineering. , (2008).</li>
<li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Multi-color+LUCAS%3A+Lensfree+on-chip+cytometry+using+tunable+monochromatic+illumination+and+digital+noise+reduction%22%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">"Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction".</a> Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).</li>
</ol>

Nous avons montré que la plate-forme LUCAS peut dénombrer et identifier précisément micro-objects/cells différentes sur une puce basée sur leurs signatures holographique, et fournit un outil prometteur pour le point-of-care diagnostic médical et à haut débit de biologie cellulaire. Afin de traiter avec exactitude les tendances enregistrées holographique, nous avons implémenté un logiciel personnalisé développé décision LUCAS. Cet algorithme, qui utilise une base de données de diffraction statistiques image créée par la ...

<table><tbody><tr><td>Dispositif à couplage de charge (CCD)</td><td>KODAK</td><td>KAI-11002</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif à couplage de charge (CCD)</td><td>KODAK</td><td>KAF-39000</td><td></td></tr><tr><td>Complémentaire métal-oxyde-semiconducteur (CMOS)</td><td>Micron</td><td>MT9P031</td><td></td></tr><tr><td>Lampe au xénon</td><td>Newport Corp.</td><td>Cornerstone T260</td><td></td></tr><tr><td>Stylo à vide</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT57-636</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles de 5, 10 et 20 &amp;mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4000 Series</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>1640</td><td></td></tr><tr><td>Éosine Y pure</td><td>Acros Organics</td><td>MW=691.85</td><td></td></tr><tr><td>Colorant bleu de méthylène nouveau (NMB)</td><td>Acros Organics</td><td>MW=347.90</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrate d'oxalate de potassium</td><td>Acros Organics</td><td>99,0 % réactif ACS</td><td></td></tr></tbody></table>

lensless sur puce imagerie de cellules fournit un nouvel outil pour le haut débit de biologie cellulaire et le diagnostic médical

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Microscopes optiques conventionnelles cellules d&#39;image par l&#39;utilisation de lentilles de l&#39;objectif qui travaillent ensemble avec les autres lentilles et des composants optiques. Bien qu&#39;assez efficace, cette approche classique a certaines limites de la miniaturisation de la plateforme d&#39;imagerie pour le rendre compatible avec l&#39;état avancé de l&#39;art en microfluidique. Dans ce rapport, nous présentons les détails expérimentaux d&#39;un concept d&#39;imagerie sur puce sans lentille appelée LUCAS (<strong<em&gt; L</em</strong&gt; Ensless<strong<em&gt; U</em</strong&gt; Ltra-large champ de vision<strong<em&gt; C</em</strongSurveillance ell&gt;<strong<em&gt; Une</em</strong&gt; Plate-forme basée sur rray<strong<em&gt; S</em</strong&gt; Hadow imagerie) qui ne nécessite pas d&#39;objectifs de microscope ou d&#39;autres composants optiques encombrants à l&#39;image d&#39;une solution de cellules hétérogènes sur un champ ultra-large de vue qui peut durer aussi grand que ~ 18 cm<sup&gt; 2</sup&gt;. En outre, contrairement microscopes classiques, LUCAS peut l&#39;image d&#39;une solution cellulaire hétérogène d&#39;intérêts sur une profondeur de champ d&#39;environ 5 mm sans la nécessité d&#39;un recentrage qui correspond à à ~ 9 ml volume d&#39;échantillon. Cette plate-forme d&#39;imagerie enregistre les ombres (c&#39;est à dire, sans lentille hologrammes numériques) de chaque cellule d&#39;intérêt dans son champ de vision, et automatisé de traitement numérique de ces ombres de cellule peut déterminer le type, le comte et la position relative des cellules dans la solution. Parce qu&#39;il ne nécessite aucun composant encombrant optique ou mécanique phases de numérisation il offre une plate-forme de manière significative miniaturisés qui dans le même temps réduit les coûts, ce qui est assez important pour en particulier point de service des outils de diagnostic. Par ailleurs, le débit d&#39;imagerie de cette plateforme est de plusieurs ordres de grandeur meilleure que microscopes optiques conventionnels, ce qui pourrait être extrêmement précieux pour les haut-débit expériences de biologie cellulaire.

Lensfree sur puce d&#39;imagerie et de caractérisation des cellules est illustré. Cette approche sur-puce d&#39;imagerie cellulaire fournit un outil compact et rentable pour le diagnostic médical et applications à haut débit biologie cellulaire, ce qui rend particulièrement adapté aux milieux pauvres en ressources.

Lensless sur puce imagerie de cellules fournit un nouvel outil pour le haut débit de biologie cellulaire et le diagnostic médical

Les microscopes optiques conventionnels permettent d'imager des cellules grâce à l'utilisation d'objectifs qui fonctionnent conjointement avec d'autres lentilles et composants optiques. Bien que tout à fait...

Dans cette vidéo, on démontre le principe de fonctionnement d'une imagerie sur puce utilisant une liste de lentilles appelée Lucas. Lucas est l'acronyme de « lens list ultra wide field of view cell monitoring array platform based on shadow imaging ». Contrairement aux dispositifs d'imagerie classiques, la plateforme Lucas ne nécessite aucun objectif de microscope ni aucun autre composant optique encombrant.Pour Lucas, l'échantillon d'intérêt est placé sur une lame de microscope et délicatement pris en sandwich par un couvre-objet identique. À l'aide d'un stylo à vide, l'échantillon est chargé sur la zone active du réseau de capteurs optoélectroniques. La plateforme d'imagerie enregistre alors les ombres ou les hologrammes numériques en liste de lentilles de chaque cellule d'intérêt située dans son champ de vision.Le traitement numérique automatisé de ces ombres cellulaires permet de déterminer le type, le nombre et les positions relatives des cellules présentes dans la solution. Le champ de vision peut atteindre jusqu'à 18 centimètres carrés, avec une profondeur de champ d'environ cinq millimètres. Les images de diffraction obtenues sont ensuite traitées numériquement par un algorithme décisionnel sur mesure, permettant à la fois la caractérisation et l'identification de cellules ou de particules cibles.Lucas propose une plateforme miniaturisée qui réduit les coûts et augmente considérablement le débit pour les expériences basées sur l'imagerie, la rendant compatible avec les technologies avancées de pointe en microfluidique et en recherche biologique. Bonjour, je suis du laboratoire ROM Bio et Nano du département de génie électrique de l'Université de Californie à Los Angeles, et je suis Anthony Erlinger, également du laboratoire de nanophotonique et de biophotonique. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour l'imagerie à haut débit et sans lentille d'une solution d'acide nucléique hétérogène, telle qu'un échantillon de sang total.Cette procédure dans notre laboratoire utilise une technique d'imagerie nouvelle, que nous appelons plateforme de surveillance d'arrays cellulaires à très grand champ basée sur l'imagerie par ombre, que nous abrégeons en Lucas. Commençons donc. Pour démarrer le processus, récupérez trois millilitres de sang total et des microbilles en polystyrène de différents diamètres, tels que cinq, 10 et 20 micromètres, puis portez-les à température ambiante pendant 30 minutes.À l’aide d’une pipette serologique, ajoutez deux millilitres de milieu liquide classique RPMI 1640 comme diluant dans un tube en polypropylène stérile de cinq millilitres. Après une période de sédimentation de 30 minutes, prélèvez 10 microlitres d’échantillon d’érythrocytes depuis le fond du tube de prélèvement sanguin total et transférez-les dans la solution RPMI. Ajoutez un volume total de 20 microlitres de microbilles en polystyrène à la dilution d’érythrocytes dans le RPMI et agitez la solution cellulaire en pipetant doucement. Transférez cinq à 15 microlitres de la solution hétérogène sur un lamelle à l’aide de pinces.Placer une deuxième lame de couverture identique sur la solution. L'échantillon doit être uniformément pris en sandwich entre les deux lames de couverture. Ensuite, à l'aide d'un stylo à vide, charger l'échantillon sur la région active du réseau de capteurs pour l'acquisition d'images.Ensuite, préparez le réactif de coloration aqueux en combinant du SNY tamponné à 0,1 % et une solution diluée de bleu de méthylène neuf ou NMB selon un rapport volumétrique de deux pour un. Veuillez vous référer au protocole écrit d'accompagnement pour plus de détails sur la préparation des solutions de SNY et de bleu de méthylène pum. Puis, dans un bécher en polypropylène, mélangez le réactif de coloration ACOA avec l'échantillon de sang total selon un rapport volumétrique de un pour un, en utilisant un agitateur magnétique pendant deux minutes. Incubez ensuite pendant 10 minutes supplémentaires à température ambiante après que la solution ait été incubée avec 1,99 millilitre de solution liquide classique RPMI 1640 dans un tube en polypropylène de cinq millilitres.Ensuite, transférez 10 microlitres de solution sanguine colorée dans du RPMI afin d'obtenir un rapport volumétrique de un à 200. Vortexez ensuite la solution pendant 30 secondes, puis pipetez de 10 à 100 microlitres de la solution de cellules colorées entre des lamelles ou à l'intérieur d'un réservoir microfluidique. Puis, à l'aide d'un stylo à vide, placez l'échantillon sur la région active du réseau de capteurs.La plateforme Lucas utilise un réseau de capteurs optoélectroniques pour enregistrer numériquement des hologrammes de cellules sans support. À cette fin, des dispositifs à couplage de charge, ou CCD, sont utilisés afin de permettre une illumination à longueur d'onde réglable, un monochromateur équipé d'une lampe au xénon ainsi qu'une fibre de silice fondue de qualité standard, constituée d'un faisceau de fibres et d'un diaphragme d'environ 100 micromètres de diamètre situé à environ cinq à dix centimètres au-dessus de la surface du capteur, peut être utilisée pour une longueur d'onde réglable. L'illumination fournit une plateforme souple où les signatures holographiques des cellules peuvent être finement ajustées, et où des signatures numériques hybrides peuvent être synthétisées en combinant plusieurs longueurs d'onde afin d'améliorer le rapport signal sur bruit et le contraste de l'image Lucas.Pour une meilleure caractérisation, des échantillons de précision placés entre deux lamelles sont chargés sur la zone active du réseau de capteurs, uniformément éclairée par la source lumineuse. Les hologrammes de diffraction de chaque cellule ou micro-objet présents dans une solution hétérogène se projettent sur le réseau de capteurs, formant une image Lucas. Les images de diffraction Lucas ainsi obtenues sont traitées par un algorithme décisionnel sur mesure, qui utilise une bibliothèque statistique d'images de diffraction pour la caractérisation et l'identification automatisées des cellules cibles ou des micro-objets.Cette figure montre une image conventionnelle avec un objectif de 40 x d'une solution hétérogène composée de microbilles de polystyrène de cinq, dix et vingt micromètres, ainsi que de globules rouges. La morphologie 3D, l'indice de réfraction et la complexité intercomp. de ces particules sont toutes différentes les unes des autres.Certaines de ces caractéristiques peuvent être distinguées au microscope conventionnel, mais sur un champ de vision très limité de moins de 0,5 millimètre carré sur la plateforme Lucas. Toutes ces microparticules présentent des motifs holographiques uniques, semblables à des empreintes digitales. Elles peuvent donc être caractérisées sans aucune ambiguïté à partir de leurs textures en 2D.Lucas peut surveiller un champ de vision ultra large qui peut atteindre une taille de 10 à 20 centimètres carrés. Des ordres de grandeur supérieurs à ceux des microscopes standards à lentilles. Il s'agit d'une image obtenue avec un objectif 40 x d'un échantillon de sang total coloré, utilisant la plateforme Lucas.Les caractéristiques internes des globules blanc colorés varient efficacement en modifiant l'indice de réfraction et les propriétés de diffusion des noyaux cellulaires. Des motifs de diffraction distincts pour chaque cellule individuelle sont enregistrés par le réseau de capteurs. Cela illustre un autre avantage de la plateforme Lucas en tant qu'outil puissant pour la cytométrie et les diagnostics au point d'intervention.En tant que plateforme entièrement automatisée permettant la caractérisation rapide de cellules d'intérêt, les images de diffraction Lucas sont traitées numériquement à l'aide d'un logiciel décisionnel sur mesure. Sur cette figure, un mélange hétérogène de globules rouges et de microbilles est analysé par l'interface. L'algorithme est robuste pour détecter les régions à haute densité ainsi que les particules présentant un faible rapport signal sur bruit, comme les billes de trois micromètres.Une image traitée dans l'interface personnalisée Lucas est présentée ici. Le logiciel permet de saisir diverses spécifications, telles que la taille des pixels du capteur ou la longueur d'onde de l'illumination. De plus, des sélections de l'image peuvent être effectuées et des motifs cellulaires peuvent être définis.L'échantillon est compté à partir de ces données et l'image marquée est affichée à l'utilisateur. Nous venons de vous montrer comment imager et caractériser des cellules à l'aide de la plateforme à haut débit de Lucas. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les expériences démontrées peuvent être appliquées à une grande variété de cellules et de microparticules.Il permet également une caractérisation cellulaire à haut débit et sur un champ ultra-large d'une solution hétérogène. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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