Lensless sur puce imagerie de cellules fournit un nouvel outil pour le haut débit de biologie cellulaire et le diagnostic médical

Dans cette vidéo, on démontre le principe de fonctionnement d'une imagerie sur puce utilisant une liste de lentilles appelée Lucas. Lucas est l'acronyme de « lens list ultra wide field of view cell monitoring array platform based on shadow imaging ». Contrairement aux dispositifs d'imagerie classiques, la plateforme Lucas ne nécessite aucun objectif de microscope ni aucun autre composant optique encombrant.

Pour Lucas, l'échantillon d'intérêt est placé sur une lame de microscope et délicatement pris en sandwich par un couvre-objet identique. À l'aide d'un stylo à vide, l'échantillon est chargé sur la zone active du réseau de capteurs optoélectroniques. La plateforme d'imagerie enregistre alors les ombres ou les hologrammes numériques en liste de lentilles de chaque cellule d'intérêt située dans son champ de vision.

Le traitement numérique automatisé de ces ombres cellulaires permet de déterminer le type, le nombre et les positions relatives des cellules présentes dans la solution. Le champ de vision peut atteindre jusqu'à 18 centimètres carrés, avec une profondeur de champ d'environ cinq millimètres. Les images de diffraction obtenues sont ensuite traitées numériquement par un algorithme décisionnel sur mesure, permettant à la fois la caractérisation et l'identification de cellules ou de particules cibles.

Lucas propose une plateforme miniaturisée qui réduit les coûts et augmente considérablement le débit pour les expériences basées sur l'imagerie, la rendant compatible avec les technologies avancées de pointe en microfluidique et en recherche biologique. Bonjour, je suis du laboratoire ROM Bio et Nano du département de génie électrique de l'Université de Californie à Los Angeles, et je suis Anthony Erlinger, également du laboratoire de nanophotonique et de biophotonique. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour l'imagerie à haut débit et sans lentille d'une solution d'acide nucléique hétérogène, telle qu'un échantillon de sang total.

Cette procédure dans notre laboratoire utilise une technique d'imagerie nouvelle, que nous appelons plateforme de surveillance d'arrays cellulaires à très grand champ basée sur l'imagerie par ombre, que nous abrégeons en Lucas. Commençons donc. Pour démarrer le processus, récupérez trois millilitres de sang total et des microbilles en polystyrène de différents diamètres, tels que cinq, 10 et 20 micromètres, puis portez-les à température ambiante pendant 30 minutes.

À l’aide d’une pipette serologique, ajoutez deux millilitres de milieu liquide classique RPMI 1640 comme diluant dans un tube en polypropylène stérile de cinq millilitres. Après une période de sédimentation de 30 minutes, prélèvez 10 microlitres d’échantillon d’érythrocytes depuis le fond du tube de prélèvement sanguin total et transférez-les dans la solution RPMI. Ajoutez un volume total de 20 microlitres de microbilles en polystyrène à la dilution d’érythrocytes dans le RPMI et agitez la solution cellulaire en pipetant doucement. Transférez cinq à 15 microlitres de la solution hétérogène sur un lamelle à l’aide de pinces.

Placer une deuxième lame de couverture identique sur la solution. L'échantillon doit être uniformément pris en sandwich entre les deux lames de couverture. Ensuite, à l'aide d'un stylo à vide, charger l'échantillon sur la région active du réseau de capteurs pour l'acquisition d'images.

Ensuite, préparez le réactif de coloration aqueux en combinant du SNY tamponné à 0,1 % et une solution diluée de bleu de méthylène neuf ou NMB selon un rapport volumétrique de deux pour un. Veuillez vous référer au protocole écrit d'accompagnement pour plus de détails sur la préparation des solutions de SNY et de bleu de méthylène pum. Puis, dans un bécher en polypropylène, mélangez le réactif de coloration ACOA avec l'échantillon de sang total selon un rapport volumétrique de un pour un, en utilisant un agitateur magnétique pendant deux minutes. Incubez ensuite pendant 10 minutes supplémentaires à température ambiante après que la solution ait été incubée avec 1,99 millilitre de solution liquide classique RPMI 1640 dans un tube en polypropylène de cinq millilitres.

Ensuite, transférez 10 microlitres de solution sanguine colorée dans du RPMI afin d'obtenir un rapport volumétrique de un à 200. Vortexez ensuite la solution pendant 30 secondes, puis pipetez de 10 à 100 microlitres de la solution de cellules colorées entre des lamelles ou à l'intérieur d'un réservoir microfluidique. Puis, à l'aide d'un stylo à vide, placez l'échantillon sur la région active du réseau de capteurs.

La plateforme Lucas utilise un réseau de capteurs optoélectroniques pour enregistrer numériquement des hologrammes de cellules sans support. À cette fin, des dispositifs à couplage de charge, ou CCD, sont utilisés afin de permettre une illumination à longueur d'onde réglable, un monochromateur équipé d'une lampe au xénon ainsi qu'une fibre de silice fondue de qualité standard, constituée d'un faisceau de fibres et d'un diaphragme d'environ 100 micromètres de diamètre situé à environ cinq à dix centimètres au-dessus de la surface du capteur, peut être utilisée pour une longueur d'onde réglable. L'illumination fournit une plateforme souple où les signatures holographiques des cellules peuvent être finement ajustées, et où des signatures numériques hybrides peuvent être synthétisées en combinant plusieurs longueurs d'onde afin d'améliorer le rapport signal sur bruit et le contraste de l'image Lucas.

Pour une meilleure caractérisation, des échantillons de précision placés entre deux lamelles sont chargés sur la zone active du réseau de capteurs, uniformément éclairée par la source lumineuse. Les hologrammes de diffraction de chaque cellule ou micro-objet présents dans une solution hétérogène se projettent sur le réseau de capteurs, formant une image Lucas. Les images de diffraction Lucas ainsi obtenues sont traitées par un algorithme décisionnel sur mesure, qui utilise une bibliothèque statistique d'images de diffraction pour la caractérisation et l'identification automatisées des cellules cibles ou des micro-objets.

Cette figure montre une image conventionnelle avec un objectif de 40 x d'une solution hétérogène composée de microbilles de polystyrène de cinq, dix et vingt micromètres, ainsi que de globules rouges. La morphologie 3D, l'indice de réfraction et la complexité intercomp. de ces particules sont toutes différentes les unes des autres.

Certaines de ces caractéristiques peuvent être distinguées au microscope conventionnel, mais sur un champ de vision très limité de moins de 0,5 millimètre carré sur la plateforme Lucas. Toutes ces microparticules présentent des motifs holographiques uniques, semblables à des empreintes digitales. Elles peuvent donc être caractérisées sans aucune ambiguïté à partir de leurs textures en 2D.

Lucas peut surveiller un champ de vision ultra large qui peut atteindre une taille de 10 à 20 centimètres carrés. Des ordres de grandeur supérieurs à ceux des microscopes standards à lentilles. Il s'agit d'une image obtenue avec un objectif 40 x d'un échantillon de sang total coloré, utilisant la plateforme Lucas.

Les caractéristiques internes des globules blanc colorés varient efficacement en modifiant l'indice de réfraction et les propriétés de diffusion des noyaux cellulaires. Des motifs de diffraction distincts pour chaque cellule individuelle sont enregistrés par le réseau de capteurs. Cela illustre un autre avantage de la plateforme Lucas en tant qu'outil puissant pour la cytométrie et les diagnostics au point d'intervention.

En tant que plateforme entièrement automatisée permettant la caractérisation rapide de cellules d'intérêt, les images de diffraction Lucas sont traitées numériquement à l'aide d'un logiciel décisionnel sur mesure. Sur cette figure, un mélange hétérogène de globules rouges et de microbilles est analysé par l'interface. L'algorithme est robuste pour détecter les régions à haute densité ainsi que les particules présentant un faible rapport signal sur bruit, comme les billes de trois micromètres.

Une image traitée dans l'interface personnalisée Lucas est présentée ici. Le logiciel permet de saisir diverses spécifications, telles que la taille des pixels du capteur ou la longueur d'onde de l'illumination. De plus, des sélections de l'image peuvent être effectuées et des motifs cellulaires peuvent être définis.

L'échantillon est compté à partir de ces données et l'image marquée est affichée à l'utilisateur. Nous venons de vous montrer comment imager et caractériser des cellules à l'aide de la plateforme à haut débit de Lucas. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les expériences démontrées peuvent être appliquées à une grande variété de cellules et de microparticules.

Il permet également une caractérisation cellulaire à haut débit et sur un champ ultra-large d'une solution hétérogène. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.